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Résonance Magnétique nucléaire

appliquée aux protéines

Introduction à la RMN

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Historique de la RMN

Prix Nobel

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Avancées technologiques

Sensibilité = accès à des composés peu abondants

Résolution = accès à des systèmes plus complexes (m étabolome, grosses protéines…)

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Applications

RMN HR MAS : high resolution magic angle spinning

IRM

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RMN liquide à haute résolution

1. Calcul de structures 3D des protéines à partir des contraintes de distances � Etudes de protéines non structurées

2. Cartographie d’interactions (bio)moléculaires et quantification, criblage bas débit

3. Etudes de modifications post-traductionnelles (identification de sites, cinétiques…)

� protéomique ?

4. ‘Metabolomics’ � identification/quantification de métabolites

5. ‘In cell NMR’ � RMN in vivo

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Données structurales obtenues par RMN déposées

dans la PDB

1997

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Données structurales obtenues par RMN déposées

dans la PDB

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Interprétation de l’information structurale

� Cristallographie par rayons X / RMN : deux techniqu es complémentaires

• RX : les rayons X sont diffractés par le nuage électronique des atomes constituant la protéine (90% des structures de la PDB)

� fournit une carte de densité électronique

� pas de limite en taille de protéine, limite=obtention de cristaux qui diffractent correctement

� données à l’état solide (cristallin) = statique

• RMN : mesure les interactions entre les noyaux des atomes (9% des structure de la PDB)

� fournit un ensemble de distances entre les noyaux atomiques c’est-à-dire les contacts avec ou sans liaisons chimiques

� limitée aux petites protéines (< env. 200 aa)

� données en solution = étude de la flexibilité et de la dynamique sur une large gamme d’échelle de temps, criblage de ligands

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Nature des informations structurales

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Détermination de structures de protéines

par RMN

Ensemble de structures 3D (les 20 conformères de plus

basse énergie)

Données RMN : NOESY � Contraintes de distances

interatomiques

Vérification de la structure (RMSD,

données biologiques, chimiques…)

Spectromètre RMN à haut champ (600, 800, 900 MHz)

Échantillon de protéine enrichi en 15N/13C

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Spectromètre RMN

sonde

Il faut injecter 200A de courant dans la bobine pour créer un champ magnétique de 18,6 tesla.

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Sondes

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Shims : correction des inhomogénéités du champ B0

100 Hz

10 Hz

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Lock : correction des dérives B0/B1 au cours des

expériences RMN

lock interne : on mesure le signal du deutérium du solvant

� un canal correspondant à la résonance du 2D émet en continu pendant toute la durée de l’expérience

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Spin nucléaire et moment magnétique

sans B o avec B o (par exemple : 600 MHz)

noyau des atomes 1H ou 15N ou 13C

Spin nucléaire = 1/2

2 états énergétiques : parallèle (α) et anti-parallèle (β) au champ B0

les spins prennent (2I+1) orientations définies

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B0

B0=0

Fréquence de résonance

différence d’énergie ∆E entre les 2 états� proportionnelle au champ B0

� différence de populations entre les 2 niveaux faibles � sensibilité de la RMN

faible

� proportionnelle à γ

distribution de Boltzman n = e -E/kT

k → constante de Boltzman (1,3805.10-23 J.K-1)

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Remarque

Le champ magnétique d’un aimant s’exprime en Tesla

� parler de spectromètre 500 MHz est un abus de langage, en fait 500 MHz est la fréquence de résonance du proton pour ce spectromètre (= 11,7 T)

� les autres noyaux ont une fréquence de résonance différente de 500 MHz

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Spectre électromagnétique

B0 = 9.4T soit 400 MHz

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Rapport gyromagnétique γ

� valeur propre à chaque noyau : relative à la force de l’aimantation nucléaire

Noyau Spin Net γ / 2π (MHz/T)abondance naturelle

sensibilité relative en abondance naturelle

1H 1/2 42,58 99.98% 1 000 00019F 1/2 40,08 100% 833 05031P 1/2 17,25 100% 66 61013C 1/2 10,71 1.11% 17015N 1/2 -4,31 0.37% 4

pas de marquage isotopique

marquage isotopique nécessaire

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Fréquence de résonance

νννν0 = ω0/2ππππ = γγγγB0/2ππππ

fréquence de précession mesurée par NMR

Boz

x

y

M

équation de Larmor : ω0 = γB0

Pour 1 spin : Pour plusieurs spins :

Σ

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Fréquence de résonance

impulsion B1 (radiofréquences)

90°x

B1 on

temps τ

B1 off

Rotation autour de B 1 (axe x)impulsion 90°

Précession autour de B o (axe z)

Bo

z

x

y

M

M

Bo

z

x

y

MBo

z

x

yB1

ω0

ω0

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ν0 fréquences

FID (signal brut)

détection axe y

FT (transformée de Fourier)

� retour à l’état d’équilibre = relaxation

rotation autour de l’axe de B0 à la fréquence ν0 (précession de Larmor)

Bo

z

x

y

M

B0

FID (Free Induction Decay)

Largeur de raie : proportionnelle à

l'inverse de la durée de l'état excité

Fréquence de résonance

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Notions de spin nucléaire et de fréquence de

résonance

� tous les noyaux (par ex 1H) devraient résonner à la même fréquence ν0

� mais ce n’est (heureusement) pas le cas! � le champ magnétique perçu par un atome donné va subir des variations à cause du mouvement des électrons : chaque noyaux va résonner à une fréquence propre qui va dépendre de son environnement chimique (distribution locale du nuage électronique)

� on parle alors de déplacement chimique δ

δδδδ

FT

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Phénomènes de relaxation : 2 types de relaxation

Mz (t) = M0 (1 - e -t/T1)

� relaxation longitudinale ou relaxation spin-réseau (T1) : retour sur l’axe B0 (axe z)

• proportionnelle au champ magnétique B0

• croissance exponentielle en fonction du temps de la composante Mz

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Mxy (t) = M0 e -t/T2

� relaxation transversale ou relaxation spin-spin (T2) : défocalisation de l’aimantation (dans le plan xOy) ou perte de cohérence de phase des moments magnétiques dans leur mouvement de rotation autour de B0

• indépendante du champ magnétique B0

• décroissance exponentielle en fonction du temps de la composante Mxy

De manière générale, plus une protéine est grande, plus le T2 est court.

Les protéines relaxent plus vite que les petites molécules

Phénomènes de relaxation : 2 types de relaxation

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Elargissement du signal par la relaxation T2 à l’origine

de la limitation de la RMN aux petites protéines

la largeur de raie à mi-hauteur ∆ν1/2 est inversement proportionnelle à T2*

� plus une protéine est grande, plus sa relaxation est rapide et plus les raies sont larges

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Déplacement chimique δ (ppm)

� une fréquence va dépendre du champ magnétique B0

� on va plutôt utiliser une valeur indépendante de B0 : le déplacement chimique (δ) exprimé en ppm (parties par million) � on utilise une référence

� pour un proton donné, on aura une même valeur de déplacement chimique quelque soit la valeur du champ magnétique B0 utilisé

δδδδ

δ = ν – νref

νref

106.

NH, H aromatiques H aliphatiques

référence

H2O

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Références

� blindage fort des méthyles dû au Si

� chimiquement inerte

� 1 résonance unique (protons équivalents)

� cela revient à fixer arbitrairement le déplacement chimique de ces composés à 0 (δ = 0 ppm)

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Evolution d’un spectre en fonction de B0 : résolution

spectrale

@ 200 MHz

@ 600 MHz

ppm0

TMSP (réf)

0 Hz

0 Hz

4008001200

246

120024003600

10

6000

2000

Augmentation de la résolution des résonances

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Evolution d’un spectre en fonction de B0 : résolution

spectrale

� « dilatation » de l’échelle avec l’augmentation du champ B0

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Interprétation d’un spectre RMN : 3 informations

référence = triméthylsilane

Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH

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1. Fréquences de résonance (en Hz) ou déplacements

chimiques δ (en ppm)

liaisons H, solvant…

• l'environnement électronique modifie la valeur du champ magnétique local Beff expérimenté par le noyau

Beff = B0 (1 - σ) où σ est la constante d'écran

et donc la fréquence de résonance ν du noyau sera

• le déplacement chimique dépend donc de l'environnement local de chaque noyau (groupements fonctionnels…)

ν = γBeff

2π

TMS

δ (ppm) δ0

écran faible

déblindage

écran fort

blindage

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Contribution diamagnétique à la constante d’écran :

effet inductif

Plus X est électronégatif, plus l’effet est important.

L’effet diminue avec la distance

� circulation des électrons à l’intérieur des orbitales atomiques ou moléculaires

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Contribution paramagnétique à la constante d’écran :

effet mésomère

� circulation des électrons entre les orbitales

accepteur

donneur

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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement

chimique

toute liaison chimique est anisotrope dans l’espace

� dans un champ magnétique, elle crée autour d’elle un champ magnétique anisotrope (Blocal)

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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement

chimique

blindage déblindage

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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement

chimique : courant de cycles

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Deux types de couplage

� Couplage direct ou dipolaire

Le couplage dipolaire est l’interaction directe entre les dipôles magnétiques à travers l’espace. Ce couplage est très élevé : 30 kHz pour 2 noyaux distants de 2Å. Son intensité étant inversement proportionnelle au cube de la distance entre les noyaux.

� moyenné à 0 en RMN liquide du fait de l’agitation moléculaire

Elle devient prépondérante dans les solides et conduit à une distribution large de déplacements chimiques qui élargit les raies.

� paramètre important en RMN solide � largeur importante des raies

� Couplage indirect ou scalaire

Interactions entre les noyaux (moments magnétiques nucléaires) et les électrons (spins électroniques) des liaisons covalentes

Lorsque les spectres RMN sont obtenus avec une résolution suffisante, on observe que certains signaux sont constitués de plusieurs pics.

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Couplages scalaires

On appelle système de spins un ensemble de spins couplés de façon scalaire.

• hétéronucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de nature différente (par exemple 1H et 13C). Il s'agit de couplage 1J

• homonucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de même nature (par exemple des protons) il s'agit de couplages nJ avec n > 1

Couplage Nombre de liaisons

Nom

2J 2 géminal3J 3 vicinal4J 4 longue

distance

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Structure fine des raies : couplages J (Hz)

Couplage � (2n I + 1) pics

où n est le nombre de noyaux équivalents

Pour I = 1/2 (1H, 13C, 15N)

� (n+1) pics pour ces noyaux Configuration Peak Ratios

A 1

AB 1:1

AB2 1:2:1

AB3 1:3:3:1

AB4 1:4:6:4:1

AB5 1:5:10:10:5:1

AB6…

1:6:15:20:15:6:1…

Couplage � (2n I + 1)x (2n’I+1) pics pour n et n’ noyaux équivalents

ABnXn’ (n+1)(n’+1) pics

JAB (Hz)

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Constantes de couplages 1H-1H représentatives (en Hz)

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Constantes de couplages représentatives (en Hz)

Couplages hétéronucléaires dans les chaînes polypeptidiques

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Intégration des signaux : aspects quantitatifs

• l’intégration relatives des pics permet, dans certains cas, de déterminer le nombre de noyaux contribuant à chaque signal

CH3CH2OH

1/6H2/6H

3/6H

6H

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Intégration des signaux : aspects quantitatifs

• l’intégration relatives des pics permet, dans certains cas, de déterminer le nombre de noyaux contribuant à chaque signal

le temps de relaxation doit être suffisant (retour complet à l’état d’équilibre entre chaque scan)

� Acquisition + D1 > 2 x T1 pour une bonne estimation

� Acquisition + D1 > 5 x T1 pour un résultat précis

• cela pose un problème de durée d’expérience pour les noyaux qui relaxent lentement (13C)

� en RMN 13C : aire des signaux non quantitative (effet NOE, valence)

� intensités relatives : C IV < C III (CH) < CII (CH2) < C I (CH3)

� intégration possible pour les signaux 13C de même substitution

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Aspect quantitatif (intégration des signaux) : délai de

répétition

Conditions quantitatives :

• temps de relaxation long (> 5*T1)

• impulsion < 90°: excitation uniforme sur une gamme de fréquence supérieure

x nsns= nombre de scans