Méthodes moléculaires en Microbiologie M1 nutraceutique UE9 Gestion du risque microbiologique 4...

Méthodes moléculaires en Microbiologie

M1 nutraceutiqueUE9 Gestion du risque microbiologique

4 mars 2009

Emmanuel BERTRAND

Besoins

Contraintes industrielles

Marché de l’analyse Microbiologique

Intérêt des outils de biologie moléculaire

Méthodes moléculaires

Exemples :• Secteur Agro-alimentaire : Détection• Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification• Secteur environnement : Quantification• Secteur vétérinaire : Screening

• Autres technologies

1- Besoins

A chaque secteur d’activité correspond une demande

particulière.

- Secteur Agro-alimentaire : Détection- Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification- Secteur environnement : Détection et Quantification- Secteur vétérinaire : Screening et Détection

1- Besoins – Secteur Agro-alimentaire

Détection (ex. Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli

O157:H7,…)

- Savoir si le produit est propre à la consommation

- Besoin d’avoir un résultat le plus rapidement possible

- Utiliser des outils accrédités

- Méthodes standardisées pour tous types de matrices et de

pathogènes

- Coûts d’analyse < 5€ (PCR) et < 1€ (Bactériologie classique)

Présence et Identification

- Savoir si le produit contient des micro-organismes

- Déterminer le genre et l’espèce du contaminant

- Pas de contraintes de temps d’analyse

- Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un

cadre normatif

- Coûts d’analyse > 50€

1- Besoins – Secteur Pharma/Cosmétique

Détection et quantification

- Recherche d’un genre et/ou d’une espèce

- Quantifier la flore recherche

- Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique)

cadre normatif

- Coûts d’analyse = 30€

1- Besoins – Secteur Environnement

Détection et Screening

- Recherche d’une espèce et/ou identification du sérotype

- Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique)

cadre normatif

- Coûts d’analyse = 20€

1- Besoins – Secteur Vétérinaire

2- Contraintes industrielles

Risque sanitaire potentiellement élevé en raison des volumes

produits

Une crise sanitaire = Coûts élevés voir une fermeture de site

Le coût d’analyse est fonction du PRI du produit

Le temps d’analyse (TTR) est déterminé par la durée de vie

du produit et les coûts de stockage

En fonction des secteurs d’activité, les niveaux d’expertise

sont très disparates.

Agroalimentaire < Vétérinaire < Pharma/Cosmétique

2- Contraintes industrielles - Matrices

Les outils doivent être adaptés pour une large gamme de matrices- Agroalimentaire : Produits carnés, ovo produits, produits

laitiers, produits de la mer, végétaux, …- Pharma/Cosmétique : Poudres, détergents, principes actifs, …- Environnement : Eaux, air, surfaces, …- Vétérinaire : Sang, organes, fèces, urines, …

Implique :- Robustesse vis-à-vis des agents inhibiteurs de PCR contenus dans les matrices (sels, détergents, phénol, matières grasses, colorants, nombreux facteurs protéiques, antibiotiques, …)- Protocoles adaptés aux différents types de matrices (Liquides, solides, gazeuses, …)

Prises d’essais standardisées ?- 25g de matrices (Matrices alimentaires)- 100mL à 1L de liquide (Matrices environnementales)- Véto: adaptées en fonction du statut de l’infection (sang,

organes, urines, lait, …)- Pharma/cosméto : adaptées en fonction de l’état physique

de la matrice et des normes internationales

L’enrichissement est nécessaire en dehors d’un statut d’infection

(à l’exception des eaux).

2- Contraintes industrielles – Prises d’essais

1- Marché de l’analyse microbiologique

801 M$109 M tests

Volume et valeur marché global

Sur le plan mondial les méthodes immunoassay (PDM 35%) sont devant la PCR (PDM 10% = 15M tests)

Méthodes utilisées sur le marché mondial

Pathogènes 2005 Pathogènes 2010

Méthode traditionelle 62Mtest (56,5%)

Immunoassay

37,8Mtest (34,4%)

10Mtest (9,2%)

Fast Slow

Méthode traditionelle 64,7Mtest (44%)

Immunoassay

57,3Mtest (39,4%)

25Mtest (17,1%)

110M tests

Croissance mondiale PCR +150% de 2005 à 2010

Tendance et demande marché sur Diagnostic microbiology Food

Performance désirée

En 2000 = sensibilité méthode et robustesse

Depuis 2005

Rapidité des tests (83%) tendance TTR 24h

Reconnaissance méthode

Diminution des coûts par test

Augmentation du nombre de tests

(pression client et réglementaire)

Tendance future 2010

Reconnaissance méthode

Ultra Rapidité des tests tendance TTR <24h, 8h

Diminution des coûts par test

Simplification méthode

2- Intérêts des outils de biologie moléculaire

Avantages :

- Sensibilité > méthodes traditionnelles- Spécificité - TTR (Time to result) < méthodes traditionnelles- Automatisation possible

Inconvénients :

- Coûts- Praticabilité- Robustesse

Utilisation actuelle :

- Diagnostic d’urgence, de libération- Suivis de site (TAR, surface,…)- Suivi du produit dans son process de fabrication- Identification bactérienne

Utilisation souhaitée :

- Analyses de routine

Immuno

Méth. référence

ATP métrie

Méth. référence

Immuno

Méth. référence

Immuno

Méth. référence

Détection de E. coli O157:H7

Détection de Legionella pneumophila

24h 24h

240h (10 jours) …

720h (30 jours) …

Détection de Mycoplasma spp

Détection de Mycobacterium paratuberculosis

24h 3h24h 5h

…504h (21 jours)

amorce

40 cyclesB) Amplification du signal

A) Spécificité du signal

gène cible

A) Trouver "une aiguille dans une botte de foin".B) Photocopieuse à ADN.

Pour 1 copie initiale on obtient en fin de PCR k.2n copies au final.240 = 1012 copies

3- Méthodes moléculaires

PCR Temps réel (vs PCR classique) Détection Quantification SuiviMarchés : Agroalimentaire et environnement

Identification (PCRs, Séquençage, Puces,…)Marchés : Pharmaceutique et cosmétique

PCR conventionnelle versus PCR quantitative

PCR conventionnelle

PCR quantitative

Pièce n°1 Pièce n°2

3- Méthodes moléculaires – Détection

PCR conventionnelle versus PCR quantitative

Le résultat :

PCR conventionnelle PCR quantitative

M A B C

- PV automatique- Sauvegarde informatique de l’analyse et du résultat

La PCR quantitative

Il existe plusieurs types de marquage

- Marquage non spécifique

- Marquage spécifique

- sondes d’hydrolyse

- sondes d’hybridation

- Le choix des chimies s’effectue en fonction :- des licences- du coût- de l’application

Marquage non spécifique

La chimie SyBr Green®

-Marquage non spécifique de l’ADN double brin- Augmentation du signal x1000 quand la molécule est liée-Produit par Molecular Probe-Possibilité réduite pour faire du multiplexage

• Colorants non spécifiques• Se lient à l’ADN double brin (au

niveau du petit sillon)• Ne fixe pas l’ADN monobrin

– SYBR Green (x10,x25 plus sensible que le BET)

– Bromure d’éthidium• Souvent utilisé pour les courbes de

fusion

Intercalants de l’ADN3- Méthodes moléculaires – Détection

• Les sondes d’hydrolyse• Les sondes d’hybridation• Les amorces fluorescentes

Importance du moment de l’enregistrement du signal

Les sondes marquées3- Méthodes moléculaires – Détection

Les sondes marquées

« Reporter » « Quencher »

ion Fluorescence

475 550

R = FAM

nm550 600

ion Fluorescence

Q = TAMRA

Les sondes marquées

Eloignement

« Quenching »

• Utilisation d’une Taq polymerase avec une activité exonucléasique

• La sonde s’hybride avec la cible

• La polymerase clive la sonde

• Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal.

Système Taqman®3- Méthodes moléculaires – Détection

Technologie des sondesTaqMan® MGB

- MGB : Minor Groove Binder

- Sonde courte , Tm élevé

Technologie des sondes LNA

• LNA : Locked Nucleic Acids

• Bases nucléotidiques modifiées.

• Présence d’un groupement méthylène

• Augmentation du Tm• Utilisés pour :

– Taqman– FRET– Molecular Beacons

• Configuration en épingle à cheveu

• Hybridation avec la cible pendant la phase d’élongation

• Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal

• Utilisés dans les kits IQ-Check, ADIAFood,…

Molecular beacons3- Méthodes moléculaires – Détection

• Fluorescent Resonance Energy Transfer

• Utilise deux sondes marquées

• L’énergie est transferrée entre les deux sondes marquées

• Technologie Roche

FRET3- Méthodes moléculaires – Détection

Scorpions ®3- Méthodes moléculaires – Détection

Quantification absolue

-Quantification avec une gamme étalon.

-Sur un même run PCR on analyse l’échantillon en même temps

que la gamme étalon.

-Pour plus de justesse, l’étalon doit être de même nature (ADN

génomique, plasmide, ARN, …) que la cible.

3- Méthodes moléculaires – Quantification

Quantification absolue

Equation de la gamme étalon : y = -3.49.Log(X) + 36.75Le Ct de l’échantillon est de 22.38 soit 13100 copies initialement présentes dans l’échantillon.La quantité peut être massique ou en copie, UG (unité génomique)…

2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102

3- Méthodes moléculaires – Quantification

L’identification

3- Méthodes moléculaires – Identification

Les techniques dérivées de la PCR

Nested PCR

-1ère PCR « consensus » du gène cible (ex. Genre)-2ème PCR « spécifique » de la cible recherchée (ex. Espèce)-Augmentation de la sensibilité-Risque de contamination

3- Méthodes moléculaires - Identification

PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

-Utilisation du polymorphisme des sites de restriction

Listeria monocytogenes

Listeria ivanovii

Escherichia coli O157H7

BglII BamHI

HindIII

BglII + BamHI BglII + SalI

Produit de PCR

Multiplex PCR

M. synoviae (FAM) M. gallisepticum (Cy5) IPC (HEX)

Exemple : Triplex Mycoplasmes aviaires (ADIAVET)

Ce système permet l’amplification de plusieurs cibles dans un même tube réactionnel.Le mix comprend :-1 à plusieurs jeux d’amorces -Une sonde par cible-Attention aux compétitions et au choix des fluorophores

PCR RAPDPolymorphisme d’amplification des génomes

Individu A Individu B

Le séquençage

- Séquençage automatisé- Haut débit- Niveau d’expertise moyen- Equipement lourd- Utilisé par le Pharma/Cosméto/Prestataires de service

Le séquençage

Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement

Le Pyroséquençage

Biotage

Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement

- Faible débit d’analyse- Niveau d’expertise moyen- Coûts moyens - Utilisé par le Pharma/LNR/Prestataires de service

Le Pyroséquençage

Les puces

Les puces : Macroarray (Faible débit)

- Matériel de base- Niveau d’expertise moyen- Utilisée par certains LVD et LNR

- Taille des spots : 100µm- 1000 à 10 000 spots/cm²- Colorimétrie ou fluorescence

Préparation de l’échantillon

Enrichissement facultatif

Extraction et purification

Reverse Transcription

Analyse sur puce

Les puces : Microarray spottée (Haut débit)

- Equipement lourd- Niveau d’expertise élevé- Qqs Laboratoires prestataires maîtrisent cet outil

- Taille des spots : 100µm- 1000 à 10 000 spots/cm²- Fluorescence

Analyse sur puce

Les puces : GeneChips Affimetrix

Analyse sur puce

- Equipement lourd- Niveau d’expertise élevé

- Taille des spots : 20µm- 250 000 spots/cm²- Fluorescence

- Risques de contamination

- Risques d’inhibitions

Faux positifs

Faux négatifs

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

Les faux positifs

-Peuvent intervenir à tous les stades de la PCR :

-Préparation de l’échantillon

-Préparation du mélange pré-PCR

-Ajout de l’échantillon

ADN amplifié : quel risque ?

100 µl de produits amplifiés= 1012 copies d’ADN

Bassin olympique(50 x 25 x2)

100 µl =400 copies d’ADN

Les contaminations inter échantillons

- Lors de la préparation des échantillons

- Lors de la détection

Comment décontaminer ?

-Isopsoralen

-Eau de javel

-Produits commerciaux

-Système Uracyl-N-Glycosylase / dUTP

Par Irradiation

Inactivation par utilisation de l’UNG

Les faux positifs : les contrôles

-Lors de la préparation de l’échantillon (lyse cellulaire) : contrôle négatif d’extraction

-Lors de la préparation du mélange d’amplification : contrôle négatif d’amplification

Absence de faux positifs

Les faux négatifs

Origines

-Erreur dans le mélange pré-PCRoudysfonctionnement du thermocycleur

- Présence d’inhibiteurs dans l’échantillon

Solutions

-Contrôle positif d’amplification

- Contrôle interne d’amplification

Absence de faux négatifs

Le contrôle interne

-Un contrôle interne est une molécule d’ADN ou d’ARN qui va être amplifié en même temps que la cible recherchée

-contrôle interne d’amplification

-contrôle interne de purification

-contrôle interne d’extraction

3- Méthodes moléculaires - IPC

Le contrôle interne

IPC Type Moment d'ajout Contrôle

Contrôle interne d'amplification

ADN génomique, Plasmide, Nucléotide

Présent dans le mix PCR

Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR

Contrôle interne de purification

ADN génomique, Plasmide, Nucléotide

Ajouter lors de l'étape de lyse ou de purification

Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification

Contrôle interne d'extraction

ADN de l'échantillon (Cellules hôtes, tissus,…)

Contenu dans l'échantillon

Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification, de l'efficacité de lyse sur l'échantillon.

Le contrôle interne : Construction

la molécule d ’ADN cible

Modification de la molécule d ’ADN cible

Co-amplification des deux molécules avec les mêmes amorces

Mélange PCR Hybridation Amplification

Le contrôle interne : Construction (2)

3- Méthodes moléculaires - Compétition

Compétition

Contrôle interne 500 pb

Cible PCR 221 pb

Quantité constante de contrôle interne = 2000 molécules

Quantité croissance de bactéries de 0 à 106

0 10010 103 104 105 1061

3- Méthodes moléculaires - Compétition

Compétition

Cas d’une PCR où la cible et l’IPC sont co-amplifiés avec le même couple d’amorces mais une sonde différente.

Cible marquée en FAM IPC marqué en VIC

3- Méthodes moléculaires - Normalisation

R : sans normalisation

dRn : avec normalisationSignal fluorescent normalisé par une référence fluorescente passive

Echantillon 1

Echantillon 2

reporter (Fam)

Référence passive (Rox)Rn =

Intérêt de la normalisation :

-Harmonisation pour le positionnement du Threshold

-Quantification absolue et relative

4- Exemples – Secteur Agroalimentaire

- Recherche de E. coli O157:H7 en viande hachée- Seuil de détection 1 UFC/25g matrice

Production Transformation Distribution Consommation

2 – 10 jours5 – 10 jours (temps de maturation)

Enrichissement

1CFU dans 25g

Croissance sélective

Enrichissement

1 jour

Etape 1Enrichissement

Etape 2Extraction d’ADN

Etape 3 Amplification ADN & analyse

Collecte de l’échantillon

BroyageMilieu d’enrichissement

(225mL)

Incubation (8h)

Etape 1 : ENRICHISSEMENT

Etape 2 : EXTRACTION

Lyse thermique (10 à 30 minutes 95°C) Lyse physique : Broyage, sonication, … Lyse chimique avec détergents ou résines (avec ou non une incubation) Lyse enzymatique (Protéinase K, Lysozyme,…) avec une étape d’incubation

Le choix de la lyse : en fonction du pathogène recherché Pour certains pathogènes, on a recours à différentes méthodes de lyse Des étapes de clarification et de concentration peuvent être ajoutées en fonction de la matrice et de la vitesse de croissance bactérienne

Prélèvement de 1ml de bouillon

Centrifugation 2min à 500g

Prélever 500µL du surnageant

Eliminer le surnageant Reprendre le culot dans 100µL Tp lyse

Utilisation de tubes au format 96

Etape 2 : EXTRACTION

Centrifugation 5min à 5000g

Mix PCR Distribution (15µL)

Transfert 10µL ADN extrait

Etape 3 : DETECTION

Etape 4 : Analyse

En dehors d’expertise dans les IAA, l’analyse des données ne doit pas être fonction du facteur humain.

4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto

- Recherche de germes dans une crème de soin- Altération du produit- Santé du consommateur

Dilution au 1/10 en milieu liquide

Etape 1 : ENRICHISSEMENT

Incubation (24h)

Etape 2 : Filtration

Filtration de 10 à 100mL sur membrane (porosité de 0.45µm)

Etape 3 : Extraction et purification

Récupération des cellules collectées sur la membrane

Lyse à l’aide d’automate Purification sur colonne de Silice

Etape 4 : Amplification

Préparation des mix PCR en automate

Amplification de l’ADN extrait avec des amorces universelles pour Eucaryotes et Procaryotes (16S, 23S, …). Détection par électrophorèse ou par fluorescence non spécifique (SybrGreen)

Si présence

Etape 5 : Séquençage

Préparation des mix PCR avec Dyes pour le séquençage

Amplification et détection Obtention du spectre

Etape 6 : Analyse de séquence

Extraction de la séquence Interrogation des banques de données

Identification

4- Exemples – Secteur Environnement

- Détection Legionella pneumophila et Quantification de Legionella spp- Legionella spp est un indicateur de présence de Legionella pneumophila- La présence de L. pneumophila entraine une action curative immédiate- Réglementation sur la quantité de L. spp / Litre

- si < 1000 UFC/litre = pas d’action- si compris entre 1000 et 10 000 UFC/litre = Action curative- si > 100 000 UFC/litre = fermeture du site

PrélèvementFiltration de 100mL à 1L sur membrane (porosité de 0.45µm)

1ml Tampon de lyse LB

Ajouter la membrane pliée

Incubation 20 min à 95°C

Vortexer 15sLaisser à T° ambiante

Déposer 550µl de lysat dans la colonne « Cleaning unit »

Centrifugation 3 min à 7000g

1ère Etape : Lyse

2ème Etape : Clarification

Déposer 500µl de filtrat dans la colonne

Ultrafiltration Lavage

200µL de Tampon CB1

Compléter à 100µl avec le Tampon CB2

Stocker à +4°C ou à -20°C

Lavage

200µL de Tampon CB1

3ème Etape : Purification et Concentration

Réalisation d’une gamme étalon d’ADN génomique de L. pneumophila Run PCR avec en parallèle la gamme et les échantillons

2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102

4- Exemples – Secteur Vétérinaire

Diagnostique de la Fièvre Catarrhale Ovine Recherche du virus (Sentinelle) Identification du sérotype (Campagne de vaccination)

Novembre 2007 Novembre 2008

Préparation du prélèvement (Sang sur EDTA)

Extraction et purification de l’ARN

PCR avec Mix de Groupe

Si l’échantillon est positif en Groupe, il faut alors le typer

PCR avec Mix de Type

Détermination du sérotype

5- Autres technologies

Cibles : Génome Transcriptome Protéome Phénotype

Cytométrie en flux : sur la cellule entière

Marqueurs de viabilité (substrats couplés à des fluorophores : FITC, …) Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Très rapide Coûts élevés

Puces à Protéines, Peptides, Anticorps

Principe basé sur le test ELISA Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Rapide Coûts fonction du nombre de spots

Spectromètrie de masse

Reconnaissance en partie du Protéome Avec ou sans électrophorèse 2D Analyse de spectres En vogue Coûts élevés

Biolog : Analyse du phénotype

Reconnaissance par le métabolisme Plaques 96 contenant différentes sources (sucres, sulfates, …)

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