Apport du laboratoire dans le diagnostic et le traitement des infections

• Le prélèvement.

• L’examen au laboratoire.

• Les relations entre le laboratoire et le service demandeur.

Le prélèvement : conditions générales (1)

• dans les règles de soins et d’hygiène

• avant l’administration d’antimicrobiens.

• le plus tôt possible dans le processus infectieux

• -au plus près du foyer initial (ou des lésions secondaires )

-éventuellement au niveau de la porte d’entrée et sur les voies d ’excrétion.

Le prélèvement : conditions générales (2)

• quantité la plus importante possible de matériel.

• méthodes différentes selon les micro-organismes recherchés, les organes à prélever, le type des lésions, l’enjeu du diagnostic.

Le prélèvement : conditions générales (3)

• éviter la contamination des prélèvements

(bactéries de l’environnement et bactéries commensales)

-> respect des règles d’hygiène

-> matériel stérile à usage unique.

-> dispositifs spéciaux

-> décontamination de la surface à prélever

Le prélèvement : conditions de recueil

dans un récipient :

• stérile, à usage unique

• étanche et fermé hermétiquement

• identifié : nom et prénom du malade,

nature et site du prélèvement.

date et heure du prélèvement.

• introduit dans un sac plastique étanche et fermé hermétiquement

Le prélèvement : conditions de transport (1)• idéalement : prélèvement effectué au laboratoire.• si transport de < 30 mm pour les petits échantillons ou

de < 2 heures pour les autres : tube sec stérile.• si transport de > 2 heures :

– inoculation dans un flacon d’hémoculture anaérobie et dans un tube sec stérile.

– conservation :- tube stérile: à +4°C *

- flacon: à 37°C (ou t° ambiante)• si transport de >24 heures: milieu de transport

type Portagerm

* sauf échantillons respiratoires et LCR

Le prélèvement : conditions de transport (2)

• cas spéciaux* nécessitant la congélation du

prélèvement : recherche de

- virus enveloppés,

- Bartonella

• * contacter le laboratoire avant de prélever

Le prélèvement : refus d ’analyse

• échantillons

– reçus dans des récipients non étanches

– mal conservés

– non étiquetés

– inappropriés aux analyses prescrites

• même type d ’échantillon qu’un échantillon reçu le même jour (sauf hémoculture, LCR ou en cas d ’aggravation de la situation clinique).

Examen au laboratoire

• Diagnostic direct : mise en évidence de l’agent infectieux

• Diagnostic indirect : mise en évidence de la réaction de l’organisme à la multiplication de l’agent infectieux

= sérologie

Les étapes de l ’examen bactériologique classique

examen microscopique

culture

tests de sensibilité aux antibiotiques

L ’examen microscopique (1)

• effectué directement sur le prélèvement,• à l’état frais et après coloration de Gram (ou

autre:ex, Z. Neelsen) • résultats le jour même du prélèvement

• détecte la présence de:

- bactéries (si suffisamment nombreuses)

- polynucléaires neutrophiles

L ’examen microscopique (2): les bactéries

• flore polymorphe ou monomicrobienne • cocci ou bacilles, mobiles ou non• Gram+ ou Gram -

-> indications pour le choix des milieux à ensemencer-> base pour interprétation du résultat des cultures.

-> indications pour la mise en place du traitement

Coloration de Gram: cocci à gram positif

Coloration de Gram: bacilles à Gram négatif

L ’examen microscopique (3): les polynucléaires neutrophiles

• la présence de polynucléaires neutrophiles* ± altérés est en faveur d’une infection bactérienne.

*cas des liquides de ponction : recherche par coloration cytologique (May Grunwald Giemsa)

La culture (1)

• sur différents milieux* : solides , liquides, enrichis , sélectifs , en aérobiose et parfois en anaérobiose.

• colonies en milieu solide et trouble en milieu liquide

• isolement impératif pour distinguer les différentes espèces présentes.

*certaines espèces requièrent des milieux et des conditions de

mise en culture spéciaux (mycobactéries, Rickettsies, Chlamydia).

La culture (2)

• résultats obtenus habituellement en 24 heures ( mais parfois plusieurs jours ou semaines selon les

bactéries).

-> permet de faire• la détection des bactéries qui n’ont pas été

observées à l’examen microscopique.• l’appréciation quantitative des bactéries présentes.• l ’identification des différentes espèces et si

nécessaire l’antibiogramme.

L ’identification de la culture (1)

• effectuée par étude des caractères culturaux et biochimiques

• avec des trousses d ’identification commercialisées (gammes API)

• habituellement en quelques heures ( 24

heures ou moins )

L ’identification de la culture (2): cas des bactéries à croissance lente et/ou difficile

-> étude des caractères génotypiques

• hybridation avec des sondes spécifiques

• en utilisant des trousses commercialisées (ex: sonde pour mycobactéries),

• résultats en quelques heures .

Test de sensibilité aux antibiotiques

• effectué par la technique de l’antibiogramme

• résultats en 24 h.

-> aide à la mise en place du traitement spécifique: -indispensable en cas d’échec du

traitement ou de rechute. - utile pour les espèces concernées par la

résistance acquise*

*résistance naturelle = partagée par toutes les souches d ’une même espèce. résistance acquise = concerne seulement certaines souches de l ’espèce.

Techniques de détection rapide

1. recherche d ’antigènes solubles.

2. amplification génique.

Recherche d ’antigènes solubles• dans les urines, le LCR .• en utilisant des anticorps connus, spécifiques de la

bactérie recherchée• résultats rapides (1 à 2 heures)• pour :

– des infections à bactéries de croissance difficile (légionelle,pneumocoque)

– des infections décapitées (méningite)

• limites : manque de sensibilité

Amplification génique

• principe : multiplier le génome (une fraction spécifique) de la bactérie sans multiplier la bactérie

• diverses techniques dont la PCR

• intérêt : rapidité (1 journée) et sensibilité (sauf BK)

• pour la mise en évidence directement dans le prélèvement de bactéries à croissance lente ou /et difficile (et de nombreux virus)

• quand des trousses sont disponibles dans la commerce

Relations entre le laboratoire et le service demandeur

- le service clinique doit fournir les renseignements utiles à la qualité de l ’analyse: éléments cliniques, traitements pouvant interférer dans l ’analyse, contexte épidémiologique …

- l’interprétation des résultats et l’élaboration de la

stratégie thérapeutique doivent être faites après confrontation des résultats avec les données cliniques.

La sérologie (1)

• = mise en évidence d’anticorps dans le sang • par formation de complexes antigène-

anticorps, en utilisant des antigènes spécifiques du micro-organisme recherché

• diverses techniques de révélation des complexes:agglutination, fluorescence…

La sérologie (2)

• sang prélevé sur tube sec stérile

• résultats en 24-48 heures

• 2 prélèvements pour mettre en évidence la montée du taux des anticorps: un le plus tôt possible et l’autre environ 15 jours plus tard

• en bactériologie: réservé aux cas de diagnostic direct difficile (ex: brucellose, légionellose, mycoplasmes, chlamydia…)

très utilisé en virologie et parasitologie

Bactéries et antibiotiques

Structure des bactéries

• Bactérie = Cellule procaryote• Paroi • Membrane cytoplasmique• Cytoplasme• Chromosome circulaire

Les antibiotiques

• Cible: les différentes voies métaboliques des bactéries

ANTIBIOTIQUES INTERVENANT DANS LA SYNTHESE DE LA PAROI

-LACTAMINES

GLYCOPEPTIDES

FOSFOMYCINE

BACITRACINE

Cible d’action des béta-lactamines

ANTIBIOTIQUES ACTIFS SUR LES MEMBRANES

POLYMYXINES

ANTIBIOTIQUES INHIBANT LA SYNTHESE OU L'EXPRESSION

DE L’ADN

QUINOLONES RIFAMPICINE INHIBITEURS DE LA SYNTHÈSE DES

FOLATES : SULFAMIDES ET TRIMETHOPRIME

5-NITRO-IMIDAZOLÉS NITROFURANES

ANTIBIOTIQUES INHIBANT LA SYNTHESE DES

PROTEINES

MACROLIDES ET APPARENTES TETRACYCLINES AMINOSIDES CHLORAMPHENICOL ACIDE FUSIDIQUE

Synthèse des protéines

Synthèse des protéines

Synthèse des protéines

Les champignons et les anti fongiques

Caractéristiques des champignons

• Cellules qui produisent de l’énergie (glycogène), se reproduisent (spores)

• Paroi rigide (polysaccharides)• Membrane cytoplasmique (ergostérol)• Noyau avec membrane nucléaire• Cytoplasme avec des mitochondries

Les virus

Structure virale

• Un acide nucléique , ADN ou ARN• Un complexe protéique protecteur,

la capside• Une enveloppe (membrane

lipidique) facultative

La multiplication virale

• Virus = être très simple incapable de se multiplier seul

• Pas de matières premières• Pas de sources d’énergie• Pas d’enzymes • Seulement l’information génétique

• → pour la réplication: utilisation de la machinerie de la cellule infectée

LA MULTIPLICATION DU VIRUS DANS LA LA MULTIPLICATION DU VIRUS DANS LA CELLULE CIBLECELLULE CIBLE

A : AttachementB : PénétrationC : DécapsidationD : RéplicationE : Synthèse des protéines virales (par

traduction des ARNm viraux)F : AssemblageG : Libération des virions néoformés par

bourgeonnement ou fusion-lyse

Les antiviraux

• Ne visent pas les virus eux-mêmes qui sont métaboliquement inertes

• Bloquent le cycle de multiplication des virus, à différentes étapes

  PRINCIPAUX ANTIVIRAUXPRINCIPAUX ANTIVIRAUX

PÉNÉTRATION ET DÉCAPSIDATIONPÉNÉTRATION ET DÉCAPSIDATION

T-20 ou pentafuside= FUZEON®T-20 ou pentafuside= FUZEON® Produit actif sur le virus de Produit actif sur le virus de l’immunodéficience humaine : inhibiteur de l’immunodéficience humaine : inhibiteur de fusionfusion

Amantadine = (MANTADIX®)Amantadine = (MANTADIX®)= Chlorhydrate d'amino-L-adamantane= Chlorhydrate d'amino-L-adamantaneAction sur les virux grippaux Action sur les virux grippaux ((Influenzavirus Influenzavirus A et B) A et B)

AmantadineAmantadine

1.1. Inhibiteurs par compétition avec un nucléotide Inhibiteurs par compétition avec un nucléotide naturel ou par terminaison de chaînenaturel ou par terminaison de chaîne

= Analogues nucléosidiques (analogues de base ou de sucre de = Analogues nucléosidiques (analogues de base ou de sucre de l’acide nucléique) l’acide nucléique) ex: - aciclovir ou ZOVIRAXex: - aciclovir ou ZOVIRAX® ® (herpes virus) (herpes virus) - ganciclovir ou CYMEVAN® (cytomégalovirus)- ganciclovir ou CYMEVAN® (cytomégalovirus) - zidovudine (AZT) ou RETROVIR*® (Hiv)- zidovudine (AZT) ou RETROVIR*® (Hiv) -lamivudine (3TC) ou EPIVIR®,….-lamivudine (3TC) ou EPIVIR®,….

RÉPLICATIONRÉPLICATION

incorporation au cours de la synthèse de l’acide nucléique incorporation au cours de la synthèse de l’acide nucléique viralviral

2. Inhibiteurs non nucléosidiques d’enzyme virale2. Inhibiteurs non nucléosidiques d’enzyme virale

Névirapine (VIRAMUNE®)Névirapine (VIRAMUNE®)

Efavirenz ou SUSTIVAEfavirenz ou SUSTIVA®,…®,…

Action sur le VIHAction sur le VIHNévirapineNévirapine

3.3. Incorporation directe à l’ADN viral Incorporation directe à l’ADN viral

Acide phosphonoformique (FOSCAVIR®)= PFA = foscarnet

Action sur les virus herpes simplex, varicelle-zona, Action sur les virus herpes simplex, varicelle-zona, cytomégalovirus…cytomégalovirus…

MATURATIONMATURATION

inhibiteurs de protéases

Nelfinavir ou VIRACEPT®Nelfinavir ou VIRACEPT®Saquinavir ou INVIRASESaquinavir ou INVIRASE

Action sur les virus de l’immunodéficience humaineAction sur les virus de l’immunodéficience humaine

LIBÉRATIONLIBÉRATION

Inhibiteurs de la neuraminidase Inhibiteurs de la neuraminidase  4- guanidino-Neu5Ac2en = Zanamivir ou RELENZA®4- guanidino-Neu5Ac2en = Zanamivir ou RELENZA®

Oseltamivir ou TAMIFLU®Oseltamivir ou TAMIFLU®

Action sur les virus grippaux (Action sur les virus grippaux (InfluenzavirusInfluenzavirus A et B) A et B)

ZanamivirZanamivir

Schéma de Schéma de multiplication multiplication du VIH et du VIH et cibles cibles thérapeutiquthérapeutiqueses

Les interférons

• Dégradation des ARN messagers par activation d’une ribonucléase

• → arrêt de la production des protéines virales