Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. Lyon le 10 Septembre

Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN

(ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon.

Lyon le 10 Septembre 2014 1

Jessica MICHEL Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle

Groupement Hospitalier Est du CHU de Lyon

2

La plateforme ACPA de Lyon

Lyon le 10 Septembre 2014

• Depuis 2007Déficiences intellectuelles isolées/syndromiques et syndromes malformatifs

• Depuis 2011Troubles du spectre autistique

• Depuis 2013Syndromes polymalformatifs en prénatal

3

CGH array0

200

400

600

800

1000

1200

172

382

499

589645

753

1034

ACPA : bilan CHU Lyon

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013



Nécessité d’automatisation

• Extraction ADN: Hamilton (en cours de validation) -> utilisation début 2015

• Technique ACPA : BRAVO Agilent

• Interprétation résultats: - Agilent Cytogenomics- Cartagenia

4Lyon le 10 Septembre 2014


Préparation des ADN et pipetage Peut traiter 48 patients en simultané

Améliorations attendues:Gain de temps.Reproductibilité de la

technique.Qualité des résultats.Risque d’erreur réduit. Traçabilité.


Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform

Douchette codes à barres

ThermocycleurScelleuse Thermique

( + films thermosensibles)

Centrifugeuse compatible avec les plaques PCR 96 puits


Appareillages spécifiques

2 « Racks » pour

microtubes 1.5mL

Pour une série de 48 patients

8

Consommables spécifiques

1 plaquepurification

5 Boites 96 pointes 250µL (Tips) 1 plaque

« deep well 384 puits» réutilisable 1 seule fois

1 plaque « réservoir » réutilisable

1 plaque « poubelle » réutilisable

Films protecteurs

3 Plaques PCR 96 puits

Avant passage sur le BRAVO


Préparation d’une technique

Nous indiquons le nom, le prénom, notre n° SGL, concentration ADN


Création automatique des plans de dépôt


Création automatique du fichier pour le BRAVO

Format csv


Création automatique des étiquettes pour les tubes « finaux » (ADN marqués et combinés en « dye-swap »)


Création automatique de l’attributefile pour Cytogenomics


Patient A

Patient BPatient D

Patient C

Cy5

Cy5

Cy5

Cy5

Cy3

Cy3

Cy3

Cy3

Image en miroir

Quatuor

Adaptation du protocole BRAVO.

del(13)(q33.1) et dup(13)(q33.1q34)


ACPA : Technique en « Dye-Swap »

• Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) • Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction)

• Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3)

• Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques

• Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube

• Etape 6 : Dosage des fluorochromes

• Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame

• Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner

• Etape 9 : Traitement informatique des données.

Etapes automatiséespar le BRAVO


Application du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon


Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon

• Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) • Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction)

• Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3)

• Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques

• Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube

• Etape 6 : Dosage des fluorochromes

• Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame

• Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner

• Etape 9 : Traitement informatique des données.

Etapes automatisées par le BRAVO

Etapes manuelles

Essais sur 24 patients (soit 6 Quatuors):Test 1 : Vérifications d’anomalies connuesTest 2 : Technique automatisée VS Technique manuelleTest 3: Patient commun à trois quatuors ->

reproductibilité des résultats.Test 4: Self-Self.Test 5: ADN issus de 4 tissus de types différents.

Problèmes initiaux rencontrés:Programmation : plan de dépôt Normalisation : volume d’eau prévu erroné -> rajout d’eau au

cours de processusMix marquage : protocole « CGH/SNP enzymatic » -> rajout de

mix manuellement en cours de processusRe-tube : tout l’ADN marqué n’est pas récupéré à la fin de la

technique (1/3)Lyon le 10 Septembre 2014 18

Validation : Premiers essais

Patient A (technique manuelle du 15.04.13)DLRS 0.13 / 0.15

del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mbde 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19)

Patient A (BRAVO le 23.12.13)DLRS 0.20 / 0.20

del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mbde 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19)

Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1)Patient A grand CNV pathogènePatient B dérivé de translocationPatient C petit CNV pathogènePatient D grand CNV en mosaïque


Manuel BRAVO


Patient C (technique manuelle du 10.04.13)

DLRS 0.16 / 0.16

del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19)

Patient C (BRAVO le 23.12.13)

DLRS 0.20 / 0.28

del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19)


Manuel BRAVO


Patient D (technique manuelle du 06.08.13)DLRS 0.12 / 0.15

Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 58%

Patient D (BRAVO le 23.12.13)DLRS 0.20 / 0.20

Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 44%

Test 1: Toutes les CNV pathogènes ont été retrouvés à l’oligo prêt.22

Manuel BRAVO


Test 2 : (Quatuor 2) : Technique automatisée VS Technique Manuelle

Cy5 Cy3 Cy5 Cy3Patient I 0.20 0.17 0.12 0.14Patient H 0.14 0.20 0.12 0.12Patient G 0.20 0.14 0.13 0.12Patient F 0.17 0.20 0.14 0.13

DLRSBRAVO

(premiers essais)Manuelle

Qualité de la technique BRAVO dépendant des problèmes

techniques rencontrés.

Patient G : Technique Manuelle Patient G : BRAVO

Test 2 : Test à refaire


Manuel BRAVO

Test 3 : un patient (Quatuors 2 – 3 – 4) Patient E analysé 3 fois dans 3 quatuors différents (contre de nouveaux patients/témoins à chaque fois: patients F à N.)Technique réalisée le même jour, en même temps -> Lames hybridées à des dates ultérieurs différentes.

Quatuor 1DLRS

0.23/0.19

Quatuor 2DLRS

0.26/0.20

Quatuor 3DLRS

0.21/0.22

Test 3 : Test validé, les mêmes CNV sont retenus


Test 4: Self-self : Patient O Cy5 / Patient O Cy3La « moving average » reste centrée sur le log²=0

DLRS : 0.20Interval Based Report : 0 CNV


Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6)

Patient R Tissu congeléPatient S Sang (technique classique avec 2mL de sang)Patient T Liquide Amniotique (CBC : culture)Patient U Sang (quantité sang>2mL)

Technique manuelle du 28.01.13

Patient R Cy5 / Témoin Tissu Cy3 DLRS 0.15

del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19)

Technique BRAVO le 23.12.13

Patient R Cy5 / Patient UCy3 DLRS 0.22

Patient S Cy5 / Patient R Cy3DLRS 0.18

del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19)


Manuel

BRAVO

Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congeléPatient S Sang (technique classique avec 2mL de sang)Patient T Liquide Amniotique (CBC : Culture)Patient U Sang (quantité sang>2mL)

Technique BRAVO le 23.12.13

Patient T Cy5 / Patient S Cy3 DLRS 0.21

IBR 27 CNVs

Patient U Cy5 / Patient T Cy3DLRS 0.30

IBR 26 CNVs

Lecture visuelle : 10 CNV retenus

Technique manuelle du 06.06.13

Patient T Cy5 / Témoin Cy3DLRS 0.27

IBR 25

Lecture visuelle : 9 CNV retenus

27

Manuel

BRAVO

Lyon le 10 Septembre 2014Test 5 : Technique adaptable sur tissus spéciaux -> quantité d’ADN (Volume mini Bravo)

1Janvier-Février : 2 Séries de 24 patients

Evènements et modifications du protocole

Tests « à blanc » : heurt entre le bras de l’appareil et la « deep well 384 » -> 3 « têtes préleveuses » cassées à changer -> adaptation au consommable « deep well 384 » achetée (Marché HCL)

Installation caisson -> décalage de la tête du Bravo

Répartition mix de digestion : pas de mix dans 2 colonnes-> 2/6 Quatuors non marqués à refaire

Þ Intervention Agilent -> re-paramétrage des axes-> affiner le réglage de la hauteur


Premières séries de patients

Premières série : améliorations apportées -> Tester « à blanc » toutes les étapes-> 2 quatuors à refaire

Troisième série : 6 quatuors validés


2Mars : Séries de 24 patients

Premières séries de patients

Résultats corrects: 0,15<DLRS<0,20 environ 10 CNV/patient

Mais problèmes rencontrés : apparitions de bulles -> problèmes de volumes

Intervention Agilent


Validation de méthodes

Série de 24 patients dont 12 patients avec anomalie connueChaque Quatuor = 2 anciens patients + 2 nouveaux patients

Toutes les anomalies connues ont été retrouvées.

Validation technique du Bravo (sur 24 patients)

Tests « à blanc » : Digestion – Marquage – Combinaison – Retube ( étapes ayant subi des changements)

Normalisation erronée -> blocage à 23/48 patients.-> intérêt de tester « à blanc » toutes les étapes avec le véritable nombre de

patients.

Installation du nouveau protocole « normalisation ».

Problème de format du fichier « feuille de route » -> caractères spéciaux.

Plaque PCR défectueuse / Echec technique



3Mars : Série de 48 patients

Suite séries de patients

1 Série de 48 patients perdue.-> passage à 48 patients pas encore possible.


Suite séries de patientsMai – Juin – Juillet

Problèmes à résoudre Programmation -> Bulles -> Répartition mix digestion : inégale -> rajout manuel -> Déplacement du bras

Gestion des erreurs -> Problème position des « Tips »


Série de 48 patients validée suite à l’intervention d’Agilent

Depuis juillet : 2 séries de 48 sans problème : Passage en routine

Temps gagné

BRAVO (48 patients) Etapes Manuelle (8 patients)

1H Préparation (feuille de route, ADNs, …) 30 min

3H Normalisation (+ Split TipBox)45 min

30 min Digestion

2H Marquage 30 min

2H Purification 1H30

1H Combinaison et Re-tube 10 min

≈ 12 min / patient ≈ 25 min / patient


Evaluation du temps technique

Avantages Limites

Vitesse -> tps technique/patient réduit

Reproductibilité -> démarche qualité

Qualité des résultats

Réactivité du support technique

Traçabilité (réactifs et patients) -> démarche qualité

Préparation en amont -> 48 dossiers

Tests « à blanc » obligatoires

Applicable pour 4x180K pour l’instant

Volume d’ADN mini (+5µL) et microtubes compatibles avec « Racks » -> aliquots reçus extraits/échantillons précieux

Formation logiciel et problèmes informatiques

Consommables (quantité, colonnes de purifications non utilisées)


Avantages / Limites de la technique

Réorganisation du service -> 1 technicien/Bravo -> hybridations « en série » par autres techniciens.

Tests « à blanc » sur toutes les étapes et pour chaque programme (nombre patients – formats lames)-> après chaque modification -> temps + consommables

Perspectives :

Automatisation plus globale du processus « ACPA »: Extraction ADN Passage à Cytogenomics -> possibilité d’autoprocessing

Refaire quelques tests-> « Validation des méthodes » -> Accréditation

ACPA en acquis : ADN patients / ADN Témoin -> reprogrammation Intervention Agilent


Conclusions et perspectives

Remerciements

ACPADamien Sanlaville

Marianne Till Audrey LabalmeNicolas ChatronCaroline Schluth

Eudeline AlixChantal Beche

Christelle AngeiLaurence CaineHélène GuilbertIsabelle Morin

Clément BonnefilleCassandra NivouJessica Michel

LaboratoireCaroline Perbet

Emmanuelle Banquart Christine Bel

Anne FautrelleCatherine Hempel

Brigitte JelassiSylvie Josué

Chantal LavertMichelle MartinChristine ValexCorinne Buis

Azim RafatPatrick Edery

Réseau AChroPuce


Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon.

Support Agilent

Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000

En manuel Avec BravoCyanine 5

Concentration ADNCy5

Quantité fluorochrome

Cyanine 3Concentration ADNCy3

Quantité fluorochrome

Cyanine 5 / Cyanine 3Concentration ADNCy5 / Cy3

Quantité fluorochromes combinés

Dilution car volume 2X plus grand.Bruit de fond Cy3 dans Cy5.



En manuel

39



En manuel

40



Avec Bravo

41



Modifications Conséquences

Digestion – Marquage : Possibilité d’introduire un « STOP » entre la digestion et le marquage

Répartir la technique sur plusieurs jours

Digestion : Suppression de l’étape de transfert de la plaque « ADN normalisés » vers une 2nde plaque « digestion »

Gain de temps Gain de quantité d’ADN Economie de consommables

Re-tube :Récupérer tout l’ADN marqué/combiné

Gain de quantité d’ADN marqué Etape de concentration

« speedvacc » supplémentaire


Modifications supplémentaires demandées

Documents

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