Introduction aux analyses biologiques

Sylvain LORICLaboratoire de Biochimie et de Génétique

Hôpital Henri MondorOctobre 2006

DCEM 1 Biochimie 2006-2007Informations pratiques

Cours N°1 : mardi 10 octobre, 17h30 – 19h30présentation de l ’enseignement , généralités sur la biochimie clinique S. Loric

Cours N°2: mardi 24 octobre, 17h30-19h30marqueurs biochimiques des maladies cardiovasculaires S. Loric

Cours N°3: mardi 7 novembre, 17h30-19h30Protéines sériques: inflammation et bilan martial S. Mouterau

Cours N°4: mardi 21 novembre, 17h30-19h3Méthodes d’étude des protéinuries S. Moutereau

Cours N°5: mardi 12 décembreMarqueurs tumoraux S. Loric

Cours N°6: mardi 16 janvierGaz du sang S. Loric

• cours on line = documents de référence • validation : Check-list d’un certain nombre de QCMs• éventuelle session orale de rattrapage

AMBRIO

http://ambrio.ifrance.com

Mot de passehmn_P1hmn_P2hmn_D1

Qu’est-ce qu’une analyse biologique ?

• analyse effectuée à partir d'un élément biologique : du sang, des urines, de la sueur, de la salive, des matières fécales, etc. ..

• code de la santé : Article L6222-2« Les analyses de biologie médicale sont les examens biologiques qui concourent au diagnostic, au traitement ou à la prévention des maladies humaines ou qui font apparaître toute autre modification de l'état physiologique [..].

Qui l’effectue ?

• code de la santé et loi de 1975:– « Les analyses ne peuvent être effectuées que dans des laboratoires d'analyses

de biologie médicale (LABM) sous la responsabilité de leurs directeurs ou directeurs adjoints »

• des dérogations :– tests effectués par le médecin au cabinet, mais pas de contrôle de qualité ni de

remboursement,– tests faits au lit du malade par le personnel infirmier (Article L6211-8), tests à

lecture rapide (bandelettes)– Examens pratiqués dans les CHG et CHU où la biologie est considérée comme hors

monopole (Article L621-3): gaz du sang réalisés par un pneumologue….

Le plateau médico-technique (PMT)à Henri Mondor

• services d’imagerie (Radiologie, IRM, scanners, endoscopie, échographie, etc..) ,

• services de biologie:– Biochimie – Génétique– Hématologie biologique– Bactériologie – Virologie – Hygiène– Parasitologie – Mycologie– Immunologie biologique– Pharmacie – Toxicologie– Anatomie et cytologie pathologiques– Histologie et embryologie– Transfusion sanguine

Le Plateau Médico Technique

IMMUNO

BIOCHIMIE

ANAPATH

BACTERIO

PARASITO

HEMATO

TOXICO

EXPLO

Mon bureau..

Utilisation des tests biologiques

Milieux biologiques utilisés

• en nombre restreint pour les analyses «courantes» :

– sang : plasma, sérum ou éléments figurés

– sang artériel : gaz du sang

– sang capillaire: glycémie

– urines : échantillon ou recueil pendant une durée déterminée

– liquide céphalo rachidien : LCR

– liquides divers : synovial, pleural, ascitique, pancréatique, etc.

– calculs rénaux

Tous les échantillons biologiques doivent être considérés comme potentiellement dangereux et traités en conséquence

(port de gants)

Biochimie clinique : quelques caractéristiques

• paramètres dosés « en routine» peu nombreux :

– environ 50 paramètres biologiques représentent 80% de l ’activité d ’un laboratoire,

– environ 22 paramètres dits d«Urgence»

– Tous ces tests doivent être sensibles et spécifiques,

Le laboratoire d’urgences:24h /24,

365 jours par an

• les tests urgents:

• électrolytes (Na+, K+, Ca2+),

• substrats: glucose, urée, créatinine

• enzymes : lipase, amylase, transaminases,

• marqueurs cardiaques: Troponine, BNP

• βHCG• gaz du sang

• spécifique

– rapport des concentrations tissulaires vs sang important

– présent uniquement dans un tissu (si possible !)

• sensible

– taux de base faible ou nul (troponine)

– libération immédiate

Le marqueur idéal…

Spécificité et sensibilité

• Un test 100% sensible donne des résultats positifs chez tous les patients malades:

Vrais positifs

Sensibilité =

Vrais positifs + Faux négatifs

• Un test 100% spécifique donne des résultats négatifs chez tous les patients sains:

Vrais négatifs

Spécificité =

Vrais négatifs + Faux positifs

Sensibilité et spécificité

b+da + c

Vrai négatif: dFaux négatif: cTest négatif

Faux positif : bVrai positif: aTest positif

Maladie absenteMaladie présente

Sensibilité = probabilité d’avoir un test positif quand on est

malade: = a/(a+c)

Spécificité = probabilité d’avoir un test négatif quand on n’est

pas malade: d/(b+d)

PPV: probabilité qu’un patient ayant un test positifprésente la maladie pour laquelle le test a étédéveloppé (TP/TP+FP)Elle dépend de la prévalence de la maladie

NPV: probabilité qu’un patient ayant un test négatifne fasse pas la maladie (TN/TN+FN)

Sensibilité: proportion de patients positifsayant la maladie (TP/TP+FN)

Spécificité: proportion de patients négatifsindemnes de maladie (TN/TN+ FP)

Les critères pour évaluer un bon marqueur

PSA and PAP in Differentiating Prostate Cancer from BPH and Prostatitis

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

False-Positive Rate (1-Specificity)

Tru

e-P

ositi

ve R

ate

(Sen

sitiv

ity)

PSA (ug/L)

PAP (U/L)

0.2

0.30.4

0.60.81.2

124

6

10

20

Receiver Operating Characteristic(ROC) Curve

Mesure les performances d’un test sur une large étendue de valeurs. Permet de définir un seuil qui offre le meilleur compromis spécificité/sensibilité

Compare les performances de différents marqueurs entre eux

• prédictif

– longue demi vie dans le sang (suivi du processus pathologique)

– libération proportionnelle à l’étendue de la lésion

• facile à analyser

– analyse rapide, simple, juste dans les tissus habituels (sang, urines, LCR),

• peu ou non-invasif et d’un coût “abordable”

Le marqueur idéal…

Des tests biologiques:

pourquoi faire ?

Des tests biologiques: pourquoi faire ?

• diagnostic:– confirmation ou non d’une anomalie biologique liée à un diagnostic,– aide à l’établissement du diagnostic,

• surveillance et traitement:– suivi de la maladie, des effets du traitement ou des complications,

• pronostic:– suivi de la créatinine sanguine chez des patients insuffisants rénaux,– risques d’IDM liés aux taux élevés de cholestérol,

• screening:– dépistage de la phénylcétonurie ou de la drépanocytose chez les nouveaux

nés.

Guide des examenshttp://ww2.hmn.ap

hp.fr

Combien ça coûte ?Nomenclature des actes de Biologie Médicale (NABM)

Lettre clé B = 0,27 €

Cholestérol = B5 x 0,27 = 1,35 €

EAL = B55 x 0,27 = 14,85 €

Le cycle de vie de l’analyse biologique

L’acte biologique comporte 3 étapes:

• l’étape pré-analytique* dans le service de soins* à l’intérieur du laboratoire

• l’étape analytique• réalisation pratique de l’analyse, • Contrôles,• élaboration d’un compte rendu

• l’étape post-analytique• communication des résultats, etc.

Du prélèvement au résultat:le temps consacré exprimé en pourcentage

Transmission

des résultats

3,7%

Post analytique

au laboratoire

13,6%

Phase analytique

25,1%

Pré analytique

à l’extérieur

du laboratoire

20,2 %

Pré analytique

au laboratoire

37,1 %

Les erreurs au laboratoire

Post analytique: 18,5%

Pré analytique: 68,2%

Analytique: 13,3 %

Plebani M. and Carraro P., Mistakes in a stat laboratory : types and frequency, Clinical Chemistry 43 :8 , 1348-1351 (1997)

Witte D.L., VanNess S. A., Angstadt D.S., and Pennell B.J., Errors, mistakes, blunders, outliers, or unaccepable results : how many ? Clinical Chemistry 43 :8 , 1352-1356 (1997)

Erreurs pré analytiques : 68,2 %

nom erroné 2,6%

erreur de tube 2,6%

prélèvement incorrect 2,6%

prescription mal interprétée 3,2 %

prescription erronée 18,1%

service erroné 19 %

contamination par la perfusion 20,2 %

Conséquences pour le patient

• sans conséquences 74 %

• investigations non nécessaires : biologie, échographie

radiologie, etc.. 19,6 %

• transfusions non nécessaires 2,2 %

• modification de l ’héparinémie 2,2 %

• perfusion non justifiée 1 %

• modification du traitement 1 %

– nominative,

– cohérente et non redondante,

– épaulée prochainement par des systèmes experts (prescription connectée):

• optimisation

• coût

• antécédents

– signée par le prescripteur.

La prescription médicale

Etiquette G ILDA à co ller ici Etiquette du serv ice à co ller ic i

HO PITAL HENRI M O NDO R 1234567890 0 1234567890 0

Laboratoire de B ioch im ie P r. M . G O O SSENS

Tél.:12853-16853 G arde: 16850 Prescrip teur :_______ ___________ Nom du préleveur :___________________Date: _ _ /_ _ / _ _

BIO CHIM IE G ENERALE Date: _ _ /_ _ / _ _ Signature :____________ Téléphone:____________ Heure du prélèvem ent:_________

Noircir les cases correspondant aux analyses dem andées :

0 NA, K Sodium , Potassium 0 CH Cholestéro l to tal 0 A1C

Cl Chlore 0 TG Trig lycérides

0 CO 2 B icarbonate Cholestéro l HDL

0 PR Protides 0 APO A Apolipoproté ines A1

0 UR Urée 0 APO B Apolipoproté ines B VO LUM E en m l:....................................

0 CR Créatin ine 0 LPA Lipop rotéine a : Lp(a) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 PAL Phosphatase Alcaline d l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 AS ASAT 0 O RO O rosom ucoïde cl 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 AL ALAT 0 HP Haptog lob ine

0 BIL B ilirub ines 0 PREA Préalbum ine PERIO DE DE REC UEIL :.........................

0 TC Tem pérature :_________°C 0 G G T G am m a G T 0 ALB Album ine M iction 3H

0 B2M ß2 m icrog lobu line 0 0

0 VSA V. spontanée Air Am biant 0 CK CK 0 AAT Alpha 1 antitrypsine

0 VSO V.s. en O 2: _____________ L /m n 0 TRO P Troponine Ic 0 CER Céru léop lasm ine 0 IO U

0 VTFI V. Assistée F iO 2:__________% 0 LDH LDH 0 CST3 Cystatine C 0 URU

0 LIPA Lipase 0 CRU

0 G AZ G az Artérie l 0 CRP Protéine C -réactive 0 FRKS Ferritine sérique 0 PRU

0 G AZV G az Veineux 0 AU Acide urique 0 FERT Fer sérique + transferrine +

0 LACTV Lactate (Sur g lace) capacité de fixation

0 DAV DAV 0 CA Calc ium 0 RTRF Récep. So l. T ransferrine 0 A1MU

0 SHUNT SHUNT 0 PH Phosphore 0 UALB

0 HBCO HbCO 0 G L G lucose 0 HCG ����-HCG (DDR:____________) 0 CST3U

0 SBE BE 0 AMY Am ylase 0 ELEC Electrophorèse des pro té ines

0 LACT Lactate

0 G K Potassium 0 LCR LCR (glucose + pro tides) 00 G NA Sodium 0 PLE Plèvre (g lucose + pro tides) 0 G LJ G lycém ie à jeun

0 G CA Calc ium Ion isé 0 PASC Ascite (g lucose + pro tides) 0 G LP G lycém ie post prand iale

0 G G LU G lucose 0 Autres 0 CG Epreuve g lycém ique (au verso)

préciser la nature de l'échantillon et l'analyse dem andée VO IR AU DO S

TUBE SEC PLASTIQ UE 5 m l

1 TUBE sec+gel 4 m L (bouchon O RANG E)

TUBE(S) NaF+oxalate 3 m l (bouchon G RIS)

TUBE ACD 6 m l (bouchon JAUNE CLAIR)

TUBE SEC PLASTIQ UE 5 m l

AUTRES PRESCRIPT IO NS

SANG veineux SANG veineux

AUTRES LIQ UIDES B IO LO G IQ UES

1 TUBE Hépar.L ith ium +gel (bouchon VERT 4 m L) 1 TUBE sec+gel 4 m L (bouchon O RANG E)

Seringue de 2 m l pour gaz du sang

TUBE SEC PLASTIQ UE 5 m l

���� URG ENCE ou G ARDE

���� Non urgent

URG ENCE V itale����

Sur les dem andes cochées "URG ENCE" ou en période de

G ARDE, seu ls les exam ens sur fond rouge seront traités.

SANG artérie l ou veineux

Ionocom plet

0

BHC0

BLIP

0

Axe de lecture Axe de lectureAxe de lecture

L’étape pré-analytique dans le service de soins

• Prélèvement:

– effectué par un personnel spécialisé (décret de compétence pour les infirmiers),

– certains actes sont réservés aux médecins (LCR, GdS),

– milieux divers: sang, urines, LCR, liquides de ponctions,

– identification et préparation du patient (par interrogation),

– choix du matériel de prélèvement : flaconnage, anticoagulants,

– prélèvement et son identification

Récipients non réutilisables pour prélèvements biologiques

• Les normes françaises homologuées NF S 90-241 (spécifications de base, août 1990) et NF S90-240 (récipients sous vide, décembre 1990), fixent :– les anticoagulants utilisés, – leur code, – leur utilisation,– la couleur du bouchon (lavande, noir, bleu pâle, gris, vert, vert pâle, rouge, etc.).

Erreurs pré-analytiquesdans les services de soins

• horaires ou périodes de recueil non précisés (pour les urines),

• identification du patient incomplète,

• identification du prescripteur et du préleveur insuffisante (nom, horaire, téléphone, fax, etc..),

• prélèvement insuffisant: néonatologie, pédiatrie,

• prélèvement coagulé, hémolysé (impossibilité de doser le potassium..),

• site de prélèvement non adapté : proche d’une perfusion,

• anticoagulants non adaptés,

• non respect des conditions d’envoi: température (lactates), délais, stockage prolongé avec diminution de la glycémie,

• etc…

Transmission au laboratoire

• pédestre (urgences)

• centre de tri

• pneumatique

• valisettes

• tortues

Pré-analytique au laboratoire

• contrôle de la cohérence du prélèvement : – volume, anticoagulant, prescription, etc.– l’identification du patient: nom et service

• attribution d’un numéro de travail

• enregistrement informatique

• pré-traitements éventuels– centrifugation pour obtention plasma ou sérum, – sang total (hémoglobine, Hb A1c, etc..),– aliquotage,– mise en place dans des portoirs spécifiques,– transfert pour analyse automatisée ou manuelle.

Analytique au laboratoire

Nombreuses méthodes d’analyse:

• dosage des ions (Na+, K+, Cl-, Ca2+) ou des gaz du sang (pO2, pCO2) par électrodes spécifiques,

• dosage des substrats :

– par colorimétrie,

– par réactions antigène-anticorps,

– par chromatographie: hémoglobines, hémoglobine A1c,

– par électrophorèse : électrophorèse des protéines plasmatiques,

– etc.

Plus de 1 300 tubes/jour, environ 950 patients dans l’hôpital

> automatisation des dosages et informatisation des données

Biologie délocalisée

Contrôle de qualité au laboratoire:ses buts

• Exactitude de mesure: étroitesse de l’accord entre le résultat d’une mesure et la valeur vraie du mesurande (ce que l’on veut mesurer)

• Justesse: qualité de l’accord entre la moyenne d’une série de mesures et la valeur vraie

• Répétabilité: étroitesse de l’accord entre les résultats des mesurages successifs d’un même mésurande effectués dans les mêmes conditions de mesure

• Reproductibilité: qualité de l’accord entre des mesurages répétés du même spécimen dans des conditions qui peuvent varier.

Exactitude de mesure = X

Justesse = XXX

Répétabilité ou Reproductibilité

CV %

xx

xx

x

Justesse et répétabilité

Justesse : bonne /mauvaise

Répétabilité : bonne / mauvaise

Justesse : bonne /mauvaise

Répétabilité : bonne / mauvaise

Pas d’erreur systématique

Justesse : bonne /mauvaise

Répétabilité : bonne / mauvaise

Validation biologique des résultats

• la validation biologique est obligatoire (les résultats doivent être signés…)

• elle comporte :– le contrôle de cohérence, – les effets du délai de conservation (diminution du glucose dans le temps) – les effets de l’hémolyse (libération du K+ et des enzymes du GR),– les antécédents (résultats cumulatifs),– l’incidence du service clinique (néphrologie, cardiologie, urgences, etc.),– le traitement éventuel.

Validation biologique

• elle ne prend pas en compte (sauf démarche particulière) :

– les variations biologiques : sexe, age, etc..

– les variations nycthémérales : heure du prélèvement,

– le stress et anxiété,

– la position et l’exercice.

Le compte rendu

• édition d’un résultat signé qui doit comporter:

– l’identification du patient et du service clinique,

– la nature du paramètre et le milieu,

– les valeurs « habituelles « (normales ),

– les unités utilisées, l’unité (système SI),

– les valeurs du patient,

– éventuellement :• les valeurs précédentes (résultat cumulatif),• les valeurs habituelles selon le sexe ou l’âge,• l’indication de la technique utilisée.

• transmission des résultats et le respect de la confidentialité:– le résultat « papier » est le seul légal,– transmission par fax ou par téléphone (INTERDIT) – par serveur des résultats (toléré).

Système SI

sauf pour les enzymes

mmol/l

mEq/l

g/l

UI

ng/ml

mg/l

système SI : des exceptions

• masse connue avec précision = mmol/l• temps: seconde (symbole = s),• activités enzymatiques :

– exprimées en UI/l = quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par minute dans des conditions optimales de concentration en substrat, de pH et à une température définie.

– unité SI = katal (quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par seconde dans des conditions optimales…),

• protéines : exprimées en g/l si on ne connaît pas le poids moléculaire ou éventuellement en mEq/l,

• pH : souvent exprimé en unités pH et non en concentration d’hydrogène en mmol/L

• hémoglobine : exprimée en g/dl et non en g/l.• etc., etc.

L’expression des résultats

• le compte rendu n’informe pas sur :

– le contrôle de qualité:

• justesse ,

• reproductibilité,

– les incertitudes,

– les coefficients de variation,

– la sensibilité et la spécificité,

Arbre d’Ishikawa ou méthode des 5M

Résultat

de la

mesure

main d’oeuvre

habileté

expérience

milieu

pollution

hygrométrie

température

méthode

préparationsolutionsétalons

traitementdonnées

matrice

matière

homogénéitééchantillon

stabilitééchantillon

fidélité

dérive

justesse

instrumentsmesure

résolution

moyen

produitschimiques

exactitudesolutionsétalons

pureté

Analyses biologiques et incertitudes

Est-ce normal, Docteur ?

• les résultats sont-ils normaux ?

• sont-ils différents des résultats précédents ?

• sont-ils attendus ?

• sont-ils en accord avec la clinique ?

Est-ce normal, Docteur ?

• Le résultat est-il normal ?

– distribution Gaussienne

• 95% des valeurs sont comprises entre la moyenne et +/- 2 déviations standard

– valeurs : normales, de références, « habituelles »,

La distribution gaussienne

• 95% des valeurs sont comprises dans l’intervalle Moy +/- 2 ET

• 99,7 % valeurs sont comprises dans l’intervalle Moy +/- 3 ET

• nombreuses limitations:

• les valeurs ne sont pas « normales » mais « habituelles » ou de « référence »,

• certains paramètres n’ont pas une distribution gaussienne (Lpa),

Sensibilitéet

spécificitédestestsutilisés

Faux positifs et

Faux négatifs

Haute spécificité

mais

faible sensibilité

Haute sensibilité

mais

faible spécificité

Est-ce normal, Docteur ?

• le résultat est-il significativement différent des résultats précédents ?– résultats et incertitudes,– erreurs aléatoires et systématiques,– variations analytiques et variations biologiques,

• le résultat est-il attendu ?– compatibilité avec les données cliniques,– compatibilité avec le traitement, etc.

Variables préanalytiques

• demi-vie:

– Potassium: quelques minutes

– CRP: 2 à 4h

– ALAT, ASAT: 17h

– Albumine: 3 semaines

• stabilité à température ambiante

– glucose: 10 min

– cholestérol: 7 jours

• anticoagulants

• délais

Facteurs biologiques affectant l’interprétation des résultats

• sexe

• âge

• effet du jeûne:

– pourquoi être à jeun ?

• horaires

– cortisol

• stress et anxiété

• position du patient

• exercice:

– enzymes et marathon

• dossier médical

• grossesse

• cycle menstruel

• médicaments

Variation de certains analytes45 min après un marathon

1 X 2 X 3 X 4 X

bilirubine

glucose

créatine kinase

ASAT

urée

pyruvate kinase

albumine

calcium

acide urique

Le rythme circadien

La grossesse

• augmentation du volume plasmatique,

• hémodilution (protéines, albumine),

• induction enzymatique (PAL),

• augmentation des protéines de transport,

• accélération du processus métabolique,

• situation carentielle (fer, ferritine).

Le stress

• augmentation de la sécrétion d’hormones: rénine, aldostérone, angiotensine, prolactine, insuline, etc..

• éventuellement élévations de la concentration de l’albumine, du fibrinogène, du glucose, du lactate et du cholestérol…

Température et durée de stockage

4° C 23° C 30° C

Cinétique d’apparitiondes marqueurs cardiaques

Prescription, cinétique et redondance:vers une prescription juste ou raisonnée

• Fréquence des prescriptions

• Cinétique: Tni, marqueurs, BNP

• Redondance: bilan lipidique, A1c, protéines

• Variation analytique

• Variation biologique