Biologie Moleculaire-2017 1 http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/moleculaire/accueil.htm
Biologie Moleculaire-2017 2
DIRECTIVES GÉNÉRALES
1. La présence dans le laboratoire est obligatoire. S'il vous plaît, être à l'heure.
2. Des chaussures et vêtements appropriés doivent être portés en tout temps.
3. Laisser vos vêtements d'extérieur, sacs à dos, et toutes autres matières étrangères dans les
casiers à l'extérieur du laboratoire. Il est fortement recommandé que vous ayez un cadenas.
Nous ne sommes pas responsables pour les objets perdus ou volés.
4. Porter une blouse de laboratoire et des gants en tout temps quand vous travaillez dans le labo.
5. Enlever vos gants chaque fois que vous sortez du labo.
6. Enlever vos gants quand vous utilisez notre ou votre ordinateur.
7. Toujours placer les pipettes utilisées, les embouts, tubes de microcentrifuge et autres matériaux
dans les sacs biohazard fournis afin qu'ils puissent être éliminés de façon appropriée. Ne pas
jeter de déchets dans les sacs d'autoclaves.
8. Ne jamais se lécher les doigts, ou mettre vos doigts dans votre bouche.
9. Ne pas manger ou boire dans le laboratoire.
10. Pas de radios, lecteurs MP3, de lecteurs de CD dans le laboratoire.
11. Aucune utilisation des téléphones cellulaires ou des textos en laboratoire.
12. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout accident, même mineur.
13. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout bris ou malfonctionnement de l’équipement fourni.
Matériel que vous DEVEZ avoir pour travailler dans le laboratoire de microbiologie :
Une blouse de laboratoire
Un crayon-feutre à pointe fine permanent, de préférence noir, pour l'étiquetage.
Un cahier de notes pour enregistrer vos résultats. N'importe quel type est acceptable. Ne gaspillez
pas votre argent
Une clef A USB pour sauvegarder vos images
Une calculatrice. L’utilisation des calculatrices sur les cellulaires n’est pas permise.
Facultatif, mais fortement recommandé :
Aviser l'instructeur de tout problème médical de sorte que des accommodations appropriées
peuvent être prises. Par exemple, les allergies, le diabète, l'hypoglycémie, l'épilepsie, les blessures
apparentes, daltonisme, etc.
Aviser l'instructeur de tout besoin particulier dont vous pourriez avoir besoin de sorte que les
accommodations appropriées peuvent être prises. Par exemple, si vous écrivez vos examens avec
SASS.
Biologie Moleculaire-2017 3
Horaire
Introduction au labo de biologie moléculaire 11 janv.
Exercice 1 18 janv. Concentrations et dilutions
Isolation d’ADN plasmidique par lyse alcaline
Digestions par enzymes de restriction et électrophorèse sur gel d’agarose
Exercice 2 25 janv. Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant
Isolation d’ADN plasmidique avec Qiagen
Digestions par enzymes de restriction
Électrophorèse sur gel d’agarose
Cartographie de restriction d’un gène de la levure – Analyse Southern
Isolation d’ADN génomique
Digestions par enzymes de restriction d’ADN génomique
Électrophorèse sur gel d’agarose
Exercice 3 1 févr. Mutagenèse dirigée et clonage de GFP
Amplification et mutagenèse de GFP par PCR
Purification des réactions de PCR avec Qiaquick
Digestion des amplicons de PCR de GFP et du vecteur pUC19
Ligature des amplicons de GFP
Exercice 4 8 févr. Mutagenèse et clonage de GFP - Analyse des transformations
Compte de colonies
PCR de colonies
Digestion par enzyme de restriction des produits de la PCR de colonies
EXAMEN DE MI-SESSION (Exercices 1-4) 15 févr.
SEMAINE D’ÉTUDE 19-25 févr.
Biologie Moleculaire-2017 4
Exercice 5 1 mars Expression génique - Transcription
Isolation d’ARN de levure
Électrophorèse d’ARN
Principes de la RT-PCR
Exercice 6 8 mars Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure
RT-PCR
Analyse northern
Exercice 7 15 mars Empreintes génétiques
Isolation d’ADN génomique des cellules de joues
Amplification par PCR du VNTR ApoC2
Amplification par PCR du RFLP ApoB
Stringence – Profils de dénaturation d’ADN
Exercice 8 22 mars Expression protéique
Préparation d’extrait de protéines
Quantification des protéines - Essai Bradford
Électrophorèse sur gel des protéines
EXAMEN FINAL THÉORIQUE PÉRIODE D’EXAMENS FINAUX
Biologie Moleculaire-2017 5
Barème
Option I Option II
Quiz 5% + *Bonus 2% 5% + *Bonus 2%
Devoirs (X5) 15% 15%
Performance en labo 10% 10%
Mi-session 25% 15%
Final 45% 55%
Total 102% 102%
*Vous devez obtenir 100% sur au moins 4 des 8 quiz afin d’obtenir le boni
QUIZ
Chaque semaine, à partir de la semaine 2, il y aura un quiz disponible sur Blackboard le samedi
précédent la prochaine semaine de labo disponible de 9h-21h. Vous aurez 30 minutes pour
compléter le quiz. Ces quiz contribueront à 5% de votre note finale. De plus un bonus de 2% sera
ajouté sur la note finale de tout étudiant qui aura obtenu 100% sur au moins 4 des 8 quiz.
DEVOIRS
Devoirs recouvrant les procédures et les données générées ainsi que des exercices de
bioinformatiques associés. Les devoirs doivent être dactylographiés et peuvent être soumis
individuellement ou en groupe de deux (vous et votre coéquipier). Une pénalité de 10%/jour sera
imposée sur les devoirs en retard. (Les week-ends sont considérés comme un seul jour). Certaines
parties des devoirs doivent être soumises sur Blackboard, tandis que d’autres doivent être soumises
en tant que copies imprimées durant votre session de labo. Dans les deux cas, les soumissions
doivent être faites avant 17h la journée de votre labo.
DATES DE REMISES DES DEVOIRS
DEVOIR 1: LE 25 JANVIER
DEVOIR 2: LE 1 FÉVRIER
DEVOIR 3: LE 15 FÉVRIER
DEVOIR 4: LE 15 MARS
DEVOIR 5: LE 29 MARS
Biologie Moleculaire-2017 6
EXAMENS ÉCRITS
Tous les examens sont à livre ouvert. L'accès à l'internet sera permis pour les examens de mi-
session et final. Les ordinateurs portables NE SONT PAS permis. Vous devez utiliser les
ordinateurs du laboratoire.
Le format de l'examen de mi-session (2 heures) sera le suivant:
8 problèmes de calculs (12 points)
4 exercices de bioinfo (4 points)
4 questions théoriques sur la bioinfo et les procédures moléculaires (4 points)
2 sur 3 problèmes avec une emphase sur l'analyse de données et la conception expérimentale
(10 points)
Le format de l'examen final (3 heures) qui sera récapitulatif sera le suivant:
5 problèmes de calculs (10 points)
10 exercices de bioinfo (10 points)
5 questions théoriques sur la bioinfo et les procédures moléculaires (5 points)
3 sur 4 problèmes sur l'analyse de données et la conception expérimentale (15 points)
Biologie Moleculaire-2017 7
Exercice 1
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Concentrations et dilutions
Isolation d’ADN plasmidique par lyse alcaline
Digestions de restriction et électrophorèse sur gel d’agarose
Biologie Moleculaire-2017 8
Introduction aux concentrations Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration.
En général, la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une
solution. Pour travailler avec des concentrations vous devez tenir à l’esprit les distinctions entre le
soluté, le solvant et la solution.
Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration
est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment
concentrée est une solution. Une variété de différentes façons ont été développées pour calculer et
exprimer les concentrations des solutions.
Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les
deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les
composés chimiques réagissent entre eux (moles).
Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le
pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la
molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume.
Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution.
Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes
qui doivent être présentes dans la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une
solution préexistante. Si une solution est colorée, vous pouvez déterminer sa concentration en
mesurant l’intensité de la couleur par colorimétrie.
POURCENTAGE
L’utilisation des pourcentages est une façon commune pour exprimer la concentration d’une
solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les
pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une
façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par
volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride
appelé le pourcentage par poids/volume.
Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en
mélangeant deux liquides.
Par exemple, l’alcool à friction est habituellement
70% par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire
que 100mL de solution contient 70mL d’alcool
isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou
1000mL) de cette solution contient 700mL
d’alcool isopropyl et assez d’eau pour compléter le
volume à un total de 1 litre ou 1000mL.
Pourcentage par volume = volume du soluté
volume de solution x 100
Biologie Moleculaire-2017 9
Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le
poids du soluté/poids de la solution.
Pourcentage par poids = Poids du soluté
Poids de la solution x 100
À titre d’exemple, considérons une solution
de 12% NaCl par poids. Une telle solution
aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100
grammes de solution. Pour préparer une telle
solution, vous pourriez peser 12 grammes de
NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau,
afin que la masse totale de la solution soit de
100 grammes. Puisque les masses sont
conservées, les masses des composantes de
la solution s’additionneront à la masse totale
de la solution.
12 % NaCl solution = 12 g NaCl
100 g solution
12 g NaCl
(12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution
Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez
diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et
du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage.
Pourcentage par poids/volume
Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le
pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes, mais mesure la
quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle
contient 5g de NaCl pour chaque 100mL de solution.
Pourcentage par volume = Poids du soluté (en g)
Volume de solution (en mL) x 100
Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en
pourcentages.
Biologie Moleculaire-2017 10
MOLARITÉ
Une autre façon d’exprimer une concentration
s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre
de moles de soluté dissout dans un litre de
solution. Les unités sont donc moles par litre,
plus précisément, c’est les moles de soluté par
litre de solution.
Molarité = moles de soluté
litre de solution
Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation “M” est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous
voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous
devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la
quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante.
Alors quand un problème vous est donné, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1M,
ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est
0.1 mole.
POIDS/VOLUME
Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente
une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au
pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus
communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1mL
ou 1µL ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une
quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/mL
contient 1mg de soluté dans 1 mL de solution.
LES RAPPORTS
Toutes les façons décrites ci-dessus pour exprimer les concentrations se font en fonction du volume
de la solution qui est la somme du volume du soluté et du solvant. Une manière courante que
plusieurs biologistes et chimistes utilisent pour d’exprimer les concentrations est les rapports. Dans
ce cas-ci, la relation entre le soluté et le solvant est exprimée indépendamment de la solution. Par
exemple, nous pourrions dire que le rapport entre un soluté est un solvant est de 2 pour 1 avec la
notation 2 : 1. Ceci indique que pour deux parties du soluté il y a une partie du solvant. Donc, trois
parties total de solution!
Biologie Moleculaire-2017 11
Les dilutions et l’utilisation des micropipetteurs
Les dilutions : Savoir préparer des dilutions est essentiel pour la préparation de plusieurs réactifs, mélanges
réactionnels, et solutions utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire. Essentiellement, les
dilutions servent à réduire la concentration initiale du composé afin d’atteindre une nouvelle
concentration voulue. Les solutions préparées par l’entremise de dilutions peuvent être composées
d’un ou de plusieurs composés. Le nombre d’ingrédients dans la solution à être préparée
n’influence aucunement la formulation des dilutions. Un bref survol de la préparation des dilutions
est présenté ci-dessous. Assurez-vous de bien comprendre leurs préparations, car vous serez appelé
à les préparer tout au cours de la session ainsi que pour les examens.
La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le
facteur de dilution, et la dilution.
Une concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution.
Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons, les concentrations sont exprimées
comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final.
E.x. Gram/Litre
Molécules/Litre
Moles/Litre
Etc.
Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale
doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale désirée. Par exemple, si une solution contient
30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à
0.3 Grammes/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, ce qui représente le facteur
de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution.
Concentration finale Ce que je désire
La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème
précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1
sur le facteur de dilution. C.à.d. que la solution initiale est représentée comme une fraction de
l’original sur le total. Par exemple si vous avez déterminé qu’une dilution de 1/100 doit être
préparée, cela veut dire qu’un centième de la nouvelle solution doit être représenté par la solution
originale. Donc pour un volume total de disons 2mL, 0.02mL doit être représenté par la solution
originale.
Facteur de dilution = Concentration initiale
Concentration finale OU
Ce que j’ai
Ce que je veux
Biologie Moleculaire-2017 12
Préparer une solution qui requière la dilution de plus d’un ingrédient :
Le principe pour la formulation d’une solution qui nécessite la dilution de plus d’un composé est la
même que pour une solution avec seulement qu’une composante. La seule différence est le volume
de solvant qui doit être ajouté.
Disons par exemple que l’on désire préparer 10mL d’une solution de 0.1M à partir d’une solution
mère de 2M.
Pour calculer le facteur de dilution :
Donc la dilution requise est de 1/20; ce qui veut dire qu’un vingtième du total doit être représenté
par la solution originale.
Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la solution mère et compléter avec 9.5mL de
solvant.
Si la solution à préparer inclut une deuxième composante; disons que celle-ci doit être à une
concentration finale de 0.5 M et que la solution mère est de 3M.
Encore une fois pour calculer le facteur de dilution :
Donc la dilution requise est de 1/6. Ce qui veut dire qu’un sixième du total doit être représenté par
la solution originale.
Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la première solution, 1.7mL de la deuxième
solution et puis complété avec 7.8mL de solvant.
Si les explications ci-haut ne sont pas suffisantes, vous pouvez consulter le site web suivant :
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/HtmL/dilutions.htmL
Ce que j’ai
Ce que je veux =
2M
0.1M = 20
Ce que j’ai
Ce que je veux =
3M
0.5M = 6
Biologie Moleculaire-2017
13
Utilisation des micropipetteurs
Les micropipettes sont des outils indispensables dans les laboratoires de biologie moléculaire
modernes. Quelle est l’exactitude des vôtres? Quelles sont leurs précisions? Quelle est la différence
entre l’exactitude et la précision?
Dans le cas de l’exactitude, il s’agit de la performance comparativement à une valeur de référence.
Tandis que la précision est une indication, de la fiabilité ou la répétitivité est ne dépend pas
nécessairement d’une référence. Ces deux attributs sont indépendants l’un de l’autre. Il est possible
d’avoir un instrument qui est précisément inexact (ou exactement imprécis)!
Analogie d’une cible pour illustrer l’exactitude et la précision
Dans cet exemple, le centre de la cible représente la référence à laquelle l’exactitude est évaluée.
Afin d’évaluer de façon simultanée l’exactitude et la précision de vos pipettes vous devez faire des
mesures multiples afin de calculer le % d’erreur de la moyenne et l’écart type des mesures pour
chacune de pipettes.
Directives pour l’utilisation des micropipetteurs Gilson
Vous avez 4 micropipettes qui possèdent différentes capacités. La P-1000, la P-200, la P-20 et la P2.
Le numéro indique le volume maximal en microlitres qui peut être mesuré de façon exacte et précise.
Initialement, vous devrez déterminer quelle micropipette utiliser sous des circonstances données. Par
exemple, si vous devez transférer 0.18mL vous aurez probablement besoin de la P-200 puisque
0.18mL = 180µL, car la P-200 fera la mesure de ce volume avec une exactitude et une précision plus
grande que ne le ferait la P-1000.
Règles:
Toujours utiliser un embout jetable. La P-20 et la P-200 utilisent les plus petits embouts et la
P-1000 utilise les plus gros.
Ne jamais aspirer du liquide dans le baril blanc de la pipette.
Ne jamais déposer la pipette quand il y a du fluide dans l’embout. Le fluide pourrait
accidentellement se retrouver dans le baril.
Ne jamais tourner le réglage de volume au-dessus ou en dessous de l’étendue prévue.
Afin de maximiser la précision, toujours utilisez la pipette de plus petit volume qui
correspond au volume total donné.
1. Régler le volume désiré:
Ajustez le volume à un réglage légèrement plus élevé que celui désiré, et ensuite
retournez-le à celui désiré.
2. Placer un embout:
Pousser l’embout fermement avec une motion de torsion. L’embout doit créer un joint
étanche avec le baril de la pipette.
Exact & précis Précis & inexact Imprécis & inexact
Biologie Moleculaire-2017
14
3. Peser le piston jusqu’au premier arrêt.
4. Introduire l’embout dans le liquide que vous désirez transférer. Pas trop loin, juste un peu
sous la surface.
5. Lentement, relâchez le piston.
6. Tout en retirant l’embout, toucher le côté de la paroi du tube afin de retirer l’excédent de
fluide de l’extérieur.
7. Afin de livrer, peser sur le piston jusqu’au premier arrêt, puis jusqu’au fond.
Ne jamais livrer de très petits volumes dans le vide. Toujours livrer dans un liquide ou
sur la paroi du tube, de telle façon à ce que la force d’adhésion retire le liquide livré
de l’embout.
8. Avec le piston, toujours complètement au fond, retirer l’embout du liquide.
RAPPELEZ-VOUS QUE VOS MICROPIPETTEURS SONT DES INSTRUMENTS
DISPENDIEUX!
Exercice de dilutions avec les micropipetteurs (Groupes de 2)
Nous avons inclus cet exercice afin que chacun se familiarise avec la préparation des dilutions,
l’utilisation du micropipetteur et des embouts. (TOUJOURS ÉTIQUETER VOS TUBES!!)
Matériaux: Solution I (1% Composé “A” (m/v); P.M. 250g/mole)
Solution II (1.5M Composé “B” P.M. 480g/mole; Densité: 1.6g/mL)
Méthode:
1. Préparer 1mL de chacune des solutions suivantes des solutions mères ci-dessus.
a. Une solution de 0.2mM du composé “A”.
b. Une solution de 0.72% (m/v) du composé “B”.
c. Une solution de 5% (v/v) de la solution I.
d. Une solution qui contient 0.1mg du composé “A” et 0.1% (v/v) du composé “B”.
e. Une solution avec le rapport suivant : solution I : solution II : eau : 2 : 1 : 247
2. Transférer 150 µL de chacune des solutions aux puits appropriés d’une plaque de 96 puits tel
qu’indiqué ci-dessous:
Plan de la plaque à 96 puits (une plaque/table)
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 1
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 3
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 4
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Biologie Moleculaire-2017
15
Encore des dilutions: déterminer la concentration d'ADN (Groupes de 2) Comme avec la plupart des composés, la concentration d'acides nucléiques peut être déterminée par
spectrophotométrie. Pour ce faire, l'absorbance du composé est déterminée à la longueur d'onde
d'absorption maximale. Dans le cas des acides nucléiques, c'est dans la gamme des UV à une
longueur d'onde de 260 nm. Dans l'exercice suivant, vous allez préparer des échantillons à différentes
concentrations connues d'ADN et ensuite utiliser les valeurs d'absorbance obtenues pour générer une
courbe étalon représentant l'absorbance Vs concentration d'ADN (PAS QUANTITÉ). La courbe
étalon vous permettra alors de déterminer la concentration d'un échantillon d'ADN inconnu ainsi que
la détermination de la relation entre la concentration de l'ADN et l'absorbance à une longueur d'onde
de 260 nm. Plus précisément, vous souhaitez déterminer quelle concentration de l'ADN (en µg/mL
ou ng/µl) est égale à une absorbance de 1.0.
Matériaux
ADN de sperme de saumon (200µL à 0.5mg/mL)
ADN de sperme de saumon (200µL de concentration inconnue)
Méthode:
1. Préparer 500µL dans de l'eau de chacune des solutions standards d'ADN suivantes à partir de
l'échantillon d'ADN de concentration connue: 0.0, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005 et 0.0025mg/mL.
2. Préparer des échantillons de 500µL dans l'eau représentant des dilutions de 1/4 et 1/10 de
l'échantillon d'ADN inconnu.
3. Transférer 200µL de chacune des solutions d'ADN standards dans la plaque tel qu'indiqué dans le
plan ci-dessous.
4. Transférer 200µL de chacune des solutions d'ADN inconnues dans la plaque tel qu'indiqué dans
le plan ci-dessous.
5. Mesurer l'absorbance à 260nm.
Plan de la plaque d'essai d'ADN
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 1
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 2
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 3
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 4
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 5
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 6
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 7
0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC
1/4
INC
1/10 Groupe 8
Biologie Moleculaire-2017
16
Isolation d’ADN plasmidique (Groupes de 2) La plupart des méthodes utilisées pour la purification de plasmide se basent sur la disruption des
cellules en présence de dénaturants puissants. La disruption peut se faire par des cycles de gel et de
dégel, le broyage ou par une lyse chimique en utilisant des solutions fortement alcalines. Les
dénaturants sont essentiels afin d’inactiver les nucléases endogènes et exogènes qui dégraderaient
l’ADN. Examinez les différentes composantes du tampon d’extraction et déterminez la fonction de
chaque composé chimique.
Les plasmides sont des réplicons bactériens extrachromosomiques circulaires non obligatoires.
L’isolation d’ADN plasmidique nécessite la séparation de cet ADN de l’ADN chromosomique, ainsi
que des polysaccharides, les lipides et les protéines de la cellule. Les manipulations subséquentes,
tout particulièrement les modifications enzymatiques, nécessitent que l’ADN soit dépourvu de ces
impuretés.
Purification d’ADN plasmidique par lyse alcaline
Dans cette procédure, la lyse des cellules est accomplie avec une solution fortement alcaline (NaOH)
et les protéines sont dénaturées à l’aide d’une solution fortement alcaline et d’un détergent (SDS).
Les complexes de détergent sont ensuite précipités avec un sel neutralisant (KOAC). Le plasmide est
séparé de l’ADN bactérien en vertu de sa stabilité relative dans des conditions alcalines. De laisser le
plasmide dans la solution alcaline trop longtemps détruira le plasmide aussi. De plus, le chromosome
est lié aux membranes et sera précipité par le sel et le détergent. Il est donc important de ne pas
mélanger la solution de façon trop vigoureuse, car ceci aurait pour effet de relâcher le chromosome
qui est piégé. Le plasmide est plus petit et demeure donc libre en solution. La solution de plasmide
est séparée des débris cellulaires par une centrifugation, puis concentrée par une précipitation à
l’alcool.
Biologie Moleculaire-2017
17
A. Préparation de vos solutions:
Préparer 1mL des solutions I & II ainsi que le TE à partir des solutions mères suivantes :
10M NaOH
10% (m/v) SDS
0.5M glucose
1M Tris-Cl (pH 8.0)
0.5M EDTA
3 M KOAc pH 5
Isopropanol
ARNase 10mg/mL
Solution I: 50mM Glucose (tampon)
25mM Tris-Cl (pH 8.0) (tampon)
10mM EDTA (pH 8.0) (Chélateur)
Solution II: 0.2M NaOH (Alcalin)
1% SDS (Détergent)
T.E.: 10mM Tris-Cl pH 8.0
1mM EDTA pH 8.0
B. Protocole pour l’isolation d’un plasmide recombinant de pUC9: 1. Centrifuger à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse pour une durée de 1 minute 1.5mL de
la suspension d’E.coli/plasmide qui vous a été fournie.
2. Déversez-le surnageant sans déranger le culot. Utiliser une micropipette pour enlever le
surnageant résiduel.
3. Ajouter 200μL de la Solution I au culot et le suspendre sur le vortex.
4. Ajouter 400μL de la solution II. Fermer le tube et mélanger par inversion.
5. Ajouter 300μL d’une solution glacée de KOAc. Bien mélangé et gardé sur glace pour 5 minutes.
6. Centrifuger dans la microcentrifuge à vitesse maximale pour 5-10 minutes. Ceci précipite les
protéines et l’ADN chromosomique le long de la paroi du tube.
7. Transférer 700µL du surnageant à un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter un volume égal
d’isopropanol. Fermer le tube et mélanger par des inversions rapides des tubes.
8. Centrifuger les tubes à vitesse maximale pour 5 minutes. Déversez-le surnageant.
9. Le culot blanc au fond du tube contient l’ADN plasmidique et de l’ARN.
10. Suspendre le culot dans 50μL de TE pH8.0.
11. Ajouter 1μL d’une solution de 10mg/mL d’ARNase et incuber à 37oC 5-10 min.
Biologie Moleculaire-2017
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Digestions par enzymes de restrictions & électrophorèse sur gel d’agarose (Groupes de 2) Au milieu des années 1970, le domaine de la biologie moléculaire a connu une croissance importante
grâce à l’utilisation des endonucléases de restriction pour le clivage d’ADN à des sites spécifiques. Il
existe maintenant plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes disponibles
commercialement. Vous pouvez trouver de l’information détaillée sur plusieurs d’entre elles
(incluant celles que vous utiliserez dans ce cours) dans des catalogues de produits commerciaux.
Leurs spécificités les rendent particulièrement utile pour plusieurs tâches incluant entre autres la
cartographie de l’ADN, le clonage et le sous-clonage de l’ADN, etc. Le but de ce premier exercice
est de faire des digestions simples de votre ADN afin de répondre aux questions suivantes :
Quelles enzymes coupent dans l’insertion?
Quelles enzymes ne coupent pas dans l’insertion?
Quelle est la taille de l’insertion?
Quelles sont les positions possibles des différents sites de restrictions?
Le fragment d’ADN a été inséré dans quel site de restriction du SCM?
Pour de plus amples informations au sujet des enzymes de restrictions, consultez le site Web suivant :
http://askabiologist.asu.edu/expstuff/mamajis/restriction/restriction.htmL
Électrophorèse sur gel d’agarose L’électrophorèse sur gel d’agarose implique la séparation de molécules d’ADN d’après leurs tailles et
leurs conformations. La migration électrophorétique d’un fragment d’ADN dans l’agarose est
inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire (ceci est vrai seulement pour
certaines gammes de taille sous des conditions définies). [Conseil! Quand vous estimez la taille de
fragments de restrictions, gardez à l’esprit la précision requise, spécifiquement le nombre de chiffres
significatifs! La concentration de l’agarose utilisée dépend de l’éventail des tailles étant étudiées;
pour la séparation d’ADN linéaires entre 0.5 kb et 10 kb, un gel d’agarose de 1% est habituellement
utilisé. Suite à l’électrophorèse, les gels sont visualisés sous des ultras violets et photographiés avec
une caméra numérique. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité (et la
longueur) de l’ADN linéaire. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une estimation de la
quantité d’ADN dans les échantillons.
L’électrophorèse sur gel d’agarose utilise un courant à haute tension ce qui peut présenter un danger.
Le boîtier qui contient le gel est muni d’un mécanisme de connexion spécial pour des raisons de
sécurité. Les connexions doivent donc être retirées avant de pouvoir ouvrir le couvercle. TOUJOURS
COUPEZ L’ALIMENTATION AVANT DE DÉBRANCHER L’APPAREIL.
Le bromure d’éthidium, qui est utilisé comme colorant des gels d’agarose afin de pouvoir observer
l’ADN sous lumière UV, est un agent cancérigène potentiel. Toujours porter des gants pour
manipuler tout ce qui en contient. La source de lumière UV est aussi très dangereuse pour la peau et
surtout pour vos yeux, assurez-vous donc de bien vous protéger (gants, sarrau, masques) lorsque
vous observez vos gels d’agarose.
Biologie Moleculaire-2017
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Chaque appareil a deux supports de gels et trois peignes (8-puits, 10 puits et 14-puits contenants
environ 14μL, 12μL et 6μL respectivement). Rappelez-vous que les gels à 8 et 10 puits contiennent à
peu près deux fois plus d’ADN que les gels à 14 puits à cause de la taille de leurs puits. De plus, si
vous désirez visualiser des petits fragments (<500bp), qui sont moins intenses, vous devriez
considérer utiliser plus d'ADN et peut-être une plus forte concentration d’agarose (ex. 1.5% au lieu
du 1% standard) afin d’obtenir une meilleure résolution.
Méthode:
A. Préparation du gel d’agarose (peigne de 8 puits)
Matériaux :
Agarose
10X TBE
1. Préparer dans votre cylindre gradué 200mL de tampon TBE à une concentration finale de 1X.
Assurez-vous de bien mélanger.
2. Mélanger la quantité appropriée d’agarose pour obtenir une concentration finale de 1.0% m/v
dans 25mL de tampon TBE de 1X.
3. Pour dissoudre l’agarose, chauffé aux micro-ondes (25-45 secs.). Recouvrir le flacon d’une
pellicule de plastique afin de minimiser l’évaporation). Lorsque l’agarose sera complètement
dissout, laissez refroidir jusqu’à 50-60oC (à peu près 5 minutes).
4. Ajoutez 50 L d’une solution mère de bromure d’éthidium à 1mg/mL (ATTENTION!
CANCÉRIGÈNE!) et bien mélanger.
5. Versez l’agarose dans le support à gel. Après avoir versé le gel, placer le peigne de 8 puits
(Capacité du puits est approx. 14µL) et enlever toutes les bulles d’airs (avec un embout jaune de
micropipetteur). Refermez le couvercle de l’appareil et laissez solidifier le gel pour au moins 15-
20 minutes.
6. Une fois le gel solidifié, retirez les joints noirs puis versez une quantité suffisante du tampon TBE
1X dans l’appareil pour recouvrir le gel d’environ 0.5cm.
7. Soigneusement enlever le peigne.
Biologie Moleculaire-2017
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B. Conseils pour vérifier l’opération adéquate de votre gel
8. Branchez les électrodes de façon à ce que la cathode (électrode négative) soit à l’extrémité qui
représente l’origine du gel. Les échantillons vont migrer au travers du gel vers l’anode (électrode
positive). (ATTENTION! HAUTE TENSION!).
9. Régler l’appareil pour ~ 100V. Allumez l’appareil. Vérifier que l’ampérage est dans les environs
de 40-55 mA. Si cela n’est pas le cas, il y a un problème.
Problèmes possibles :
Le tampon de migration est à la mauvaise concentration
Le tampon dans le gel est à la mauvaise concentration
Vous avez oublié de mettre le tampon dans le gel
C. Analyse des digestions par enzymes de restrictions
10. Charger les échantillons d’ADN suivants. L’inconnu est un recombinant du vecteur pUC9:
a. Échelle de poids moléculaire de 1Kpb (5µL)
b. Recombinant de pUC9 que vous avez purifié précédemment, 5µL
c. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec BamHI, 5µL
d. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI, 5µL
e. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec HindIII, 5µL
f. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI + HindIII, 5µL
g. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec PstI, 5µL
h. Vecteur pUC9 digéré avec BamHI, 5µL
11. Faire l’électrophorèse à 100V pour approx. 45 minutes, puis demander à un aide enseignant de
faire la prise d’une photo.
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Échelle de Tailles d’ADN
Masse d'ADN Paires de base
(ng/5µL)
Gel de 1% d'agarose TAE
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Biologie Moleculaire-2017
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Exercice 2
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant
Isolation d’ADN plasmidique avec Qiagen
Digestions par enzymes de restriction
Électrophorèse sur gel d’agarose
Cartographie de restriction d’un gène de la levure – Analyse Southern
Isolation d’ADN génomique
Digestions par enzymes de restriction d’ADN génomique
Électrophorèse sur gel
Biologie Moleculaire-2017
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Les enzymes de restriction et l’électrophorèse sur gel d'agarose Suite à la plupart des digestions, il est nécessaire de répondre aux questions suivantes :
L’ADN a-t-il été digéré?
Combien de fois est-ce que l’enzyme a coupé?
Quelles sont les tailles des fragments générés?
Est-ce que la digestion est complète ou partielle?
Les échantillons d’ADN sont-ils complètement digérés? S’il y a seulement eu clivage partiel de
l’ADN (exemple de cause possible : réduction de l’activité enzymatique à cause de conditions de
réactions non appropriées; impuretés dans l’ADN qui aurait inhibé l’enzyme), les fragments à
migration plus lente (qui représentent les fragments non clivés contenant un site pour l’enzyme
utilisée) sont habituellement présents à des proportions inférieures aux prédictions stœchiométriques.
Autrement dit, puisque l’intensité de la fluorescence UV est proportionnelle à la quantité de bromure
d’éthidium liée (et donc la quantité/longueur de l’ADN), ces fragments sont moins intenses qu’ils le
seraient s’ils étaient présents en quantité équimolaire aux fragments complètement digérés.
Est-ce que les tailles calculées des fragments de restriction sont conformes? Si vous effectuez la
migration de différentes digestions d’ADN cloné, il est important de vérifier que la somme des tailles
des fragments calculées est à peu près égale pour chacune des voies de migration (c. a. d. la taille de
la molécule d’ADN intacte). Puisque l’estimation de la taille à l’aide des marqueurs de taille n’est pas
exacte (et que l’erreur associée aux fragments se trouvant dans la partie non linéaire de la courbe
étalon est plus grande), il n’y a habituellement qu’un accord approximatif (une différence d’environ
200-300 pb pour un plasmide recombinant de 5 Kpb). Si vous obtenez de plus grandes différences,
considérez les points suivants: Y aurait-il co-migration de plusieurs fragments? (Observez l’intensité
relative de la fluorescence.) Y aurait-il des produits de digestion partielle inclus dans vos calculs? Y
aurait-il plusieurs fragments de faible masse moléculaire (donc de faible intensité que vous avez de la
difficulté à voir)? Les marqueurs utilisés pour évaluer la taille de molécules d’ADN linéaire sont-ils
aussi linéaires? Rappelez-vous que les molécules d’ADN linéaires, circulaires déroulées et
bicaténaires superenroulées ont toutes des propriétés de migrations différentes sous nos conditions
d’électrophorèse sur gel d’agarose. Puisque les marqueurs de tailles que nous allons utiliser sont
linéaires, peuvent-ils être utilisés pour estimer la taille de l’ADN d’un plasmide recombinant non
coupée?
Biologie Moleculaire-2017
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Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant (Groupes de 2) Le but de ce projet est d’obtenir une compréhension de la technique de cartographie par des enzymes
de restrictions. Chaque groupe de deux aura à travailler avec un plasmide qui contient une insertion
qui représente un des gènes listé sous la rubrique « séquences » > « gène inconnu » sur la page web
de ce cours. Parmi un groupe de 4 (par bout de table) les deux groupes de deux possèderont le même
inconnu, mais dans des orientations opposées. Ces insertions furent toutes obtenues d’une librairie
génomique créée dans le vecteur de clonage pUC19. En bref, l’ADN génomique d’un organisme a
été isolé, digéré, après quoi une ligature des fragments générés a été faite dans le vecteur pUC19
linéarisé avec une enzyme appropriée dont le site de restriction se retrouve dans le site de clonage
multiple. (Voir la figure sur la page suivante).
Les buts de ce projet sont :
Utiliser une approche expérimentale pour: o Déterminer le site d’insertion
o Vérifier la taille de l’insertion
o Vérifier l’orientation de l’insertion
o Déterminer la carte de restriction
Conseils pour l'utilisation des enzymes de restrictions Gardez toujours les solutions mères d’enzymes sur glace lorsqu’elles ne sont pas au congélateur à
-20oC (ce qui devrait être le temps le plus court possible).
L’enzyme est toujours la dernière composante ajoutée au mélange réactionnel et elle est ajoutée
directement à la solution dans le fond du tube plutôt que par goutte sur le bord du tube.
Assurez-vous que la solution est bien mélangée (ex. en donnant des petits coups sur le tube avec
votre doigt). S’il reste des gouttes sur le bord du tube, centrifugez brièvement les tubes. Vous
pouvez aussi les mélanger en utilisant le vortex (à moins que vous utilisiez de l’ADN génomique de
taille moléculaire élevée qui risque de se fragmenter).
Ne touchez jamais la pointe des embouts de pipette avec vos doigts ou avec autre chose que la
solution que vous voulez transférer.
Toujours utiliser un nouvel embout pour chaque opération et jeter les embouts utilisés aussitôt.
En accord avec les LIGNES DIRECTRICES SUR LE MATÉRIEL BIOLOGIQUE
DANGEREUX, tout le matériel jetable (embouts de micropipette, tubes de microcentrifugeuse, etc.)
utilisé lors de travaux avec de l’ADN recombinant et des cellules hôtes bactériennes doit être placé
dans des récipients à déchets spéciaux (c’est-à-dire, les boites de déchets à vos postes de travail).
Vous allez transférer ces déchets dans des sacs orangés qui seront autoclavés avant d’être jetés.
Biologie Moleculaire-2017
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Les enzymes suivantes ne coupent pas pUC19 : AdeI, AloI, ApaI, AscI, BaeI, BbvCI, BclI, BcuI, BglII, BoxI, BpiI, BplI, Bpu10I,
Bpu1102I, BsaAI, BsaBI, BseRI, BsgI, BshTI, BsmFI, Bsp68I, Bsp119I, Bsp120I,
Bsp1407I, BspTI, Bst1107I, BstXI, Bsu15I, BtrI, Cfr42I, CpoI, DsaI, Eco32I,
Eco47III, Eco52I, Eco72I, Eco81I, Eco91I, Eco105I, Eco130I, Eco147I, FseI, Kpn2I,
KspAI, MlsI, MluI, Mph1103I, MssI, MunI, Mva1269I, NcoI, NheI, NotI, PacI, PauI,
PdiI, Pfl23II, PsiI, Psp5II, PsyI, SacII, SanDI, SexAI, SfiI, SgfI, SgrAI, SmiI,
SrfI, SstII, Van91I, XagI, XcmI, XhoI, XmaJI.
Les vecteurs pUC sont de petits plasmides, dont le nombre de copies maintenues est élevé qui
possèdent un site de clonage multiple (SCM), l’origine de réplication pMB1 nécessaire à la
réplication du plasmide (source – plasmide pBR322), et le gène bla, qui code pour la bêta-lactamase,
qui confère une résistance à l’ampicilline (source – plasmide pBR322). Noter que tous les sites de
restriction dans le site de clonage multiple surviennent seulement qu’une fois.
pUC19
SCM de pUC19
Biologie Moleculaire-2017
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Conseils pour le clivage par enzymes de restriction des plasmides
Quantité d’ADN à utiliser:
La facilité que vous aurez à détecter vos fragments de restrictions (par fluorescence UV après une
coloration au bromure d’éthidium où l’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la masse de
l’ADN dans un fragment) dépend du montant d’ADN utilisé (et des paramètres tels que l’épaisseur
du gel, la précision des bandes, etc.). On utilise habituellement entre 200-600ng d’ADN
plasmidique/puits pour une digestion avec une seule enzyme. Pour des digestions qui génèreront
plusieurs fragments, vous pourriez avoir besoin de faire la restriction de 400-1000ng afin de pouvoir
déceler les plus petits fragments (POURQUOI??)
Après avoir sorti les échantillons d’ADN du congélateur, assurez-vous de les dégeler complètement
avant de les prélever avec une pipette (pour obtenir la quantité adéquate d’ADN dans un volume
donné).
Vos digestions seront faites en présence d’un tampon commercial fourni par la compagnie
Fermentas. La concentration de sel idéale varie d’une enzyme de restriction à l’autre et vous pouvez
l’obtenir en utilisant différentes formulations du tampon.
Certaines enzymes requièrent des températures d’incubation autre que 37oC. Notez également que
les enzymes de restrictions qui reconnaissent les mêmes séquences s’appellent des isoschizomères
(ex. SacI et SstII). Il y a aussi des enzymes qui portent des noms très semblables (EcoRI, EcoRV)
mais qui reconnaissent des séquences distinctes (donc, soyez certain de bien lire les étiquettes sur les
tubes d’enzymes).
En principe, 1 UNITÉ D’ENZYME DE RESTRICTION DIGÈRE COMPLÈTEMENT 1g
D’ADN PURIFIÉ EN 1 HEURE. Par contre, puisque nous utilisons souvent des préparations
d’ADN brutes, nous augmentons souvent la quantité d’enzyme utilisé et dans le cas d’ADN
génomique complexe, les temps d’incubation sont habituellement prolongés aussi. Typiquement, les
enzymes de restrictions sont fournies à des concentrations de 5-10 unités/l.
Le volume final d’enzyme ne devrait pas excéder 1/10 du volume réactionnel total, puisque le
glycérol dans la solution stock d’enzyme, que l’on ajoute pour empêcher la formation de cristaux lors
de la congélation, peut inhiber la réaction. Notez aussi que les solutions qui contiennent du glycérol
sont plus difficiles à manipuler avec des pipettes que des solutions aqueuses, soyez attentifs aux
volumes dans vos embouts de pipette.
Pour un survol de la cartographie par d’enzymes de restriction, consultez les sites Web
suivants:
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/RestMap/RestMapTutorial.htmL
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.htmL
http://wps.prenhall.com/esm_klug_essentials_5/17/4576/1171606.cw/content/index.htmL
Biologie Moleculaire-2017
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Liste d’enzymes de restriction disponibles
ENZYME SITE
BamHI G▼GATCC
HindIII A▼AGCTT
PstI CTGCA▼G
XbaI T▼CTAGA
▼- indique le lien phosphodiester clivé
Biologie Moleculaire-2017
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Matériaux et Méthodes :
Certaines des enzymes de restrictions que vous utiliserez se retrouvent dans votre boîte au
congélateur. Si elles ne sont pas dans votre boîte, elles sont dans la boîte au congélateur du
groupe en face de vous sur le même bout de banc que vous.
Votre plasmide recombinant inconnu, à une concentration de 100g/mL, est dans votre boîte
au congélateur.
Les tampons 10X d’enzymes de restrictions sont dans votre boîte au congélateur.
Préparation de vos digestions : Puisque les différentes enzymes requièrent différents tampons, vous aurez à être flexible lorsque vous
ferez une digestion de restriction. Préparez un tableau en indiquant toutes les composantes que vous
avez l’intention d’ajouter et leurs volumes avant de débuter. Lorsque vous ajouterez une des
composantes à votre tube étiqueté, rayez-la de votre tableau. Choisir le tampon qui permet d’avoir
100% d’activité avec l’enzyme appropriée. (Consulter le tableau sur la page suivante)
Mélange réactionnel d’une digestion simple typique de 30µL:
Ingrédients Concentration finale
ADN (100ng/µL) 8.3ng/ µL
Tampon de restriction 10X 1X
Enzyme (10 unités/µL) 0.3 unités/ µL
Eau Compléter à 30µL
Pour les digestions simples, utiliser le tampon de restriction recommandé pour une activité de
100%.
Pour les digestions doubles, les réactions doivent contenir chacune des deux enzymes à une
concentration finale de 0.3 unités/ µL. Utiliser le tampon de restriction qui possède la meilleur
compatibilité pour les deux enzymes.
Biologie Moleculaire-2017
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Enzyme Tampon recommandé
pour 100% d'activité
% d'activité dans les tampons Fermentas
B G O R Tango
(bleu) (vert) (orange) (rouge) (jaune)
1X 1X 1X 1X 1X
ApaI B 100 20-50 0-20 0-20 20-50
BamHI BamHI 20-50 100 20-50 50-100 100
BclI G 20-50 100 20-50 20-50 100
BglI O 0-20 50-100 100 100 0-20
BglII O 0-20 20-50 100 50-100 0-20
BstXI O 20-50 100 100 50-100 50-100
ClaI Tango 20-50 20-50 20-50 20-50 100
EcoRV R 0-20 50-100 50-100 100 20-50
EcoRI EcoRI 0-20 NR 100 100 NR
HincII Tango 50-100 50-100 20-50 50-100 100
HindIII R 0-20 20-50 0-20 100 50-100
HinfI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100
HpaII Tango 50-100 50-100 0-20 20-50 100
HphI B 100 0-20 0-20 0-20 20-50
KpnI KpnI 20-50 0-20 0-20 0-20 20-50
MluI R 0-20 20-50 50-100 100 20-50
NcoI Tango 20-50 20-50 20-50 50-100 100
NdeI O 0-20 0-20 100 50-100 0-20
NheI Tango 100 20-50 0-20 0-20 100
PstI O 50-100 50-100 100 100 50-100
PvuI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100
PvuII G 50-100 100 20-50 50-100 20-50
RsaI Tango 50-100 20-50 0-20 0-20 100
SacI SacI 50-100 20-50 0-20 0-20 50-100
SacII B 100 50-100 0-20 0-20 50-100
SalI O 0-20 0-20 100 20-50 0-20
ScaI ScaI 0-20 0-20 0-20 0-20 0-20
SmaI Tango 50-100 0-20 0-20 0-20 100
SspI G 20-50 100 0-20 50-100 100
TaqI TaqI 0-20 20-50 20-50 20-50 20-50
XbaI Tango 50-100 50-100 20-50 0-20 100
XhoI R 0-20 50-100 50-100 100 20-50
NR - Non recommandé
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Vos Digestions :
1. Préparer les digestions de 0.25g d’ADN par les enzymes de restrictions suivantes.
BamHI HindIII + PstI PstI + XbaI
HindIII HindIII + XbaI
PstI
XbaI
2. Préparer un témoin de digestion, qui contient toutes les composantes, sauf pour l’enzyme. (Vous
pouvez utiliser n’importe lequel des tampons de restriction pour cette réaction)
3. Incuber à 37oC pour 60 minutes.
4. Durant l’incubation des digestions, faire un gel d’agarose de 1.0% avec du bromure d’éthidium.
5. Après la période d’incubation, transférer 5L de vos digestions a des nouveaux tubes étiquetés de
façon appropriée et ensuite ajouter du tampon de chargement 5X à chacune d’entre elles afin
d’obtenir une concentration de 1X ou plus.
6. Charger les échantillons qui contiennent le tampon de chargement dans le gel.
7. Charger 5μL du vecteur pUC9 linéarisé qui a été préparée pour vous.
8. Charger 5μL de l’échelle de poids moléculaire.
9. Faire l’électrophorèse à 100V.
10. Après l’électrophorèse, examiner votre gel aux ultras violets et prendre une photo pour votre
analyse.
Biologie Moleculaire-2017
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Purification d'ADN plasmidique avec le kit QIAGEN Une autre façon de purifier les plasmides consiste à utiliser des kits commerciaux tels que celui offert
par Qiagen. À la base, cette technique de purification est fondée sur la méthode de lyse alcaline que
vous avez exécutée précédemment. Afin de comparer les deux méthodes, vous utiliserez le kit de
Qiagen pour la purification du vecteur pUC19. À la fin de la procédure, vous devriez être capable de
comparer les deux méthodes en ce qui a trait aux similarités et les différences.
Étape 1
Étapes 2-5
Étapes 6-7
Étapes 8-9
Étape 10
Culot bactérien
Suspension
Lyse
Neutralisation
Liaison
Lavage
Élution
ADN plasmidique pure
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Protocole pour la purification du vecteur pUC19 : 1. Obtenir la culture de 1.5mL d'E.coli avec un plasmide qui a été préparé pour vous et récolter les
cellules par une centrifugation à vitesse maximale pour 1 minute. Déversez-le surnageant.
2. Suspendre au vortex le culot de cellules dans 250µL de tampon P1 (+ ARNase) et transférer dans
un tube de microcentrifugeuse. Aucun agrégat de cellules ne devrait être visible.
3. Ajoutez 250µL de Tampon P2 (qui contient du NaOH/SDS) et inversez doucement le tube 4-6
fois afin de mélanger. Ne passez pas le mélange au vortex puisque ceci causerait un déchirement
de l’ADN génomique. Si nécessaire, continuez à inverser le tube jusqu’à ce que la solution
devienne visqueuse et un peu claire. Ne pas dépasser 5 min, car l’ADN plasmidique risquerait
de se dénaturer irréversiblement.
4. Ajoutez 350µL du tampon N3 (neutralisation, tampon à forte concentration de sel) et inversez
immédiatement le tube doucement 4-6 fois. La solution devrait devenir trouble.
5. Centrifugez à vitesse maximale 10 min. Un culot compact blanc va se former au fond du tube
avec le “lysat clarifié” au-dessus.
6. Utilisez une pipette pour transférer le surnageant de l’étape 5 à une colonne QIAprep placée dans
un tube de récupération de 2mL.
7. Centrifugez 60 secs. à vitesse maximale. Jetez le volume écoulé dans les déchets organiques.
8. Lavez la colonne QIAprep en ajoutant 0.375mL de tampon PE (qui contient de l’éthanol) et
centrifugez 60 secs. Jetez l’écoulement (déchets organiques). Répétez une deuxième fois.
9. Jetez l’écoulement (déchets organiques), transférez dans un tube à centrifugeuse avec le
capuchon coupé et centrifugez pour 1 minute additionnelle afin d’éliminer le tampon de lavage
résiduel.
IMPORTANT: L’éthanol résiduel du tampon PE peut inhiber des réactions enzymatiques
subséquentes. Les étapes 8 et 9 sont donc très importantes.
10. Placez la colonne QIAprep dans un tube à microcentrifugeuse (1.5mL) propre avec capuchon
coupé. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 50 µL de tampon EB (tampon d’élution = 10 mM Tris-HCl,
pH 8.5) et centrifugez pour 1 minute.
11. Transférez dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté. ASSUREZ-VOUS DE BIEN
ÉTIQUETER CETTE PRÉPARATION ET D’ENTREPOSER le RESTANT DANS
VOTRE BOÎTE À -20OC PUISQUE VOUS EN AUREZ BESOIN POUR L’EXERCICE 3
ET POUR L’EXAMEN PRATIQUE!
12. Transférer 5L de votre préparation à un nouveau tube et ajouter une quantité suffisante de
tampon de chargement pour obtenir une concentration finale de 1X ou plus.
13. Charger votre échantillon sur le gel précoulé qui a été préparé pour vous.
Biologie Moleculaire-2017
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Cartographie d’un gène de la levure – Analyse Southern (Groupes de 2)
La cartographie de restriction des plasmides est une tâche relativement simple étant donné la faible
complexité des plasmides. On ne peut pas dire la même chose de l'ADN génomique. Une technique
qui a été développée pour effectuer une analyse de restriction d’ADN complexe comme les génomes
est le Southern. Le principe de cette technique repose sur la digestion de l'ADN d'intérêt, suivie d'une
électrophorèse, la dénaturation, le transfert sur un support solide et, enfin, une hybridation à une
sonde complémentaire dirigée contre la région d'intérêt. Compte tenu de l'avènement de la PCR et du
séquençage, l'analyse Southern n’est plus très utilisée de nos jours. Cependant, ce type d'analyse
demeure utile pour ...
― trouver la position d’une séquence dans un gros fragment d’ADN
― déceler les réarrangements chromosomiques
― déterminer le nombre de copies d’un gène
― trouver des séquences avec une faible homologie
― analyser de l’ADN de séquence inconnu d’organismes inconnus
Isolation d’ADN génomique de levure
Matériaux:
Culot d’une culture de levure de 2mL
Tampon de lyse
Tube avec capuchon à vis contenant des billes de verres et 200μL phénol:chloroform:isoamyl alcool
(25:24:1)
99% ETOH
ARNase (dans le bac à glace à l‘avant)
4M acétate d’ammonium
Méthode:
1. Suspendre le culot de levure dans 200μL de tampon de lyse.
2. Transférer la suspension au tube à vis qui contient les billes de verres et 200μL
phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1).
3. Mélanger au Vortex pour 1 minute, puis placer sur glace pour 1 minute.
4. Répéter l’étape 3 deux fois de plus.
5. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un
nouveau tube de microcentrifuge. EVITER DE RÉCOLTER L’INTERPHASE!
6. Ajouter 1mL de 99% ETOH à la phase aqueuse, bien mélanger par inversion puis centrifuge à
vitesse maximale pour 2 minutes.
7. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 400μL d’eau.
8. Ajouter 2μL ARNase et incuber à 37oC 15 minutes.
9. Ajouter 10μL 4M acétate d’ammonium, 1mL 99% ETOH, et bien mélanger.
10. Centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.
11. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau.
12. Préparer une dilution de 1/10 dans de l’eau dans un volume final de 250μL de votre préparation
d’ADN génomique.
13. Étiqueter votre échantillon dilué et le remettre à l’aide enseignant pour qu’il fasse la lecture à
260nm.
14. Déterminer la concentration de votre préparation.
Biologie Moleculaire-2017
35
Digestion et électrophorèse d’ADN génomique de levure
Méthode:
15. Une fois que vous aurez déterminé la concentration de votre ADN génomique, préparer une
digestion de 5μg d’ADN avec 20 unités de l’enzyme BamHI dans un volume réactionnel de
50μL.
16. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.
17. Après la période d’incubation, transférer 15μL à un nouveau tube puis ajouter du tampon de
chargement d’ADN de %X pour obtenir une concentration finale de 1X ou plus.
18. Une photo sera prise des gels à a fin de leurs migrations. Ceux-ci seront transférés à une
membrane puis hybridés avec une sonde contre un gène de la levure.
19. Les résultats des hybridations seront disponibles sur le T:\.
Biologie Moleculaire-2017
36
Exercice 3
Qu’est qu’on fait aujourd’hui !
Mutagenèse dirigée et clonage de GFP
Amplification et mutagenèse de GFP par PCR
Purification des réactions de PCR avec Qiaquick
Digestion des produits de PCR de GFP et du vecteur pUC19
Ligature des amplicons de GFP
Biologie Moleculaire-2017
37
Mutagenèse dirigée et clonage de GFP (Groupes de 2) Le but ultime de ce projet est d’utiliser la PCR pour faire la mutagenèse de la protéine GFP. La
stratégie qui sera utilisée pour atteindre ce but sera d’utiliser la réaction de la polymérase en chaîne
afin de faire la mutagenèse dirigée du gène tout en l’amplifiant. Ce projet comprend plusieurs parties
indépendantes qui seront exécutées pendant les deux prochaines semaines. Consulter les pages web
suivantes pour rafraîchir vos connaissances sur la PCR:
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.htmL
Survol des étapes qui seront faites sont présentées dans l’organigramme ci-dessous.
Amplification et mutagenèse par PCR de GFP (Étape I)
Nettoyage des produits de PCR de GFP (Étape II)
Digestion des produits de PCR de GFP par HindIII et EcoRI (Étape III)
Digestion de pUC19 purifié par Qiagen avec HindIII et EcoRI (Étape III)
Nettoyage des produits de PCR de GFP digéré ou du vecteur pUC19 digéré (Étape IV)
Ligature des produits de PCR de GFP dans le vecteur pUC19 digéré (Étape V)
Transformation des ligatures dans E.coli Xl-1 (Étape VI; ceci sera faite pour vous)
Criblage des transformants (Étape VII; sera fait la semaine prochaine)
Biologie Moleculaire-2017
38
Étape I : Amplification et mutagenèse de GFP par PCR Des amorces ont été conçues afin de faire la mutagenèse et amplifier la séquence codante du gène
GFP qui se retrouve dans le plasmide pGFPuv. Les amorces qui seront utilisées sont indiquées ci-
dessous.
Amorce “Forward”:
GFPfor-1: CGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG
GFPfor-2: CGCCAAGCTTGcCATGCCTGCAGGTCG
GFPfor-3: CGCCAAGCTTGaCATGCCTGCAGGTCG
Caractéristiques:
Un site HindIII (AAGCTT) indiqué en italique et souligné sera utilisé pour le clonage.
Amorces “Reverse”:
GFPrev: CCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAG Méthode:
Préparez vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50µL. Dans des tubes de PCR
étiquetés (utilisez des tubes de PCR à paroi mince de 200 µL), ajoutez les ingrédients dans l’ordre
indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour chaque composante, utilisez un nouvel embout autoclavé.
Notez : la polymérase Taq sera ajoutée par l’aide enseignant.
Ingrédients Conc. mère Conc. finale Volume
Eau Compléter à 50µL
Tampon PCR Taq 10X 1X
Amorce GFPfor 2µM 0.2µM
*Amorce GFPrev assignée 2µM 0.2µM
MgCl2 50mM 1.5mM
dNTP 2mM 200µM
pGFPuv - 5µL
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL
*Assurez-vous de noter quelle amorce GFP reverse vous a été assignée!
Une fois que votre mélange réactionnel est complété, remettez-le à l’aide enseignant.
Conditions d’amplifications par PCR:
1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer.
2. 30 cycles de 30sec, 94oC dénaturation; 1 minute à 68oC appariement et extension.
3. 1 cycle de 5min, 72oC.
4. Refroidir à 4oC, indéfinie.
Biologie Moleculaire-2017
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Électrophorèse des amplicons de PCR de GFP Une fois vos réactions de PCR terminées vous utiliserez l’électrophorèse sur gel d’agarose afin de
vérifier la réussite de l’amplification avant d’initier le clonage.
Méthode:
1. Récupérez vos réactions de PCR
2. Transférez 8µL de votre produit de PCR et placez-le dans un nouveau tube, puis ajoutez 2.5µL
de tampon de chargement 5X. Entreposer le restant sur glace pour des expériences subséquentes.
3. Charger vos échantillons sur un gel d’agarose de 1% précoulé qui contient du bromure
d’éthidium et une échelle de poids moléculaire appropriée.
4. Observer sous les UV. Prendre une photo pour l’analyse.
Étape II : Purification des réactions de PCR avec le kit de purification
QIAQUICK (Groupes de 2 assignés)
Méthode:
1. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de PCR et mélangez par inversion.
2. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.
3. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.
4. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK
dans le même tube.
5. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.
6. Jeter l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES.
7. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.
8. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le
même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon
PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.
9. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.
10. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la
colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.
11. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne
QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.
12. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez
jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon
d’élution afin de compléter le volume à 30µL).
Biologie Moleculaire-2017
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Étape III : Digestion du produit de PCR de GFP et du vecteur pUC19 (Groupes de 2 assignés)
Méthode:
Un des groupes de deux fera la digestion de l’amplicon de GFP tandis que l’autre groupe de
deux fera la digestion du vecteur pUC19.
1. Préparer un mélange réactionnel de 50uL pour faire une digestion double HindIII-EcoRI du
produit de PCR de GFP ainsi que du plasmide pUC19 purifié la semaine passée par la méthode de
Qiagen.
Volume PCR Volume Vecteur
Produit de PCR de GFP 10uL ---------
OU plasmide pGFPuv --------- 5uL
Tampon de restriction rouge 10X 1X 1X
HindIII 1uL 1uL
EcoRI 1uL 1uL
Eau Compléter à 50uL Compléter à 50uL
2. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.
Étape IV : Purification avec le kit de purification QIAQUICK des digestions des
produits de PCR ou de pUC19 (Groupes de 2 assignés)
Méthode:
1. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de restriction et mélangez par
inversion.
2. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.
3. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.
4. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK
dans le même tube.
5. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.
6. Jeter l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES.
7. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.
8. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le
même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon
PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.
9. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.
10. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la
colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.
11. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne
QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.
12. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez
dans votre boite au congélateur. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30µL, ajoutez assez du
tampon d’élution afin de compléter le volume à 30µL).
Biologie Moleculaire-2017
41
Purification par QIAquick
Produit de PCR
ou
Morceau de gel solubilisé
ou
Réaction enzymatique
Liaison
Lavage
Élution
Biologie Moleculaire-2017
42
Étape V : Ligature des amplicons de GFP Ayant digéré l’amplicon de PCR de GFP et le vecteur pUC19 vous procéderez maintenant avec la
ligature. Votre but ultime est de cloner la séquence GFP amplifiée dans le vecteur pUC19.
Ingrédient Tube 1 Tube 2
pUC19 digéré 5.0L 5.0L
Tampon de ligature 10 X 2.0L 2.0L
Amplicon GFP digéré 5.0L 0.0L
Eau ajouter de l’eau pour compléter le volume à 19.0L
Ligase 1.0L 1.0L
DONNER VOS ÉCHANTILLONS ÉTIQUETÉS À VOTRE AIDE ENSEIGNANT
Les ligatures seront incubées à la température de la pièce jusqu'à demain, puis transformées dans
E.coli Xl-1.
Biologie Moleculaire-2017
43
Exercice 4
Qu'est-ce qu’on fait aujourd'hui!
Mutagenèse et clonage de GFP - Analyse des transformations
Compte de colonies
PCR de colonie
Digestion des produits du PCR de colonie
Biologie Moleculaire-2017
44
Mutagenèse et clonage de GFP (Groupes de 4)
Analyse des résultats des transformations Les ligatures que vous avez faites la semaine passée ont été utilisées pour transformer la souche
d’E.coli Xl-1 blue. On vous a fourni avec les plaques des transformations pour poursuivre avec
l’analyse de l’expérience de clonage. Obtenir les données suivantes pour chacune des plaques.
Amorce reverse utilisée pour l’amplification et la mutagenèse
Nombre total de colonies observé
Nombre de colonies blanches
Nombre de colonies bleues
Nombre de colonies vertes fluorescentes
Assurez-vous d’obtenir ces données pour chacune des mutagenèses qui ont été faites. (c.à.d. chacune
des trois différentes amorces « forward »)
Criblage par PCR des transformants
Une fois les comptes enregistrés vous utiliserez la PCR et une digestion pour cribler les
recombinants pour des insertions (et visualiser les produits de PCR après une électrophorèse).
Méthode:
1. Étiqueter 7 tubes de microcentifuge de 1-7.
2. Ajouter 50L d’eau a chacun des tubes.
3. En utilisant un embout de pipette stérile, ramasser une des colonies bleues à partir de la gélose
qui représente la transformation du plasmide + insertion, puis placer l’embout dans le tube
correspondant étiqueté 1.
4. Répéter la procédure ci-dessus avec 6 colonies blanches. Si vous avez des colonies blanches
fluorescentes et non fluorescentes, ramasser trois de chaque. Si toutes les colonies blanches
étaient fluorescentes, alors ramasser 6 de celles-ci.
5. Mélanger brièvement au vortex chacun des 7 tubes contenants les embouts pour suspendre la
colonie (Tenir l’embout pendant que vous mélangez).
6. Retirer les embouts de chaque tube, et bouillir pour 5 minutes. Placez sur glace pour 1 minute.
7. Centrifugé à vitesse maximale pour 5 minutes. Vous utiliserez le surnageant pour votre analyse
par PCR.
8. Préparer un cocktail pour 8 réactions de PCR de 20L. GARDER SUR GLACE. Ci-dessous est
la recette pour une réaction de 20L.
Réaction de PCR
Solution Conc. mère Conc. finale
Eau L pour un volume final de 20 L
Tampon Taq 10X 1 X
Amorce MutScreenFor 2 M 0.2 M
Amorce MutScreenRev 2 M 0.2 M
MgC12 50 mM 2.5 mM
dNTPs 2mM 200 M
ADN Pol. Taq 5U/µL 0.25U/L
Biologie Moleculaire-2017
45
9. Distribuer 19L du cocktail à chacun des 7 tubes de PCR étiquetés (SUR GLACE)
10. Ajouter 1L de chacun des surnageant des colonies obtenus à l’étape 7 aux tubes de PCR
appropriés.
11. Préparer un gel d’agarose de 1.25% contenant du bromure d’éthidium.
Conditions de PCR:
i. 1 cycle de 5 min, 94oC pour dénaturer;
ii. 30 cycles de 30s, 94oC pour dénaturer; 1 min. à 68oC pour l’appariement et l’extension.
iii. 1 cycle de 5 min, 72oC
iv. Refroidir à 4oC.
Amorces :
Forward : AGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC
Reverse: ATCGGTGCGGGCCTCTTCGC
Digestion par enzyme de restriction des produits de PCR :
1. Obtenir vos réactions de PCR.
2. Préparer 7 digestions par l’enzyme BamHI, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un
volume final de 20 µL qui inclut 5 µL de chacune de vos réactions de PCR.
3. Préparer un témoin non-digéré en utilisant n’importe lesquelles de vos 7 réactions de PCR.
4. Digérer pour une heure.
5. Après la digestion, ajouter 5 µL de tampon de chargement à chaque échantillon.
6. Charger 10 µL de chaque mélange, ainsi que l’échelle de poids moléculaire, sur votre gel
d’agarose de 1.25%. Migrer pour 1.5 heure à 100 V.
7. Prendre une photo de votre gel.
Biologie Moleculaire-2017
46
Exercice 5
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Expression génique - Transcription
Isolation d’ARN de levure
Électrophorèse d’ARN
Principes de la RT-PCR
Biologie Moleculaire-2017
47
Expression génique - Transcription Les informations contenues dans nos génomes sont de peu d'utilité, à moins que la cellule puisse la
décoder pour produire des produits utiles qui peuvent effectuer des travaux. Cette information est
contenue dans des unités appelées gènes (ou ADN codant). Le produit exprimé à partir d'un gène
peut être soit de l'ARN ou une protéine. Cependant, tous les produits des gènes ne sont pas
nécessaires en tout temps ou dans les mêmes quantités. Il serait très énergiquement exigeant et
coûteux pour une cellule d’exprimer chaque gène en tout temps. En outre, un rapport inapproprié
entre les différents produits des gènes pourrait entraver leur fonction et être nuisible à la cellule ou à
l'organisme. Par conséquent, la cellule contrôle l'expression des gènes en réponse à différents signaux
intracellulaires et extracellulaires. La première étape pour l'expression génique est la transcription,
un processus par lequel la polymérase ARN fait la lecture de la séquence d'ADN d'un gène pour
produire soit un transcrit codant (ARNm) ou un transcrit non codant telle que l'ARN ribosomal ou
ARNt. Donc la première étape dans l’étude de l’expression d’un gène est de déterminer sont
abondance sous différentes conditions parmi la population d’ARN total exprimé à un temps donné.
Isolation d’ARN de levure (Groupes de 2)
Chaque groupe de deux sera fourni avec une culture de levure qui a été assujettie à une des
conditions environnementales suivantes :
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.
Assurez-vous d’enregistrer quelle condition environnementale vous a été assignée. Vous aurez
besoin de cette préparation d’ARN pour des expériences qui seront faites la semaine prochaine.
Méthode : (Les étapes 1-3 ont été faites pour vous)
1. Obtenir 10mL de la culture de levure assignée.
2. Centrifuger pour 10 minutes à 7 000 rpm.
3. Jeter le surnageant.
4. Suspendre le culot dans 200μL de tampon de lyse.
5. Transférer à un nouveau tube avec un bouchon à vis qui contient des billes de verres et 200μL de
phénol : chloroforme : isoamyl alcool (25:24:1).
6. Mélanger au vortex pendant 2 minutes et ensuite placer sur glace pour 2 minutes.
7. Répéter l’étape 6 deux fois de plus.
8. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un
nouveau tube.
9. Ajouter 0.1 volume de 3M NaOAc et 1mL d’ETOH à 99%, bien mélangé par inversion et
centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.
10. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau traitée au DEPC.
11. Déterminer le rendement et la pureté.
Biologie Moleculaire-2017
48
Électrophorèse d’ARN (Groupes de 4) Ayant isolé l'ARN total à partir d'une condition donnée, celui-ci peut être migré sur un gel d'agarose
pour évaluer sa qualité et pour vérifier la correspondance avec le rendement prédit d’après
l'absorbance à 260 nm. Typiquement, les ARN sont séparés en fonction de leur taille sur des gels
dénaturants d'agarose de formaldéhyde. Ce type de gel fournit des conditions dénaturantes qui
empêchent l'appariement de base et de réduire ainsi la structure secondaire de l'ARN. Ceci est
important, car contrairement à des fragments d'ADN double brin, qui ont la même conformation
indépendamment de la longueur, des ARN simple brin peuvent adopter des conformations différentes
en raison de l'appariement de base intra brin. Cela affecterait la migration électrophorétique.
Méthodes :
A. Préparation d’un gel d’agarose au formaldéhyde (Un gel par groupes de 4)
1. Combinez les composantes suivantes pour la préparation d’un gel d’agarose-formaldéhyde de
1.5% (25mL) (en utilisant le peigne à 8 puits):
Tampon MOPS 5X 5mL
H20 15.5mL
Agarose 0.375g
2. Dissoudre l’agarose dans le four à micro-ondes. Laissez refroidir un peu. Ensuite, sous la hotte,
ajoutez 4.5mL de formaldéhyde (solution 37%) (TRAVAILLER DANS LA HOTTE
CHIMIQUE. ATTENTION! VAPEURS VOLATILES). Mélangez en remuant et coulez le
gel immédiatement.
3. Fermer le couvercle et laisser le gel solidifier au moins 30 minutes.
B. Préparation des échantillons d’ARN (Chaque groupe de 2)
1. Afin de préparer les échantillons d’ARN pour la migration sur le gel, chaque groupe de deux
mélangera les composantes suivantes en utilisant des tubes étiquetés SUR GLACE:
Volume final = 30µL
Échantillon d’ARN: µL (Ce volume devrait contenir 5g dans un volume maximum de
9L)
Tampon de chargement: 21µL (Tampon de chargement pour l’ARN et non pas pour l’ADN)
Eau (jusqu’à 30 µl): µL
2. Incubez vos échantillons 10 minutes à 70ºC et ensuite, placez rapidement les échantillons sur
glace. S’il y a du liquide sur le bord du tube, centrifugez quelques secondes.
3. Charger 14µL des échantillons d’ARN sur votre gel.
C. Électrophorèse sur gel 1. Le tampon de migration sera du MOPS 1X. Faire migrer le gel à 80 V (courant de ~ 80 mA)
jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol dépasse la moitié du gel.
2. Enlevez le gel du boîtier d’électrophorèse, examinez sous les UV et prenez une photo.
Notez : Les gels de formaldéhydes sont plus FRAGILES que les gels non dénaturants, faites
très attention!
Biologie Moleculaire-2017
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PRINCIPES DU RT-PCR (Groupes de 2) Une méthode qui est couramment utilisée pour étudier le transcrit dérivé d’un gène est le RT-PCR,
ou une technique dérivé de celle-ci le Q-PCR (PCR en temps réel).
Contrairement aux réactions de PCR traditionnelles, tel que celle que vous avez faite avec
précédemment, le RT-PCR utilise l'ARN plutôt que l'ADN comme matrice. Par contre, puisque
l’ADN polymérase thermostable utilisée dans la réaction de PCR fonctionne seulement avec une
matrice d'ADN, l'ARN doit préalablement être transcrit en ADN. Ceci est accompli par un ADN
polymérase ARN-dépendante, la transcriptase inverse (RT). La transcriptase inverse est utilisée pour
synthétiser un ADN complémentaire (ADNc) simple-brin à partir de l'ARN d'intérêt. Une amorce
oligo dT sera utilisée pour cette réaction. Une fois que l'ADNc a été généré, une réaction de PCR
standard peut être utilisée pour amplifier la séquence d’ADN complémentaire à l’ARNm.
Pour un survol sur la technique de RT-PCR consultez le site web suivant :
http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/RT_PCR.htmL
L'expérience suivante a été conçue pour vous démontrer les principes de la RT-PCR. Nous
examinerons l'expression du gène YRA1 de la levure. Essentiellement, l'ARN total sera isolé des
cellules de levure. Ensuite, tous les ARNm qui sont typiquement polyadénylés seront convertis en
ADNc en utilisant une amorce oligo dT et la transcriptase inverse. Des amorces spécifiques au gène
YRA1 seront ensuite utilisées sur la matrice d'ADNc pour effectuer la PCR à point final. Suite à
l'analyse des résultats obtenus, vous devriez être en mesure de répondre aux questions suivantes:
Les produits d'amplification observés sont-ils dérivés à partir d'ADNc ou d'ADN génomique
contaminant? En d'autres mots est-ce que les produits sont dépendants ou indépendants de la RT?
Est-ce que le gène est exprimé sous les conditions examinées?
Est-ce que le transcrit est modifié?
Isolation d’ARN total (R)
↓
Traitement de l’ARN avec l’ADNase (RD)
↓
Réaction de transcriptase inverse sur l’ARN non-traité (R) et traité à l’ADNase (RD)
↓
PCR de point final
Biologie Moleculaire-2017
50
Méthode :
Étape I : Préparation de l’échantillon d’ARN pour les réactions de RT :
1. Préparer le mélange suivant avec votre préparation d’ARN. Cette dilution sera ensuite utilisée en
tant que source d’ARN pour les réactions qui suivent. Entreposer le restant de votre ARN non
dilué dans votre boite au congélateur jusqu’à la semaine prochaine.
4.0g de votre échantillon d’ARN
5.0L de tampon ADNase 10X
Compléter avec de l’eau pour un volume final de 48L
ÉTIQUETER CET ÉCHANTILLON « R » ; ARN NON TRAITÉ À L’ADNASE
ENTREPOSER LE RESTANT DE VOTRE PRÉPARATION D’ARN NON-DILUÉ DANS
VOTRE BOITE AU CONGÉLATEUR. VOUS EN AUREZ BESOIN POUR DES
EXPÉRIENCES LA SEMAINE PROCHAINE
Étape II : Traitement de l’ARN total avec l’ADNase :
2. Afin de traiter votre ARN avec l’ADNase, préparer le mélange réactionnel suivant :
24L de l’échantillon d’ARN préparé dans l’étape précédente (R)
1L de l’ADNase I
3. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez
l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.
ÉTIQUETEZ CET ÉCHANTILLON « RD »; ARN TRAITÉ À L’ADNASE
Biologie Moleculaire-2017
51
Étape III : Réactions de transcriptase inverse :
4. Préparer les réactions de RT suivantes dans 2 tubes de PCR étiquetés RT-R et RT-RD.
Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chacune des composantes ajoutées.
5. Ajouter 19.0L d’eau DEPC dans chaque tube.
6. Ajouter 4.0L d’amorce oligo-dT à chaque tube.
7. Ajouter 4.0L d’un mélange de dNTP à 2mM à chaque tube.
8. Ajouter 2L de votre ARN non-traité à l’ADNase (R) au tube étiqueté RT-R.
9. Ajouter 2L de votre ARN traité à l’ADNase (RD) au tube étiqueté - RT-RD.
10. Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT en incubant vos mélanges pré-réactionnels de
RT à 70oC pour 5 minutes.
11. Laisser vos tubes refroidir sur votre table de travail pour 5 minutes.
12. Ajouter 8.0L du tampon RT 5X à chacun des tubes.
13. Ajouter 2.0L de DTT à 100mM pour obtenir une concentration finale de 5mM à chacun des
tubes.
14. Ajouter 1.0 L de la transcriptase inverse de MMLV à 200U/L pour obtenir une
concentration finale de 5U/L à chacun des tubes.
15. Incuber à 42oC pour 60 minutes.
16. Inactiver la transcriptase inverse en incubant le mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.
Étape IV : Réactions de PCR :
1. Après les réactions de transcriptase inverse, préparer 5 réactions de PCR avec les matrices
suivantes :
Réaction Matrice Volume à utiliser dans la
réaction de PCR
PCR-1 R (étape I) 1L d’une dilution de 1/20
PCR-2 RD (étape 2) 1L d’une dilution de 1/20
PCR-3 RT-R (étape III) 1L
PCR-4 RT-RD (étape III) 1L
PCR-5 ADN génomique de levure (Fourni) 1L
Ingrédient Conc. mère Conc. finale Vol. pour réaction de 50L
Eau - - L to a final volume of 49L
Tampon Taq 10 X 1X
Matrice (voir ci-dessus) - - 1L
Amorce YRA (For) 2M 0.2M
Amorce YRA (Rev) 2M 0.2M
MgCl2 50 mM 2.0mM
dNTP 2mM 200M
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unité/µL
Amorces :
YRA (FOR) CCCGTGTCGGTGGTACTCGTG
YRA (REV) GTCCGCCATTTCCTTGTCCAGAT
Biologie Moleculaire-2017
52
2. Une fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à l’avant pour
faire la PCR.
3. Vos réactions de PCR vous seront retournées une fois complétées.
Vos PCR seront effectuées sous les conditions suivantes:
i. 1 cycle: 5 min, 94oC pour dénaturer;
ii. 30 cycles: 30 sec, 94oC pour dénaturer; 30 sec, 70oC appariement et extension.
iii. 1 cycle: 5 min, 72oC.
iv. Refroidir à 4oC.
Étape V : Analyse des réactions de RT-PCR
1. Couler un gel d’agarose de 1.5%.
2. Obtenir vos réactions de RT-PCR.
3. Ajouter la quantité appropriée du tampon de chargement d’ADN à 10µL d’échantillon de
chacune de vos réactions.
4. Charger et migrer à 100V.
5. Après la migration, visualiser sous les UV et prendre une photo.
Biologie Moleculaire-2017
53
Exercice 6
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure
RT-PCR
Analyse northern
Biologie Moleculaire-2017
54
Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure (Groupes de 2) Plusieurs conditions influencent l'expression de réseaux de réponses globales qui comprennent
plusieurs gènes régulés de manière coordonnée pour faire face à divers facteurs de stress. L'un de ces
gènes est le gène CTT1 de la levure Saccharomyces cerevisiae, qui fait partie d'un réseau de gènes
protecteur de stress. Le gène CTT1 code pour l'enzyme catalase. La catalase est une enzyme présente
dans les cellules de la plupart des organismes aérobies qui décompose les radicaux libres issus du
métabolisme oxydatif. Plus précisément, la catalase effectue la réaction suivante:
Cette semaine, nous examinerons l'expression de CTT1 au niveau transcriptionnel après un choc
osmotique des cellules de levure. La RT-PCR sera utilisée pour examiner l'expression du gène CTT1
dans des cellules de levures exposées à un choc osmotique pour différentes durées. Afin de comparer
l'abondance relative, et donc l'expression du gène CTT1, une normalisation sera effectuée à un
second gène, un gène domestique, le gène de l’actine. Le gène de l'actine ne fait pas partie du réseau
de gènes de stress global. Donc, son expression devrait demeurer constante. Cette approche
expérimentale sera comparée à une autre méthode, l’analyse northern. Dans ce cas, l'ARN est séparé
sur un gel dénaturant, comme vous l’avez fait la semaine dernière, transférée à un support solide et
ensuite sondée avec des séquences ciblant les transcrits d'intérêt.
Méthode:
1. La semaine passée, chaque groupe de deux a isolé l’ARN total de cultures de levures qui
représentaient une des conditions suivantes:
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.
Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.
Obtenez vos préparations d’ARN de votre boite au congélateur et préparez le mélange suivant. Cette
dilution sera utilisée comme votre source d’ARN pour toutes les réactions subséquentes.
4.0g de votre échantillon d’ARN
5.0L de tampon ADNase 10X
Eau pour un volume final de 48L
2. Préparer le mélange réactionnel suivant afin de traiter votre ARN avec l’ADNase:
24L de la dilution d’ARN préparé dans l’étape 1
1L d’ADNase
3. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez
l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.
2H2O2 2H2O + O2
Biologie Moleculaire-2017
55
4. Préparer la réaction de transcriptase inverse suivante:
Ingrédient Volumes
Eau traitée au DEPC 19L
Oligo dT 4L
2mM dNTP 4L
ARN traité à l’ADNase 2L
Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT par une incubation de votre
pré-réaction de RT à 70oC pour 5 minutes.
Ensuite, laisser vos tubes refroidir lentement sur votre table pour 5 minutes.
Après l’étape d’appariement, ajouter les ingrédients suivants Tampon RT 5X RT 8L
100mM DTT 2L
MMLV 1L
Incubé à 42oC pour 60 minutes. Ensuite, inactiver l’enzyme RT en incubant le
mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.
5. Après la réaction de transcriptase inverse, préparer deux réactions de PCR : une pour
l’amplification de l’actine et une pour l’amplification de CTT1 :
Ingrédient Conc. mère Conc. finale Volumes
Eau - - L à un volume final de 50L
Tampon Taq 10X 1X
Matrice - - 1L d’ADNc de l’étape 4
Amorce d’actine (For)
ou
Amorce CTT1 (For) 2M 0.2M
Amorce actine (Rev)
ou
Amorce CTT1 (Rev) 2M 0.2M
MgCl2 50mM 2.0mM
dNTP 2mM 200M
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unité/µL
6. Une fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à l’avant pour
faire la PCR.
7. Vos réactions de PCR vous seront retournées une fois complétées.
Biologie Moleculaire-2017
56
Analyse des réactions de RT-PCR (Groupes de 4)
1. Couler un gel d’agarose de 1.5% avec le peigne de 10 puits.
2. Obtenir vos réactions de RT-PCR.
3. Ajouter 15µL du tampon de chargement d’ADN 5X à la totalité de chacune de vos deux
réactions de PCR.
4. Chaque groupe de 4 chargera un gel comme suit. Notez, les 4 groupes d’une table donnée
devront partager leurs échantillons entre eux.
Voie Échelle de poids moléculaire
1 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.
2 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.
3 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.
4 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.
5 Vide
6 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.
7 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.
8 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.
9 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.
10 Vide
5. Faire la migration à 100V pour approx. 45 minutes.
6. Après la migration, visualiser sous les UV et prendre une photo.
Biologie Moleculaire-2017
57
Analyse northern Depuis l'avènement de la RT-PCR et de la Q-PCR, l'utilisation d'une analyse de Northern pour
étudier l'expression des gènes a été presque éliminée. Cependant, certaines informations peuvent être
obtenues d'une hybridation northern qui ne peuvent pas être facilement obtenues par des techniques
fondées sur la PCR. Celles-ci incluent l'analyse de la taille et les modifications post
transcriptionnelles. Comme avec l'analyse Southern, l'ARN à analyser est tout d'abord séparé en
fonction de la taille sur un gel d'agarose dénaturant, après quoi il est transféré et sondé. Dans
l'exercice suivant, vous effectuerez une analyse d'un northern qui a été effectuée sur l'ARN isolé de la
levure sous les mêmes conditions de croissance que vous avez utilisée pour la RT-PCR. Vous
pourrez alors comparer les résultats de cette analyse à ceux que vous avez obtenus par RT-PCR.
Méthode : (Notez, ceci doit être compléter durant la période de labo)
1. À votre disposition, sont deux hybridations northern de gels d'ARN duplicata provenant de
cultures de levure soumise à un choc osmotique pour différentes durées. Un des gels a été sondé
avec le gène CTT1 tandis que l'autre a été sondé avec le gène domestique; l’actine. Ces
hybridations sont disponibles sur la page web de ce cours.
2. Utilisez le logiciel ImageJ pour faire l’analyse de chacune de ces hybridations. Suivez le tutoriel
pour l'utilisation d’ImageJ disponible sur la page Web de ce cours. Le programme est disponible
sur le disque dur de votre ordinateur dans le dossier de la semaine 5.
3. Remplir le tableau suivant, puis demander à un de vos aides-enseignants de vérifier que vous
avez accompli la tâche.
Source
d’ARN
Valeurs brutes d’Image J Valeurs de CTT1
normalisées
Expression
relative* CTT1 Actine
0.85M NaCl
0 minute
1
0.85M NaCl
30 minutes
0.85M NaCl
60 minutes
0.85M NaCl
120 minutes
* Indiquer l’expression relative de CTT1 comparativement à l’exposition de zéro minute.
Biologie Moleculaire-2017
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Exercice 7
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Empreintes génétiques
Isolation d’ADN génomique des cellules de joues
Amplification par PCR du VNTR ApoC2
Amplification par PCR du RFLP ApoB
Stringence – Profils de dénaturation d’ADN
Biologie Moleculaire-2017
59
Empreintes génomiques (Groupes de 2) L’analyse de polymorphismes génomiques est devenue chose courante pour identifier des génotypes
de maladies et autres.
VNTR
Le principe de la variation évolutionnaire parmi une population est une des fondations de la biologie.
Ces variations sont le résultat de différences subtiles dans la séquence d'ADN des individus d'une
espèce donnée. Les variations surviennent souvent à cause d'erreurs de duplication de courtes
séquences de nucléotides où seulement qu'une copie était présente avant la réplication. Ceci résulte
en une répétition en tandem de la séquence originale. Si cette erreur survient encore une fois dans
une autre ronde de réplication, alors trois copies de la séquence seront en tandem (figure). Ces
répétitions en tandem font partie de nos chromosomes et sont donc héritées d'après le principe de la
génétique de Mendel. Au cours des siècles, le nombre de répétitions en tandem a augmenté ce qui
fait que chacun d'entre nous a hérité un nombre variable de répétitions en tandem (VNTRs) à
plusieurs loci dans nos génomes. On peut penser à un VNTR comme un loci avec chaque nombre de
répétitions d'une unité particulière étant analogue à différents allèles. Donc, chaque être humain (sauf
pour les vrais jumeaux) possède une combinaison unique de VNTRs et ces allèles peuvent être
utilisés dans les études de populations ou pour identifier un individu particulier.
Figure. Illustration du nombre de répétitions en tandem variable (VNTRs). Un simple brin d'ADN
du même locus de trois différents individus est montré. Dans cette région, le trinucléotide répété
CAT est présent une, deux ou trois fois ce qui donne des allèles de trois différentes longueurs.
RFLP
Un autre type de polymorphisme qui survient est appelé un polymorphisme de restriction de longueur
(RFLP). Ces polymorphismes surviennent quand un nucléotide unique est changé dans un site de
restriction, ce qui l'abolit ou le change. En conséquence, une région donnée du génome peut avoir un
site de restriction qui est absent dans la même région d'une autre copie du génome ou dans le génome
d'un autre individu.
Biologie Moleculaire-2017
60
Isolation d’ADN génomique des cellules de joues:
1. Une personne de chaque groupe de deux devrait utiliser un écouvillon stérile afin de se frotter
l’intérieur d’une des joues six fois. Sans tourner l’écouvillon, le déplacer de l’autre côté et frotter
l’intérieur de l’autre joue six fois.
2. Placer la portion de coton de l’écouvillon dans un tube de microcentrifuge de 1.5mL. Ensuite,
briser la tige juste au-dessus du coton pour qu’il tombe dans le tube.
3. Ajouter 400µL de PBS 1X pH 7.4 dans le tube.
4. Ajouter 20µL de protéinase K puis 400µL du tampon AL. Mélangé immédiatement au vortex
pour 15 secondes. Ne pas ajouter la protéinase K directement au tampon AL.
5. Incuber à 56oC pour 10 minutes. Centrifuger brièvement pour récolter le liquide sur les parois.
6. Ajouter 400µL d’éthanol à 99%. Mélanger sur le vortex pour 8 à 10 secondes. Centrifuger
brièvement pour récolter le liquide sur les parois.
7. Appliquer 600µL de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols et
centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube de collecte.
8. Appliquer le restant de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols
et centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube de collecte.
9. Ajouter 500µL du tampon AW1. Fermer et centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube
de collecte.
10. Ajouter 500µL du tampon AW2. Fermer et centrifuger à vitesse maximale pour 3 minutes.
Changer le tube de collecte.
11. Centrifuger à vitesse maximale pour 1 minute afin de retirer le tampon résiduel et prévenir le
transfère.
12. Placer une colonne QIAprep dans un nouveau tube de 1.5mL de microcentrifuge duquel vous
avez coupé le capuchon. Ajouter 150µL du tampon AE à la colonne. Attendre 1 minute puis
centrifuger à 8k rpm pour 1 minute afin d’éluer.
13. Transférer l'ADN élué à un nouveau tube de microcentrifuge étiqueté et entreposé pour une
utilisation ultérieure.
Biologie Moleculaire-2017
61
Amplification par PCR du VNTR d’ApoC2 et du RFLP d’ApoB Les groupes pairs amplifieront le RFLP d’ApoB
Les groupes impairs amplifieront le VNTR d’ApoC2
Méthode:
Préparer vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50L. Dans des tubes de PCR
étiquetés (utiliser des tubes de PCR de 200L à paroi mince) ajouter les ingrédients suivants dans
l'ordre indiqué dans le tableau ci-dessous. Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chaque
composante. Notez: la polymérase Taq sera ajoutée par les A.E.
Ingrédients Conc. mère Conc. Finale Volume
Eau Compléter à 50µL
Tampon de PCR Taq 10X 1X
Amorce ApoB For ou D1S80 For 2µM 0.2µM
Amorce ApoB Rev ou D1S80 Rev 2µM 0.2µM
MgCl2 50mM 2.0mM
dNTP 2mM 200µM
ADN Génomique de joue 5µL 5µL
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL
Une fois que vous aurez complété l'assemblage de votre réaction, donnez là à votre aide enseignant.
Conditions d'amplification par PCR:
1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer;
2. 35 cycles de 30sec, 94oC dénaturer; 30sec, 55oC (ApoB) ou 65oC (ApoC2) appariement;
1min, 72oC extension.
3. 1 cycle de 5min, 72oC.
4. Refroidir indéfiniment à 4oC.
Analyse des empreintes génomiques
Gène ApoB:
1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoB.
2. Dans le cas du gène ApoB, utiliser 10µl de la réaction de PCR pour préparer une digestion par
enzyme de restriction avec l'enzyme EcoRI dans un volume final de 20µl.
3. Un groupe de la classe préparera aussi un témoin non digéré.
4. Après avoir fait la digestion pour une heure, ajoutée du tampon de chargement et chargée sur le
gel précoulé.
5. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise.
Gène ApoC2 1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoC2.
2. Ajouter du tampon de chargement à un échantillon de 10µl de votre réaction de PCR.
3. Charger sur le gel précoulé.
4. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour
votre analyse.
Biologie Moleculaire-2017
62
Stringence Ce paramètre décrit la mesure dans laquelle un appariement peut se produire entre des brins d'acides
nucléiques dans des conditions ambiantes données. Des conditions de haute stringence exigent un
degré élevé de complémentarité entre les molécules, alors que des conditions de faible stringence
permettent un appariement, même s'il y a des bases mésappariées. En règle générale, les conditions
de haute stringence sont obtenues soit en réduisant la concentration de NaCl ou en augmentant la
température. Une faible stringence est obtenue en augmentant la concentration de NaCl ou en
diminuant la température. Le niveau de stringence peut être modifié en ajustant la température, la
concentration du sel ou d'autres produits chimiques qui influencent la température de fusion des
hybrides d'acide nucléique.
Ce concept peut être illustré par la formule suivante: Notez que le pourcentage de paires de bases G:
C a un impact direct sur le point de fusion (Tm) des hybrides d'acide nucléique. En dessous du Tm,
des hybrides d'acide nucléique à deux brins seront favorisés. Par contre, au-dessus du Tm, l'état
simple brin sera favorisé. Par conséquent, toute condition environnementale (ou chimique) qui réduit
le Tm augmentera la stringence.
Tm = 81.5 + 16.6 (log M [Na+]) + 0.41 (%G+C/100) – 0.72 (% formamide) – 500/n – (% mésappariement)
M : molarité d’ions monovalents positifs
n : Longueur en base de l’acide nucléique
Par exemple, déterminons le Tm d'une molécule d'acide nucléique de 1 kb qui est 50% G : C en
présence de 0.1 ou 0.2M de NaCl.
Tm (0.1M NaCl) = 81.5 + 16.6 (log 0.1) + 0.41 (0.5) – 0.72(0) – 0.5 = 84.9oC
Tm (0.2M NaCl) = 81.5 + 16.6 (log 0.2) + 0.41 (0.5) – 0.72(0) – 0.5 = 89.9 oC
Par conséquent, à 68oC un état double brin serait favorisé à 0.2M NaCl, mais l'état simple brin serait
favorisé à 0.1M NaCl. Ainsi le NaCl a réduit la stringence en augmentant la valeur du Tm et donc la
température maximale à laquelle l’état double brin peut être maintenu.
Stringence - Profils de dénaturation de l’ADN (Groupes de 2) L'hyperchromicité ou effet hyperchrome est la propriété des polymères biologiques, et en particulier
l'ADN et l'ARN, de voir leur absorption dans l'UV augmenter lorsqu'ils subissent une dénaturation.
Cette propriété est couramment utilisée en biologie pour analyser par spectrophotométrie la
structuration des acides nucléiques en fonction de paramètres physico-chimiques (température, pH,
ions...). L’hyperchromicité peut être utilisée pour suivre l'état de l'ADN en fonction des changements
de température.
Biologie Moleculaire-2017
63
Dans cet exercice, nous examinerons l’effet de différentes conditions environnementales sur le profil
de dénaturation d’ADN génomique. Spécifiquement, vous déterminerez le Tm en fonction de
différents paramètres physico-chimiques : la température, concentration de formamide,
concentration d’urée et la concentration d’ions positifs.
Matériaux :
Blocs chauffants réglés à 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 et 95oC
ADN génomique de sperme de saumon (50µg/mL)
1M NaCl
1M MgCl2
100% Formamide
50% Urée
Méthode :
1. Chaque groupe sera assigné un des composés chimiques ci-dessus. Préparer 9 solutions de
500µL à une concentration finale d’ADN de 5µg/mL et une concentration finale du composé
chimique assigné indiquée ci-dessous :
0.25M NaCl
0.25M MgCl2
25% Formamide
25% Urée
2. Incuber pour 5 minutes chacun des huit mélanges aux températures indiquées ci-dessus dans les
blocs chauffant préréglés.
3. Garder le neuvième mélange à la température de la pièce.
4. Après l’incubation, rapidement refroidir sur glace chacun des huit mélanges.
5. Distribuer 200µL de chacun des mélanges dans une plaque de 96 puits tel qu’indiqué ci-dessous.
6. Une fois que la plaque aura été chargée, l’absorbance à 260nm sera déterminée.
Plan de la plaque d'essai d'ADN
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 1
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 2
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 3
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 4
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 5
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 6
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 7
220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 8
Biologie Moleculaire-2017
64
EXERCICE 8
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Expression protéique
Préparation d’extrait de protéines
Quantification des protéines - Essai Bradford
Électrophorèse sur gel de protéines
Biologie Moleculaire-2017
65
Expression protéique (Groupes de 2) Tout au long du semestre, nous avons examiné différentes techniques utilisées en biologie
moléculaire pour analyser l'ADN et l'ARN. Cette semaine, nous allons voir l'une des techniques les
plus couramment utilisées pour étudier les protéines exprimées dans un organisme. Plus précisément,
nous allons comparer le profil protéique dans les tissus musculaires de différents organismes. Chaque
groupe sera assigné des échantillons de tissus musculaires provenant de différents organismes.
Préparation d’extraits de protéines
1. Suspendre l’échantillon de tissu dans 500µL de tampon de lyse (62.5 mM, pH 6.8, 2% SDS).
2. Transférer la suspension à un tube avec un capuchon à vis qui contient des billes de verres.
3. Mélanger au vortex pour 1 minute puis refroidir sur glace pour 1 minute.
4. Répéter l’étape précédente 3 fois.
5. Centrifuger 10 minutes à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse.
6. Transférer le surnageant à un nouveau tube et garder sur glace pour une utilisation ultérieure.
Essai de protéines de Bio-Rad Cette méthode fondée sur celle de Bradford, est utilisée pour la détermination de la concentration de
protéines solubilisées. Elle implique l’ajout d’un colorant acide à la solution de protéine, après quoi
des mesures au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 595nm sont faites. Une comparaison à
une courbe étalon permet ensuite d’obtenir une mesure relative de la concentration de protéines.
Matériaux
Colorant
ASB 5mg/mL
Méthode :
1. Préparer 200µL de chacune des solutions de référence protéiques d’ASB à des concentrations de
0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 et 1.0mg/mL.
2. Préparer des échantillons de 200µL des extraits protéiques représentant des dilutions de 1/4 et
1/10.
3. Pipetter 20μL de chacune des solutions de référence et de chacune des dilutions des extraits de
protéines dans des tubes de microcentrifuge étiquetés de façon appropriés.
4. Ajouter 400μL du colorant dilué à chaque tube. Mélanger au vortex pour 2-3 secondes.
5. Incuber à la température de la pièce pour au moins 15 minutes.
6. Charger 200μL de chacun des mélanges réactionnels dans une plaque de 96 puits tel qu’illustré
ci-dessous.
7. Obtenir les lectures d’absorbances à 595nm.
Plan de la plaque pour l’essai de Bradford
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 1
0 1/4 1/10 Protéine
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 2
0 1/4 1/10 Protéine
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 3
0 1/4 1/10 Protéine
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 4
0 1/4 1/10 Protéine
Biologie Moleculaire-2017
66
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE SDS POLYACRYLAMIDE Une méthode courante pour la séparation des protéines par électrophorèse utilise un gel de
polyacrylamide discontinu, en tant que milieu de support et du sulfate de sodium dodécyle (SDS)
pour dénaturer les protéines. Le SDS est un détergent anionique, ce qui signifie que lorsqu'il est
dissous ses molécules ont une charge négative. Une chaîne polypeptidique se lie à des quantités de
SDS en proportion à sa masse moléculaire relative. Les charges négatives du SDS détruisent la
majeure partie des structures complexe des protéines, et sont fortement attirées vers l'électrode
positive dans un champ électrique. Les gels de polyacrylamide préviennent les plus grosses
molécules de migrer aussi vite que des molécules plus petites. Parce que le rapport charge-masse est
presque le même chez les polypeptides SDS-dénaturées, la séparation finale des protéines dépend
presque entièrement sur les différences de masse moléculaire relative de polypeptides. Dans un gel
de densité uniforme, la distance de migration relative d'une protéine négative est proportionnelle au
logarithme de la masse. La séparation des protéines par SDS-PAGE peut être utilisée pour estimer la
masse moléculaire relative, l'abondance relative des principales protéines dans un échantillon, et de
déterminer la répartition des protéines entre les fractions.
Matériaux
Tampon de Laemmli 2X (4% SDS, 20% glycérol, 125mM Tris pH 6.8, 0.004% bromophénol bleu)
Extrait de protéines préparées précédemment
Standards de poids moléculaire protéiques
Méthode :
1. Préparer votre échantillon de protéine pour le chargement sur le gel de SDS PAGE comme suit :
Volume final = 10µL
Échantillon de protéine: µL (Ce volume devrait contenir 20g dans un volume maximum de
5L)
Tampon de chargement: 5µL Tampon de chargement Laemmli 2X
Eau (jusqu’à 5µl): µL
2. Chauffer pour 10 minutes à 70oC, puis refroidir sur glace. Centrifuger pour 1-2 secondes.
3. Charger la totalité de l’échantillon sur le gel de SDS PAGE de 10% précoulé.
4. Faire la migration à 200V pour approximativement 30-40 minutes.
5. Une fois la migration terminée, désassembler et placer le gel de résolution dans la solution de
coloration de coomasie.
6. Chauffer au microonde pour 1 minute, puis agiter sur la berceuse pour 10-20 minutes.
7. Remplacer la solution de coloration par la solution de décoloration.
8. Chauffer au microonde pour 1 minute, puis agiter sur la berceuse jusqu’à ce que les bandes soient
clairement visibles.
9. Déverser la solution de décoloration et la remplacer avec de l’eau distillée.
10. Prendre une photo.
Biologie Moleculaire-2017
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Solution de coloration
0.5g Coomassie Brilliant blue R 250
800mL méthanol
Mélanger jusqu’à dissolution, puis ajouter 140 mL d’acide acétique
Compléter à 1L avec de l’eau
Solution de décoloration
40% méthanol
7% acide acétique
Ce qui suit est une liste des protéines commune à tous les tissus musculaires animaux, adapté d’Alberts
et al. 1994.
Protéine MW (en kD) Fonction
Titine 3000 Centre la myosine dans le sarcomère
Dystrophine 400 Ancrage à la membrane
Filamine 270 Crés liens croisés des filaments d’actine en gel
Chaine lourde de myosine 210 Glissement des filaments d’actine
Spectrine 265 Attache les filaments d’actine à la membrane
M1/M2 190 Produit de dégradation de la myosine
M3 150 Produit de dégradation de la myosine
Protéine C 140 Produit de dégradation de la myosine
Nébuline 107 Contrôle l’assemblage de l’actine
A-actinine 100 Crés faisceaux de filaments d'actine
Gélsoline 90 Fragmente les filaments d’actine
Fimbrine 68 Crée faisceaux de filaments d'actine
Actine 42 Forme les filaments
Tropomyosine 35 Renforce les filaments d’actine
Troponine (T) 30 Contrôle la contraction
Chaine légère de myosine 24, 17, 15 Glissement des filaments d’actine
Troponine (I) 19 Contrôle la contraction
Troponine (C) 17 Contrôle la contraction
Biologie Moleculaire-2017
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Annexes
Biologie Moleculaire-2017
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Acide aminé Code de 3 lettres Code d'une lettre
alanine ala A
arginine arg R
asparagine asn N
acide aspartique asp D
asparagine or acide aspartique asx B
cystéine cys C
acide glutamique glu E
glutamine gln Q
glutamine or acide glutamique glx Z
glycine gly G
histidine his H
isoleucine ile I
leucine leu L
lysine lys K
méthionine met M
phénylalanine phe F
proline pro P
serine ser S
thréonine thr T
tryptophane try W
tyrosine tyr Y
valine val V
Biologie Moleculaire-2017
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Conversions Spectrophotométrique
1 unité A 260 d'ADN double brin = 50 µg/mL
1 unité A 260 d'ADN simple brin = 33 µg/mL
1 unité A 260 d'ARN simple brin= 40 µg/mL
Conversion Protéine/ADN
ADN de 1 kb → 333 acides aminés
→ Protéine de 37 kDa
Poids moléculaire moyen d’un acide aminé ≈ 110 daltons
Dalton (Da) est un nom alterne pour l’unité de masse atomique, et kilodalton (kDa) est
1,000 daltons. Donc une protéine avec une masse de 64 kDa à un poids moléculaire de
64 000 grammes par mole