Réactions complexes, en plusieurs étapes: Compatibles avec léquation de Michaelis et Menten?

Réactions complexes, en plusieurs étapes:

Compatibles avec l’équation de Michaelis et Menten?

• A l’état stationnaire, par définition:

– d(EA)/dt = 0 = k1 [E][A] + k-2 [EAB]-k-1[EA]-k2[EA][B]

– d(EAB-EPQ)/dt = 0 = k2 [EA][B]+k-3[EQ][P]-k-2[EAB-EPQ]-k3[EAB-EPQ]

– d(EQ)/dt = 0 = k3[EPQ]+k-4[E][Q]-k-3[EQ][P]-k4[EQ]

– d(E)/dt = 0 = k-1[EA] ]+k4[EQ] -k1[E][A]-k-4[E][Q]

• Loi de conservation des masses:

E + EA + EAB/EPQ + EQ = Etot

• Loi d’action des masses: à l’état stationnaire,

• v = k1[A]∙[E] = k2[EA] = k3[EAB/EPQ] = k4[EQ]

Calcul de la vitesse de réaction à l’état stationnaire:

E EA (EAB EPQ) EQ E

Résolution:• Système de n équations à n inconnues: résolution par le

système des déterminants… Laborieux!

Méthodes « simplifiées »:

La méthode de King et Altman est la plus simple pour le calcul du dénominateur de l’équation représentant la vitesse, v = Vmax[ES]/[Etot];

La méthode de Wong et Hanes est plus efficace pour le calcul du numérateur (aucune simplification de termes superflus n’est nécessaire).

Dénominateur: King et Altman

Recherche de l’équation,

Analyse « topologique » des mécanismes d’inhibition par produit

[ ][ ]

maxmax app

total M

V SVv ES v

E K S= Þ =

1. décrire la vitesse de réaction par une équation de la

forme « Michaelis-Menten », c’est à dire

2. Distinguer les différents mécanismes réactionnels

3. Prévoir le mode d’inhibition par des analogues des

différents produits de la réaction (compétitif, non

compétitif, etc.)

But du jeu:

Calcul de [Etot] : la méthode de King - Altman

Posons:

• La concentration de chacune des formes enzymatiques ([E], [ES],

[EP], etc) est proportionnelle à la vitesse à laquelle elle s’accumule

• La concentration totale en enzyme est proportionnelle à la somme

des concentrations de toutes les formes possibles ([Etot]=[E]+[ES]+

[EP]+etc)

• Si on divise [ES] par [Etot], les constantes de proportionnalité vont

s’annuler…

[ ][ ]max

Méthode Graphique:

• Remplacer le schéma réactionnel par 1 ou plusieurs cycles fermés:

• Dessiner tous les patrons qui – Consistent uniquement de lignes du « patron maître »– Connectent toutes les formes enzymatiques– Ne contiennent aucun cycle fermé

• Chercher puis additionner toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique, pour obtenir leurs vitesses de formation.

• Additionner les vitesses de formation de toutes les formes enzymatiques pour obtenir « Etot ».

Attention: Toutes les constantes cinétiques doivent être de premier ordre (k-1, etc.) ou de ‘pseudo premier ordre’ (k1[A], etc.)!

EAB/EPQk3

k1AE EA

k2Bk4 k-2

ou « Master pattern »(patron maître)

par 1 ou plusieurs cycles fermés:

kEPQEAB

1. Remplacer le schéma réactionnel

2) Dessiner tous les patrons qui - Consistent uniquement de lignes du « patron

maître »

- Connectent toutes les formes enzymatiques entre elles

- Ne contiennent aucun cycle fermé

3) Chercher toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique. Par exemple : les réactions conduisant à « E » sont:

k-2k-2 k4

[ ][ ]

[ ] [ ]

La concentration de « E » est proportionnelle à la vitesse des réactions qui y conduisent, donc :

E k k k P k k k k k k k B k k

E- - - - - -+ + +

1 2 3 1 2 4 1 3 4 2 3 4

[ ][ ]

[ ] [ ]

[ ][ ]

[ ] [ ].

On peut représenter:

.. . ... ..

k B k k

k k k P

E k k k k k k

- -- - -- + + +=

1 2 4 1 3 24 3 41 2 3

[ ][ ]

[ ][ ] [ ] [ ][ ]

[ ][ ]

[ ][ ][ ] [ ][ ] [ ][ ] [ ][ ][ ]

[ ][ ]

[ ][ ] [ ] [ ][ ]

De même:

EAB EPQ A B P

A B P Q

« + + +=

L LL L

Si on groupe tous les facteurs indépendants, tous les multiplicateurs de [A], etc: le dénominateur devient

équivalent à la somme:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ][ ]

[ ][ ] [ ][ ][ ]

indépdt

BQ BPQ

E E EA EAB EPQ

B P QB Q

= + + + +

Recherche du numérateur :

méthode de Wong et Hanes

Recherche du numérateur :méthode de Wong et Hanes

Rechercher tous les schémas qui1. Consistent uniquement en lignes du

schéma directeur2. Connectent toutes les formes

d’enzyme3. Contiennent une flèche partant de

chaque enzyme4. Contiennent exactement un cycle

complet, fermé

EAB/EPQ

k2k4 k-2

Le numérateur est la somme algébrique du produit des vitesses du cycle, avec une valeur positive pour le cycle « forward » et une valeur négative pour le cycle « reverse »

1-2-3-4-4321 kkPkQkkkBkAk Numérateur :

Equation de forme « Michaelis Menten »?

Définition des Vmax, KM et Ki

• Nous venons d’obtenir une équation de la forme:

[ ][ ][ ]

[ ] [ ]

maxmax

ou, plus exactement, v1 1 ...

+ + + +

• Nous voulions obtenir une équation de la forme:

[ ][ ][ ] [ ][ ][ ][ ] [ ] [ ] [ ][ ] [ ][ ][ ]

1 2 3 4 1 2 3 4

( )indp At A BB B AC C

kkkk k k k kv

A A- - - -

+ + + + + +B

BL L LLLL

coefficients de <tous les substrats

coefficients de <tous les substrats>

exemple: trois substrats, , et et deux produits, et

AM A M

BCPcoeff coeff

QPcoeff

( )( )

Coefficient de <tous les substrats>

Coefficient de <tous les produits>

kkk kV

k k k kV - - - -

1 2 3 4

Pour y arriver: définitions des Vmax , KM et Ki

CoeffK

Coeff PBP QQA

( , , ) ou bien

( , , , )

( )( )

coéfficient de n substrats et/ou produits

coéfficient des mêmes n substrats et/ou produits

sauf X

y compris X

CoeffK

CoefPPAQQf

=( , )

ou bien( , , )

CoeffK

Coeff=

( , ) ou bien

( , , )

etc...

Il « suffit » de choisir la définition qui convient le mieux pour simplifier l’équation de la vitesse:

...1...1

On obtient une équation du type:

PABAPBA

MMMMMMM

Expérimentalement: on varie un seul substrat à la fois: par exemple, [A].

...1...1

Si on divise Numérateur et Dénominateur par les termes indépendants de [A]:

...1maxmax

apparente

BKKoù

apparenteS

diminue avec les termes qui multiplient [A](reflétant les complexes EAP non productifs)

diminue avec les termes indépendants de [A] (reflétant les complexes incapables de reconnaître A)

...1...1BCB

AapparentA

augmente avec les termes indépendants de [A] etdiminue avec les termes qui multiplient [A]

Rappel: cinétique Michaelienne

Michaelis Menten - un substrat, un inhibiteur:

Nous avons vu que si il y a – Formation de EI, pas ESI: compétitif– Formation de ESI, pas EI: incompétitif– Formation de EI et ESI : mixte ou non-compétitif

• L’inhibition par produits dépend à la fois du substrat et

du produit considéré.

• Termes en [S]…[P]… : formation de complexes ESI:

Vmax apparente diminue en présence de P (inhibition

mixte);

• Termes en [P]… (pas [S]) : formation de EI :

KS apparente diminue

• KM = Vmax/KS: si termes [P]… mais pas [S]…[P]… : KM

augmente; P inhibiteur compétitif.

Inhibition par produits

Le type d’inhibition par produit peut servir à identifier le mécanisme!

Tableau extrait de « Enzyme kinetics » de I. Segel (Wiley and sons, 1975):

Varied A Varied BMéchanism Product

inhibitor:Unsaturated with B

Saturated with B

Unsaturated with A

Saturated with A

Ordered

Uni-BiP MT

Ordered

Bi-UniP C C MT -

Iso Ordered

Uni-BiP MT MT

Q MT MT

Iso Ordered

Bi-UniP MT MT MT MT

Ordered

Bi-BiP MT UC MT MT

Q C C MT -

Ping Pong P MT - C C

Q C C MT -

Etc., etc., etc….

Exemple: réaction réversible uni-bi ordonnée :

1. ordonnée:Enzyme + S ES EQ + P E + Q + P

2. aléatoire: EQ + P E + Q + PEnzyme + S ES

EP + Q E + Q + P

1. Uni-bi ordonnée:

Schémas à prendre en compte: dénominateur

numérateur

EA/EPQ

QcoeffPAcoeffAcoeffQPcoeffPcoeffcst

EQEPQEAE

AkkQkkkkAkQkkQkk

PAkkAkkQPkkPkAkkAkPkQk

Pkkkkkk

Altman) et (King : ateurminDéno

QkPkkkkAk

Hanes) et (Wong Numérateur

QAPAPQP

21321213132

213132213132

213132

321321

coeffK

roduitsP tous

Q saufroduitsP tousQM

roduitsP tous

P saufroduitsP tousPM

A S tous

A saufS tousAM

QPcoeffQcoeffPcoeffPAcoeffAcoeffcste

QkPkkkkAkv

PQQPAPA

321321

321321max

PQQPAPA

csteK et

coeffK

QPcstecoeff

coeffcoeffQ

coeffP

coeffcstecoeff

coeffcoeffcoeffPA

coeffcste

coeffcoeff

Acoeff

QPcstecoeffcoeff

coeffcoeffkkkA

cstecoeff

coeffkkk

QkPkkkkAk

maxmax

321321

Définitions des Ki? ad hoc:

PQQPAPA

csteK et

coeffK

QPcstecoeff

coeffcoeffQ

coeffP

coeffcstecoeff

coeffcoeffcoeffPA

coeffcste

coeffcoeff

Acoeff

QPcstecoeffcoeff

coeffcoeffkkkA

cstecoeff

coeffkkk

QkPkkkkAk

maxmax

321321

Définitions des Ki? ad hoc:

Conclusion:

• Terme en « P » : Ks diminue

• Terme en « AP »: Vmax diminue

– KM = Vmax/KS change: P = mixte

• Terme en « Q », pas « AQ »: Vmax constant et KS

diminue donc KM augmente et Q = compétitif

maxmax

Pyruvate

E E∙NADH

E∙NADH∙Pyruvate/Lactate∙NAD+E∙NAD+

Lactate

Est équivalent à:

Exemple: réaction bi-bi ordonnée

]][...[]...[]...[]][...

]][][...[]][...[]][...[]][][...[

]][...[]...[]...[]][...[

]...[......]...[

BAQQBQEQ

PBABAPQBPQEAB

PAAAPQEA

E E∙A

E∙AB/PQE∙Q

]][...[]...[]...[]][...[

]][][...[]][...[]][...[]][][...[

]][...[]...[]...[]][...[

]...[......]...[

BAQQBQEQ

PBABAPQBPQEAB

PAAAPQEA

•Expérience: incubation avec les 2 substrats et un seul produit (soit P soit Q)

• Termes P , AP, ABP :– P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A et vis-à-vis de B

• Termes Q et BQ, pas AQ : – Q = inhibiteur mixte vis-à-vis de B,

– Q = inhibiteur compétitif vis-à-vis de A

• Si A saturant: tous les termes qui ne contiennent pas « A » vont disparaître (trop petits comparés aux autres). Il reste :– Termes (A)P et (A)BP donc P reste inh. mixte vis-à-vis B;

– Pas de termes AQ, donc levée d’inhibition par Q

• Si B saturant: même raisonnement– Termes A(B)P mais pas (B)P donc P devient incompétitif vis-à-

vis de A

– Termes (B)Q donc Q reste compétitif vis-à-vis A

Réaction bi-bi ordonnée

Microsoft Excel Worksheet

v iMMi

maxmax

Réaction uni-uni,uni-uni « ping pong »

v iMMi

maxmax

• Termes P, AP, pas BP :– P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A, compétitif vis-à-vis

• Termes Q, BQ, pas AQ : – Q = inhibiteur mixte ou non compétitif vis-à-vis de B,

compétitif vis-à-vis de A

• Si A saturant:– Termes AP donc P reste compétitif vis-à-vis B; pas

termes AQ donc l’inhibition par Q est levée

• Si B saturant:– Pas termes BP donc l’inhibition par P est levée;

termes BQ donc Q reste compétitif vis-à-vis A

v iMMi

maxmax

Mécanismes complexes:

1. Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit d’additionner les vitesses de ces réactions

2. Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés

3. Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques

4. Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent

5. Si plusieurs états de l’enzyme sont à l’équilibre pendant la réaction, il suffit d’utiliser des constantes de vitesse pondérées

E EA=EP

EPEAAEkk

21 ][][

Enzyme Michaelienne:

PEEPEAAEk

15 schémas possibles contenant (n-1) lignes (n étant le nombre de formes enzymatiques), mais 4 sont éliminés car au moins 1 cycle fermé)

k1Ak-1

k3Ak-3

k1A k-1k2P k3A k-3 k4P

Est équivalent à:

2k1A2k-1

2k3A 2k-3

2kPkA2kEA

2kEAEA

PkA2k : EAEA

2k : EEA

PkA2k : EAE

][2][2

)2()1(:

EB même de

EEcrire

Pour trouver le dénominateur, identifier : tous les cycles ouverts menant au point de contact et tous les cycles ouverts qui le quittent:

+ + EE E E E E

EA EAEA

EP EP EP

Ensuite : additionner les combinaisons: « matrice gauche*matrice droite » + « matrice droite*matrice gauche »

E + E + E

EA + EA

EP + EPEP +

* + E+ EE

+ EAEA

EP + EP + EP

[Etot] ~

Le numérateur est obtenu en incluant un cycle complet par terme, avec un signe positif pour le cycle « forward » et un signe négatif pour le cycle « reverse »

++ + -*

Remarque: impasse?

... équilibrel'à toujours définitionpar ste

cycleE

ire, stationnaétatl'à :ntraisonneme même le fait on Si

)2()1(:

Exemple: effet du pH

KHEEH et

:à égales sontHE etE de sproportion les donc ,HE

HE+ HE+HE+PHE+A

E0 E0E0PE0A

k’1A

k’-1

k-3Pk-2k-1

k’-2 k’-3P

EHkAHEk

et AHK

EKkAEk

Les constantes de vitesse peuvent s’écrire:

Et la vitesse d’association de A vaut:

AHEkAEkv

Est donc équivalent à:

E(H) E0E0PE0AAk H )(

Pk H )(3

avec des constantes de vitesse « pondérées » en fonction de [H+]

HE+ HE+HE+PHE+A

E0 E0E0PE0A

k’1A

k’-1

k-3Pk-2k-1

k’-2 k’-3P

Un exemple de cinétique « non Michaelienne »:

la réaction bi-bi aléatoire:

B2 B2B2

Cinétique non Michaelienne:

Termes en A2, B2, P2 et Q2...

En pratique:

•De très nombreux termes supplémentaires apparaissent au

dénominateur et au numérateur si l’ordre de liaison des

substrats est aléatoire;

•La cinétique n’est plus « Michaélienne » et peut donner

l’apparence d’une réaction catalysée par deux enzymes

différentes.

•La déviation est cependant souvent non-détectable. En

effet, comme les concentrations de A, B sont faibles (<<

1M), les termes en A2, B2 deviennent négligeables devant

les termes en A, B (à moins que la voie qui donne

naissance à ces termes ne soit particulièrement

favorable)...

Réaction bi-bi aléatoire:si la liaison de A, B, P et Q est instantanément à l’équilibre,

la réaction peut sembler « Michaelienne »:

v iMMi

maxmax

A l’équilibreA l’équilibre Lent

• Cinétique de type « Michaelienne » si mécanisme ordonné;

• Cinétique peut-être visiblement « non Michaelienne » si ordre réactions aléatoire: peut donner l’impression que deux enzymes de KM et Vmax différentes participent à la réaction…

• Le profil d’inhibition par les produits peut servir à diagnostiquer le type de mécanisme: voir les exemples que nous avons étudié

Résumé: réactions à deux ou plusieurs substrats:

Résumé: les réactions à deux substrats que nous avons étudiées:

Produit: B non saturant

B saturant A non saturant

A saturant

Ping Pong P

CompMixte

Comp -

Bi-Bi ordonné

Incomp Comp

Aléatoire(liaison « instantannée » de A,B,P et Q sur E)

En conclusion:1. La réaction n’a lieu que si tous les substrats sont

présents

2. Cinétique « Michaélienne?

– Oui, si un seul cycle réactionnel possible: chaque substrat (ou

produit) n’intervient qu’une seule fois dans chaque terme.

– Non si plusieurs cycles utilisent le même substrat: des termes

du type « [A]n » vont vraisemblablement apparaître.

3. La Vmax apparente pour chaque substrat (vitesse

approchée lorsque la [A] tend vers l’infini) augmente avec la concentration des autres substrats

4. Le KM apparent de chaque substrat dépend de la

concentration des autres substrats

Remarques:

– Si le but est de déterminer le mécanisme de la réaction, il

n’est pas nécessaire de développer l ’équation complète (en

fait, toutes les équations décrivant les mécanismes les plus

classiques ont déjà été développées): un raisonnement

« topologique » suffit pour prédire les propriétés cinétiques

de la réaction pour chaque mécanisme…

– Plusieurs définitions de Ki sont en général possibles pour

chaque produit ou substrat: il faut choisir celle qui semble la

plus appropriée pour écrire l’équation de « v »

– La Vmax (mesurée en présence de concentrations saturantes

de tous les substrats) dépend uniquement des vitesses de

dissociation des produits!

Réactions complexes, en plusieurs étapes: Compatibles avec léquation de Michaelis et Menten?

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