Bio-Rad News€¦ · Bio-Rad News Vol.8 Contents 2016年5月ウェスタンブロッティング実験を加速するトランスブロットTurboブロッティングシステム

Bio-Rad NewsVol.8

2016年5月Contents ■ ウェスタンブロッティング実験を加速するトランスブロットTurboブロッティングシステム ■ 徳島大学小迫英尊先生「トランスブロットTurbo転写システムを活用したPhos-tagウェスタンブロットによるタンパク質のリン酸化の検出」 ■ RNA解析（リアルタイムPCR）とウェスタンブロッティングを同一サンプルから実施～ SingleShotを使ったRNAとタンパク質発現のパラレル解析～

■ マルチプレックスｑPCRによるハイスループットシングル・セル遺伝子発現プロファイリング ■ NGCクロマトグラフィー、ChromLab 4.0登場 ■ Coming Soon! PrimePCR プライマー＆アッセイ発売開始！ ■ NEW PrimePCRTM for ddPCRTM マルチスクリーニングキット新シリーズ登場

Life Science GroupResearch. Together.

2010年の発売以来、多くのお客様にご利用頂いて

いるトランスブロットTurboブロッティングシステム

は、セミドライブロッティングシステムでありながら

非常に短時間に、かつ高い転写効率にタンパク質を

メンブレンに転写できます。

TGXゲルとトランスブロットTurbo転写パックの利用なら最短3分で転写

が完了します（図１）。

タンパク質の種類（分子量や等電点、疎水性）を問わず、一様に転写効

率が向上しますので、他社製プレキャストゲルや自作ゲルでも転写パック

を利用することで、最長でも10分でタンク（ウェット）式転写装置の長時

間転写に匹敵する転写効率を得ることができます（図２）。

速い転写、高い転写効率はトランスブロットTurbo転写パックを利用する

ことで行えますが、一般的なメンブレンやろ紙、転写バッファーも使用で

き、これまでと同じ転写プロトコールで電源内蔵のセミドライブロッティ

ング機器としても使用することができます。

実験の効率、スピード、予算など、研究者の様々なニーズに合わせた使

い方ができるトランスブロットTurboブロッティングシステムは、お客様

のウェスタンブロッティング実験を強力にサポートします。

Ordering Informationカタログ番号品名価格1704150J1 トランスブロットTurbo with PVDF ¥280,0001704272J1 トランスブロットTurbo with RTA （PVDF） ¥306,0001704156B03 トランスブロットTurbo転写パックPVDF 10×3set ¥47,5001704272 トランスブロットTurbo RTA転写キット PVDF 40set ¥46,000

ウェスタンブロッティング実験を加速するトランスブロットTurboブロッティングシステム

図２　各種転写装置によるHeLa細胞核抽出物の転写と転写因子U2AF65タンパク質の検出（▼はトランスブロットTurboによるデータ）A：転写後のメンブレン染色像（SYPRO RUBY染色）。左よりトランスブロットTurbo、トランスブロットSDセル（セミドライ式）、ミニトランスブロットセル（タンク式、60分）、ミニトランスブロットセル（タンク式、Overnight）B：Aで得られた染色像の各レーンのシグナル強度C：転写因子U2AF65タンパク質の検出結果

A

C

B▼

▼

▼

図１転写時間による転写効率の差。転写後のメンブレンをタンパク質染色した画像

3 min transfer 7 min transfer 10 min transfer

Bio-Rad News2

■はじめに

　私たちはリン酸化を中心とした翻訳後修飾や新規セカンド

メッセンジャーによる細胞内シグナル伝達機構の解明を目指し

ており、プロテオミクスやイメージング、相互作用解析などの様々

な技術を開発・導入している。徳島大学にオープンラボ方式で

新設された藤井節郎記念医科学センターにおいて、多くの共同

研究者の協力を得て、現在は特に疾患の原因となる複数のタン

パク質キナーゼの標的基質の大規模同定と生理・病理機能の

解明を進めている。同定されたキナーゼ基質の機能を明らかに

する上で、Phos-tagウェスタンブロットは欠かせない技術と

なっている。

　Phos-tagはリン酸基を特異的に捕捉する二核金属錯体であ

り、アクリルアミドと結合したPhos-tag（Wako, AAL-107）を

用いてゲルに含ませた状態でSDS-PAGEするとタンパク質の

リン酸化レベルに応じて移動度のシフトが起こる。SDS-PAGE

後にメンブレンに転写し、目的タンパク質に対する抗体でウェ

スタンブロットすることにより、細胞抽出液などの複雑な試料中

でのリン酸化状態を評価することが可能になる。このPhos-tag

ウェスタンブロット法は細胞内における特定のタンパク質のリン

酸化の変動を調べる上で極めて有効な方法であり、世界的に急

速に普及している。特に、１）リン酸化特異的抗体や質量分析

計を用いることなく手軽に細胞内でのリン酸化を検出できるこ

と、２）何割また何箇所がリン酸化されているかがおおよそ分

かること、等は優れた特長と言える。しかしながらクリアな

Phos-tagウェスタンブロットの画像を得るためには幾つかの重

要なポイントがあり、特にPhos-tagを含むゲルからメンブレン

への転写は通常のゲルに比べて困難である（特にリン酸化タン

パク質はゲル中のPhos-tagとの親和性のために写りにくい）。

私たちの研究室ではトランスブロットTurbo転写システムを用い

ることで簡便かつ短時間で転写を行い、良好な結果を得ている。

■ Phos-tagウェスタンブロットにおける注意点

　細胞抽出液に対してPhos-tagウェスタンブロットを行う上で

は転写のステップ以外にも幾つかの注意点がある。

１）培養ディッシュ上の細胞を洗浄する際は、リン酸を含む

PBSではなく、氷冷したHBS（20 mM Hepes-NaOH,

pH7.4, 137 mM NaCl）などを用いる。

２）抽出バッファーに含まれるEDTAやEGTAなどのキレート剤

は1 mM以下にする（ゲル中でPhos-tagと錯体を形成して

いるMn2+やZn2+イオンがサンプルの電気泳動中に奪われ

るため）。

３）細胞または抽出バッファー由来の様々な成分によって泳動

パターンが影響を受けやすいため、PAGE Clean Up Kit

（Nacalai, 06441-50）などでタンパク質を沈殿、再溶解す

ると改善する場合が多い。特にPAGE Clean Up Kitは

SDS存在下でも沈殿可能なため、細胞抽出液を直接泳動し

た場合の結果が良くなかった場合に、Laemmliサンプルバッ

ファーで処理した抽出液に対しても使用できる。

■ トランスブロットTurbo転写システムの活用方法

１）私たちは通常、25 µM Phos-tagと50 µM MnCl2を含む

7.5% アクリルアミドゲルを用いて一般的なトリス-グリシン

系のSDS-PAGEを行っている。

２）泳動後のゲルはまず、1 mM EDTAを含む通常の転写バッ

ファー（25 mM Tris, 192 mM グリシン, 10% メタノー

トランスブロットTurbo転写システムを活用したPhos-tagウェスタンブロットによるタンパク質のリン酸化の検出

徳島大学先端酵素学研究所藤井節郎記念医科学センター細胞情報学分野小迫英尊先生

3Bio-Rad Laboratories 2016

ル, 0.03% SDS）中で10分間緩やかに振盪した後、

EDTAを含まない転写バッファーでさらに10分間振盪する。

この操作によってゲルからMn2+イオンが除かれ、リン酸化

タンパク質が転写されやすくなる。

３）専用のPVDF転写パックを開け、カセット中で濾紙、メンブ

レン、ゲル、濾紙の順に積層し、トランスブロットTurbo転

写システムにセットする。

４）目的タンパク質に応じて7分間または10分間の転写時間と

なるように設定し、高電流出力による高速転写を行う。

５）カセットを取り出し、メンブレンをTBS-Tで軽く洗った後、

ブロッキングから一般的なウェスタンブロットの操作を行う。

■ 終わりに

　トランスブロットTurbo転写システムでは10分以内の短時間

で転写できるためにバンドがシャープになり、リン酸化による

移動度シフトが明瞭になるというメリットもある。なお、私たち

はPhos-tagウェスタンブロットおよび通常のウェスタンブロット

において、発色試薬には室温での保存ができ、コストパフォー

マンスにも優れたClarity Western ECL Substrateを用いて

いる。さらにブロット画像の取得には、タッチパネルによる操

作が便利なChemiDoc Touchイメージングシステムを使用し

ている（付属の画像解析ソフトImage Labソフトウェアは

WindowsとMacの両方に対応している上、直感的に使うこと

ができる）。このようにBio-Rad社の複数の試薬と装置を利用

することにより、良好なPhos-tagウェスタンブロットの結果が

得られている（図１）。図１　Phos-tagウェスタンブロットによるERK/MAPキナーゼおよびその基質のリン酸化の検出血清飢餓状態のマウスNIH/3T3細胞に対し、一定時間PDGF刺激を行ってから抽出液を調製した。一部の細胞にはMEK阻害剤U0126で前処理してからPDGF刺激を行った。得られた抽出液をMn2+-Phos-tagを含むゲルでSDS-PAGEした後、図に示したタンパク質に対する抗体でウェスタンブロットした。なお、EPLINとNup50は私たちが新たなERK基質として同定したタンパク質である（Mol. Cell. Biol., 27, 8190-8204, 2007およびNat. Struct. Mol. Biol., 16, 1026-1035, 2009）。

EPLIN

Nup50

- 100’30’U0126＋P10’

PDGF10’

actin

ERK1/2

小迫先生（右端）とご研究室メンバーの方々

トランスブロットTurbo 転写システム

ChemiDoc TouchとImage Labソフトウェア

Clarity Western ECL Substrate

Bio-Rad News4

背景RNAレベルとタンパク質発現の関係は複雑であることが分かるにつれ、

この2つを同時に解析する重要性が高まっています。例えば、mRNAと

タンパク質の変動が同じであると予想される場合でも翻訳後制御により

予想通りの関係性を示さないこともあります。これまでの方法ではRNAやタンパク質をサンプルからそれぞれ回収、もしくは精製する必要があり

ました。しかし2つの実験のために必要なサンプル量が得られなかったり、

2つに分けた際のサンプルとしての質の同一性の問題も懸念されます。

一つのセルライセートを2つの実験に今回紹介する一連の実験プロトコールは、1つの少量の培養細胞サンプ

ルからSingleShot Cell Lysis Kitを用いてリアルタイムPCR用サンプル

とウェスタンブロッティング用サンプルの両方を同時に調製でき、サンプ

ル調製によるバイアスの無い結果を提供します（図１）。

また、1つのウェルから2つの実験用サンプルを得ることができるので、

レプリケート数（N数）の十分な確保、培養コストや手間の低減にもつな

がります。

本実験では、ヒト幹細胞モデル系の多能性因子として知られるNANOG,とOCT4A、HOXB3遺伝子の発現レベルをNTera2（NT2）細胞を用い

てSingleShotワークフローで確認を行いました。NT2細胞では分化が

進むにつれ、多能性因子の減少と神経因子の上昇が起きることが知られ

ています。

プロトコールのポイントmRNA解析

SingleShot SYBR Green One-Step Kit（カタログ番号 1725095）

に含まれるiTaq Universal SYBR Green One-Step KitとPrimePCR

（検証済みプライマーセット）を用いて、逆転写から増幅、定量まで1ステッ

プで行っています。

タンパク質発現解析（ウェスタンブロッティング）

ウェル毎に異なる細胞数やセルライセートのタンパク量（濃度）の違いを

補正するため、Stain-Freeゲルを用いて総タンパク質量によるデータ補

正を行っています。（ハウスキーピングタンパク質（HKP）の発現は条件

によっては変動するケースがあること、また発現量が多いため検出シグ

ナルの飽和などの問題があるため、近年、総タンパク質量による検出シ

グナル値の補正が推奨されています）

Stain-Freeゲルを用いると、泳動後の短時間のUV照射によりタンパク

質が蛍光ラベルされ、UVで容易に可視化できます。蛍光ラベルされた

タンパク質はそのままメンブレンに転写されるため、転写後メンブレンに

UVをあてることでメンブレン上のタンパク質量を求めることが可能です。

結果レチノイン酸によるNT2細胞の分化誘導により、レチノイン酸無しのコン

トロールに対し、OCT4AのmRNAレベルは89%の低下、タンパク質レ

ベルは78%の低下が認められました。同様に転写因子であるNANOGのmRNAレベルは92%、タンパク質レベルは93%の低下が認められま

した。一方、HOXB3のmRNAレベルは17倍となったのに対し、タンパ

ク質レベルは49%の低下が認められました（図２）。HOXB3のmRNAレベルの上昇とタンパク質レベルの減少については、どのような作用に

よるものか不明なものの、タンパク質の発現変化とRNAレベルが一致し

ない事例があることが示されました。また、同じサンプルからの解析を行っ

ていることで、サンプリングによる影響は排除でき、本ワークフローの有

用性を示しているとも言えます。

RNA解析（リアルタイムPCR）とウェスタンブロッティングを同一サンプルから実施～ SingleShotを使ったRNAとタンパク質発現のパラレル解析～

図１　SingleShotを用いたリアルタイムPCR用、およびウェスタンブロッティング用サンプル調製の流れ（ワークフロー）NTera 2 （NT2）細胞を±レチノイン酸（RA）添加後 4日間96ウェルプレートで培養し、PBSでの洗浄後、30μlのSingleShot Cell Lysisバッファーで可溶化を行う。（約5×103個の細胞を各ウェルに播種、4日間培養を行い、およそ2.5×104個の細胞を回収）それぞれのウェルのセルライセートを2つに分割する：

（1） 5μlのセルライセートにProteinaseKとDNaseを加えたSingleShotバッファーを加え、ゲノムDNAを分解。リアルタイムPCR用サンプルとして利用。

（2）残った25μlのセルライセートに8.3μlの4× Laemmliサンプルバッファーを加え、ウェスタンブロッティング用サンプルとして利用。

NT2 cells ±RAstimulation（96-well plate）

Transfer 5μl of cell lysateto PCR plate for

RNA analysis

Remaining 25μl of celllysate for protein

analysis

Add 8.3μlLaemmli Buffer

Perform western blot analysison protein lysates

Add 25μl RNAlysis buffer

25℃ for 10 min, 37℃ for 5 min,75℃ for 5 min

Perform RT-qPCRanalysis on RNA lysates

Aspirate culture mediaand wash cells with PBS

Add 30μl ofSingleShot Cell Lysis Buffer


まとめ通常、リアルタイムPCRによるmRNA解析とウェスタンブロッティングに

よるタンパク質解析の両方を行う場合、細胞数確保のため培養スケール

が大きくなりがちですが、今回示したようにSingleShot Cell Lysisバッ

ファーによる可溶化溶液は両方の実験に使用でき、96ウェルプレートの

培養スケールでも十分であることがわかります。特に初代培養細胞など

細胞数に限りがある場合に有効です。その他、培養にかかる時間の短縮、

レプリケート数を増やすことによる統計的有意性にも有効となりえます。

本稿は、技術資料6774から抜粋、翻訳したものです。詳細な内容や実

験条件、引用論文等は割愛させていただいております。

詳細につきましては技術資料6774、培養スケール別の実験プロトコー

ルは技術資料6776をご覧ください。

図２　NT2細胞におけるNANOG, OCT4A, HOXB3 mRNAおよびタンパク質レベルへのレチノイン酸の影響A：ウェスタンブロッティング結果。コントロール細胞とレチノイン酸処理細胞（共にN=2）から得たライセートをCriterion TGX Stain-Freeゲル（Any kD）で分離し、化学発光により検出を行った。NANOG, OCT4A, HOXB3の各シグナルは、Stain-Freeイメージより得た総タンパク質量によりデータ補正を行った。B：リアルタイムPCR結果。NANOG, OCT4A, HOXB3のmRNAレベル確認実験はN=2にて3度行い、そのうちの1つを示した。

120%

Nor

mal

ized

to

tota

l pro

tein

load

Sta

in-f

ree

imag

eS

tain

-fre

e im

age

Sta

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imag

e

Control RA（4 days）



Con

trol

RA（

4 da

ys）

100%

80%

60%

40%

20%

0%

120%

Nor

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NANOGNANOG

OCT4AOCT4A

HOXB3HOXB3

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RFU

102

0 10 20

Cycles

30 40

B．RNA AnalysisA．Protein Analysis

RFU

102

0 10 20

Cycles

30 40

RFU

102

0 10 20

Cycles

30 40

Ordering Informationカタログ番号品名価格1725095 SingleShot SYBR Green One-Step Kit （50μl×100反応） ¥90,0001725070 SingleShot Probe One-Step Kit （50μl×100反応） ¥88,0004568126 ミニプロティアンTGX Stain-Freeゲル Any kD 15well （10枚, プレキャストゲル） ¥22,6005678124J10 Criterion TGX Stain-Freeゲル Any kD 18well （10枚, プレキャストゲル） ¥30,5001610183 TGX Stain-Free FastCastアクリルアミド溶液キット 10% （ミニゲル約60枚分, 自作ゲル用） ¥23,000

* PrimePCR（検証済プライマーセット）の詳細は10ページをご覧ください。

Bio-Rad News6

概要シングルセル分析は、生物学的パスウェイおよびプロセスにユニークな

視点を提供する強力な手法です。ここでは、単離されたシングルセル内

で最大100遺伝子の迅速かつ正確な定量を可能にする堅牢なワークフ

ロー（図１）を提示します。

私たちは、ヒト幹細胞モデル系（図２）で分化を研究するためにこのワー

クフローを使用しました。168個のシングルセルについて 16遺伝子（表２）の発現レベルをマルチプレックスリアルタイム定量PCRにより定量し

ました。細胞培養から結果出力までの全実験は2日で完了しました。

5000データポイント以上の結果を得るために必要な384ウェルPCRプ

レートはたった2枚だけでした。

分化する細胞群における遺伝子発現未処理のコントロール用NT2細胞並びにレチノイン酸（RA）を低用量

（Low）と高用量（High）で８日間処理したNT2細胞群をリアルタイム

PCRにより分析しました。

ここでは幹細胞マーカーであるNANOG、神経細胞マーカーである

HOXA5とLEFTY2の3群それぞれの増幅結果を図３に示しています。

また表１にそれぞれの遺伝子で最も発現が高いサンプルを100%として

標準化した比較を示しています。

その結果、細胞集団が神経細胞へと分化する間に特定の遺伝子発現パ

ターンの変化が観察されました。またRA-Lowの細胞群に関しては他と

は異質な発現パターンが示されました。

シングルセルでの遺伝子発現解析の方法NT2細胞の3群：RA-Low（0.25μM）,RA-High（10μM）,コントロール

（未暴露：0μM）を回収して、TC20全自動セルカウンター（カタログ番号：

1450101J1）にて細胞数を計数した後、セルストレーナーを通したサン

プルをS3eセルソーター（カタログ番号：1451005J1）にてあらかじめ

4μlのSingleShot Cell Lysis Buffer（カタログ番号：1725080）を分注

した8wellストリップPCRチューブにシングルセルソーティングを行った。

シングルセルソーティング後、逆転写酵素（iScript Advanced cDNA

Synthesis Kit カタログ番号：1725037）T100サーマルサイクラー（カ

タログ番号：1861096J1）を用いて、cDNA合成を行い続けてPre-

Amplificationを行った。

Pre-Amplication後のcDNAサンプルを96well PCRプレートに移

して4種類のプローブ（表２）、iQ Multiplex Powermix等を加えて、

CFX384 TouchリアルタイムPCR解析システム（カタログ番号

1855484J1）で増幅・分析をした。

（本プロコールの詳細については弊社Bulletin6777 Protocol for

Single Cell Gene Expression Profiling by Multiplex RT-qPCRを

ご参照ください）

PrimePCRアッセイを用いた4-plex反応による16遺伝子の解析マルチプレックス定量PCRにはバイオ・ラッド社のカスタムプライマー・

プローブパネルPrimePCRを使用した。

4種類の4-Plexパネルを用いて168個のシングルセルに対して16遺伝子

の発現解析を実施した。

マルチプレックスｑPCRによるハイスループットシングルセル遺伝子発現プロファイリング

Life Science Group2000 Alfred Nobel Drive

Hercules, CA 94547 USASteven Okino, Michelle Kong, Jason Ma, Joshua Fenrich, Luca Boveri, Yann Jouvenot and Yan Wang

High Throughput Single Cell GeneExpression Profiling by Multiplex qPCR

Single cell analysis is a powerful technique that provides a unique perspective on biological pathways and processes. Here we present a robust workflow that enables fast and accurate quantification of up to 100 genes in isolated single cells. We used this workflow to study differentiation in a human stem cell model system. The expression levels of 16 genes were quantified in 168 single cells by multiplex real-time qPCR. The entire experiment, from cultured cells to results, can be completed in 2 days and requires only two 384-well qPCR plates to generate over 5000 data points.

Abstract 16 genes analyzed in four 4-plex reactions using PrimePCR assays

Gene expression in 168 differentiating single cells

Principle component analysisLEFTY2 marks early differentiation

Single cell gene quantification is accurate

Summary and conclusions

Single cell analysis workflow

Model system of stem cell differentiation

Gene expression in differentiating cell populations

Methods: Control NT2 cells and NT2 cells treated with low and high doses of RA for 8 days were analyzed by qPCR. Findings: We observe specific patterns of gene expression changes in cell populations during neural differentiation. Questions: Specific changes during neural cell differentiation Level of heterogeneity of the RA-low population

NTera2 cells (NT2) are a model system of human stem cell behavior. When treated with retinoic acid (RA), NT2 differentiate into neurons. During differentiation the expression of stem cell genes decrease and the expression of neural genes increase.

Bio-Rad’s single cell analysis workflow uses reagents and instruments designed to work together

Findings: 1. Control cells are different than the RA treated cells2. Some RA-low cells are similar to the RA-high cells3. Other RA-low cells constitute a unique group

Findings: In cells treated with a high dose of RA LEFTY2 expression peaks at 3 days and declines thereafter. LEFTY2 is thus a potential marker of early differentiation. (Note: Single cell analysis occured at day 8 of RA exposure).

We have developed a protocol for single cell gene expression analysis using Bio-Rad products and instruments designed to work together.

Because gene expression quantification is by multiplex qPCR the protocol is fast and cost efficient. 168 single cells can be analyzed for 16 targets in 2 days using only two 384-well qPCR plates. By comparing population data with single cell data we conclude that (a) the single cell data is accurate and (b) analysis of 100s of single cells is sufficient to reflect the population.

In NT2 cells, LEFTY2 is a potential marker of early stage stem cell differentiation.

1.

2.

3.

4.

Each circle represents a single cell, there are 168 cells in three treatment groups plotted on the X-axis. Gene expression is plotted on the Y-axis and is an average of several genes within a specific group (reference, stem cell markers and neural cell markers). For each gene, the cell with highest expression was set at 100 and the expression in other cells was normalized accordingly. The expression of LEFTY2 in single cells is plotted on a separate chart.

Methods: Target gene expression was averaged over all single cells in a treatment group. The results were normalized and compared with similar data from the population study (table on left).

Findings: Because population data can be modeled by averaging its component single cells, it implies that (a) the single cell data is accurate and (b) the number of single cells analyzed is sufficient to reflect the population.

Differentiation, 28 days

OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1

Stem Cell Biomarkers

Neural Cell Biomarkers

NTera2 Cells Nerve Cells

1. Sort single cells

S3e Cell Sorter

Sso Advanced PreAmp + PrimePCR

PreAmp Assays

iQ Multiplex Powermix+ PrimePCRProbe Assays

CFX384Touch

CFX Manager

SingleShotCell Lysis Kit

iScript AdvancedcDNA Synthesis Kit

2. Cell lysis, gDNA digestion 3. cDNA synthesis

5. Multiplex qPCR 6. Analyze data4. Pre-amplifiy target genes

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Population NANOG HOXA5 LEFTY2Control 100% 0% 1%RA-Low 18% 50% 100%RA-High 5% 100% 6%

Single Cell NANOG HOXA5 LEFTY2Control 100% 1% 1%RA-Low 7% 61% 100%RA-High 2% 100% 16%

C ontrolR A-low (0.25 µM)

R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

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75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2

C ontrol R A-low R A-high




Gene Type Probe Gene Type Probe Gene Type Probe Gene Type ProbeTBP Ref FAM TDGF1 Stem FAM LEFTY2 Neural* FAM HOXB3 Neural FAMTFRC Ref HEX OTX2 Stem HEX MEIS1 Neural HEX HOXB2 Neural HEXB2M Ref Tex615 NANOG Stem Tex615 HOXD4 Neural Tex615 HOXA5 Neural Tex615PGK1 Ref Cy5 POU5F1 Stem Cy5 PAX6 Neural Cy5 HOXA4 Neural Cy5

C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d

Days RA exposure (10 µM)

LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5





















1.

2.

3.

4.





OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1





S3e Cell Sorter


PreAmp Assays


CFX384Touch

CFX Manager





Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU




R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

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50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2






C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d


LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5

図１　シングルセル分析ワークフロー

図２　幹細胞分化モデルNTera2（NT2）細胞はヒト幹細胞の挙動のモデル系です。レチノイン酸（RA）で処理した場合に、NT2はニューロンへ分化します。分化中は幹細胞遺伝子の発現が減少し、神経細胞の遺伝子発現が増加します。

表１　各サンプルの発現パターン比較

細胞群 NANOG HOXA5 LEFTY2

Control 100% 0% 1%

RA-Low 18% 50% 100%

RA-High 5% 100% 6%





















1.

2.

3.

4.





OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1





S3e Cell Sorter


PreAmp Assays


CFX384Touch

CFX Manager





Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU




R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2






C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d


LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5

図３　コントロール、RA-Low、RA-Highの3群での3遺伝子の遺伝子発現


168個の分化したシングルセルの遺伝子発現図４はCFX384 TouchリアルタイムPCR解析システムでのPrimePCRによる4-Plex遺伝子定量の結果です。

各プロットはシングルセルを示しており、3種類の処理群の168細胞がX軸上にプロットされています。遺伝子発現はY軸上にプロットされており、

特定の遺伝子群（リファレンス遺伝子、幹細胞マーカー、神経細胞マー

カー）内の平均です。各遺伝子について最も高い発現を有する細胞を

100として他の細胞を標準化しました。シングルセルにおけるLEFTY2の発現については図５に詳細解析があります。

LEFTY2は初期分化を示す。図５は細胞にRAを高濃度で処理した時のLEFTY2の発現量です。X軸

にRAに暴露した日数。Y軸にLEFTY2の発現量をプロットしています。

LEFTY2の発現は3日目でピークになりその後低下します。このように

LEFTY2は分化初期の潜在的なマーカーとなりえます。他のシングルセ

ル分析ではRAは8日間暴露しています。

主成分分析上記までの168個のシングルセルの遺伝子発現解析に関して3つの処理

群での主成分分析を行った。その結果以下のことが判明した。

1．コントロールはRA処理した細胞とは異なっている。

2．いくつかのRA-Low細胞はRA-High細胞に類似している。

3．その他のRA-Low群については固有のグループを構成している。

シングルセル遺伝子定量は正確です。各遺伝子の遺伝子発現量は処理群内のすべてのシングルセルを平均化

し、細胞群で算出した表２と比較しました。

その結果として、細胞群を構成する各シングルセルのデータを平均するこ

とで細胞群全体のデータを作成することができます。これはシングルセル

のデータが正確であることと、分析したシングルセル数は細胞群を反映

するのに十分な数であったことを意味します。

まとめ1．バイオ・ラッド製品を活用したシングルセル遺伝子発現解析のプロト

コールを開発しました。

2．マルチプレックス定量PCRプロトコールによる遺伝子発現定量は迅

速で低コストです。168個のシングルセルに対して16遺伝子の分析

をたった2枚の384well PCRプレートを用いて2日間で分析できまし

た。

3．細胞群データとシングルセルデータを比較することにより、我々はシ

ングルセルのデータが正確であり、約100個のシングルセル分析は

細胞群を反映するのに十分な分析するであることが判明しました。

4． NT2細胞では、LEFTY2は幹細胞から分化する初期ステージの潜在

的なマーカーである。

表２　PrimePCRの4-Plexパネル

4-Plex ① 4-Plex ②

遺伝子種別プローブ遺伝子種別プローブ

TBP Ref FAM TDGF1 Stem Cell FAM

TFRC Ref HEX OTX2 Stem Cell HEX

B2M Ref Tex615 NANOG Stem Cell Tex615

PGK1 Ref Cy5 POUSF1 Stem Cell Cy5

表２　PrimePCRの4-Plexパネル（続き）

4-Plex ③ 4-Plex ④

遺伝子種別プローブ遺伝子種別プローブ

LEFTY2 Neural FAM HOXB3 Neural FAM

MEIS1 Neural HEX HOXB2 Neural HEX

HOXD4 Neural Tex615 HOXA5 Neural Tex615

PAX6 Neural Cy5 HOXA4 Neural Cy5





















1.

2.

3.

4.





OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1





S3e Cell Sorter


PreAmp Assays


CFX384Touch

CFX Manager





Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU




R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2






C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d


LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5

図４　3処理群（コントロール,RA-Low,RA-High）168個のシングルセルの遺伝子発現結果

図５　高用量RA暴露日数とLEFTY2の発現量

図６　シングルセル遺伝子発現の主成分分析結果





















1.

2.

3.

4.





OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1





S3e Cell Sorter


PreAmp Assays


CFX384Touch

CFX Manager





Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU




R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2






C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d


LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5





















1.

2.

3.

4.





OCT4NANOG

Retinoic Acid

HOX genesNEUROD1





S3e Cell Sorter


PreAmp Assays


CFX384Touch

CFX Manager





Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU

Amplification

Cycles

RFU




R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)


R A-high (10 µM)

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

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50

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100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

25

50

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100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Reference genes

Stem cell markers

Neural cell markers

LEFTY2






C ontrol

R A-low

R A-high

0

20

40

60

80

100

0d 1d 2d 3d 4d 7d


LEFT

Y2 e

xpre

ssio

n

NANOG

LEFTY2

HOXA5

表３　シングルセルにおける遺伝子発現

シングルセル NANOG HOXA5 LEFTY2

Control 100% 1% 1%

RA-Low 7% 61% 100%

RA-High 2% 100% 16%

Bio-Rad News8

クロマトグラフィー装置を使うことは、難しいと感じているかも知れませ

ん。しかし、NGCクロマトグラフィーシステムをコントロールする

ChromLabソフトウェアは、直感的に操作でき、豊富なテンプレートを

使うことでメソッド作成も容易です。

2013年にNGCクロマトグラフィーシステムを販売して以来、今回、この

ソフトウェアが3回目の大きなバージョンアップになります。

直感的に理解可能なグラフィカルインターフェースNGCクロマトグラフィーの基本機能は、ホーム画面から簡単にアクセス

可能です。マニュアルコントロール（青枠）、メソッド作成（緑枠）、デー

タ管理、解析（オレンジ枠）は、操作毎に色分けされており、直感的に目

的の作業を行うことができます。

タッチパネルコントロールNGCクロマトグラフィーに付属するタッチパネルでは、バルブをクリック

するなど直感的にシステムの制御が可能です。ポンプ流速、%Bの設定、

検出波長の設定だけでなく、フラクションコレクターと連動した分取も可

能です。新バージョンでは、マニュアル操作時にもカラムスイッチングバ

ルブによる圧力検知機能が使えるようになりました。

実験手順にそったメソッド作成ChromLabソフトウェアは、メソッド作成も簡単です。豊富なテンプレー

トから、メソッドを選択すれば、あとは使用するシステム、カラム、フラ

クションサイズなどを設定するだけです。バージョンアップしたソフトウェ

アには、多次元精製（Mulit-D）のメソッドも入っているので、抗体精製

とバッファー交換を組み合わせた精製なども簡単に実施できます。

NGCクロマトグラフィー、ChromLab 4.0登場

NGC Discoverシステム


データ解析ChroLabソフトウェアでは、簡単にクロマトグラフィーのチャートから、

各フラクションのタンパク質量を算出可能です。Peak Integrationボタ

ンを押すだけで、ベースラインの補正も行います。またピークやフラクショ

ンの濃度に応じてデータ上に濃淡で表示されます。

さらに新バージョンでは、メソッド、Runデータ、解析結果だけでなく、

電気泳動した後のCBB染色したゲルの写真や、その他の関連情報（PDF,

Excel, Wordファイルなど）も一緒にデータベースに保管でき、実験の

一連の情報が確認しやすくなります。

ネットワーク対応1台のNGCシステムに、ハブを介して複数台のPCを接続することも可能

になります。また1台のPCで複数台のNGCシステムを制御することも可

能になります。本体の近くにPCを設置せずに、実験の準備などのマニュ

アル操作はタッチパネルで行い、メソッド作成、データ取得は居室のPCで行うこともできます。

その他さらにオートサンプラーの販売を開始いたしました。多種類のサンプル

の自動分析、分取が可能となります。標準モデルでは2mlバイアルが84本まで対応します（最大インジェクション容量2ml）。オプションの

PrepBio Kitを使うと最大5mlのサンプルの連続的なインジェクションも

可能になります。

新バージョンは、Windows 10にも対応するようになります。NGCクロ

マトグラフィーシステムでは、今回のソフトウェアのバージョンアップも無

料です。これからもNGCクロマトグラフィーシステムをご購入いただい

た方にはバージョンアップのお知らせをいたします。

NGC オートサンプラー

Ordering Informationカタログ番号品名価格NGCクロマトグラフィーシステム*7880001J1 NGC Quest 10 クロマトグラフィーシステム ¥5,200,0007880003J1 NGC Quest 10 Plus クロマトグラフィーシステム ¥6,500,0007880002J1 NGC Quest 100 クロマトグラフィーシステム ¥5,500,0007880004J1 NGC Quest 100 Plus クロマトグラフィーシステム ¥6,800,0007884004 NGC サンプルポンプ ¥800,0007884006 NGC インレットバルブ ¥300,0007884012 NGC カラムスイッチングバルブ ¥500,0007884013 NGC アウトレットバルブ ¥380,0007884010 NGC バッファーブレンディングバルブ ¥280,0007884011 NGC pHモニターバルブモジュール ¥320,000オートサンプラー7885012JA NGC オートサンプラー冷却機能付 ¥2,980,0007605012 C-96 Prep Bio Kit ¥860,0007605017 オートサンプラーアナリティカルバイオキット ¥120,000

* NGCクロマトグラフィーシステムは、本体の他、ノートPC、フラクションコレクター、付属品を含みます。 Questシリーズの他に、バルブ類を追加したScoutシリーズ、Discoverシリーズをご用意しています。

Bio-Rad News10

生体、細胞内の遺伝子の発現量の変化を調べることは、生物現象を理解

する上で、非常に重要です。解析したい遺伝子はそれぞれ違うため、解析・

検出するための特異性が高いアッセイプライマー、プローブの設計が必

要となります。

PrimePCR プライマー＆アッセイのリアルタイムPCR用プライマーはド

ロップレットデジタルPCR用に販売していたプローブと同様に信頼性の

高いアルゴリズムにより設計されています。またヒト・マウス・ラットの

プレデザインされたPCRプライマーセットはすべてラボにて検証実験が

行われ、そのパフォーマンスが確認されています。

特長□ 検証済みアッセイプライマー、プローブ多数カスタムアッセイ

□ プレデザインされたパスウェイパネル

□ カスタムプライマー、プレートも設計

バイオ・ラッドは、リアルタイムPCRの研究リーダーの一つである

Biogazelle社と共同して、ヒト、マウス、ラットのトランスクリプトーム

に対するリアルタイム用のPCRプライマーを設計しました。このプライ

マーは、MIQEガイドライン（Bustin et al. 2009）に適合しており、定

量的PCRによる発現解析実験を論文で発表する際に必要な要件を満た

しています。また設計した全てのPCRプライマーは、実際にラボで特異

性、増幅効率等検証し、その結果を公開しています。

PrimePCR プライマー＆アッセイ発売開始！ for リアルタイムPCR and デジタルPCR

PrimePCR Assay Validation Report

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Products used to generate validation dataReal-Time PCR Instrument CFX384 Real-Time PCR Detection System

Reverse Transcription Reagent iScript™ Advanced cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR

Real-Time PCR Supermix SsoAdvanced™ SYBR® Green Supermix

Experimental Sample qPCR Human Reference Total RNA

Data InterpretationUnique Assay ID This is a unique identifier that can be used to identify the assay in the literature and

online.

Detected Coding Transcript(s) This is a list of the Ensembl transcript ID(s) that this assay will detect. Details foreach transcript can be found on the Ensembl website at www.ense mbl.org.

Amplicon Context Sequence This is the amplicon sequence with additional base pairs added to the beginningand/or end of the sequence. This is in accordance with the min imum information forthe publication of real-time quantitative PCR experiments (MIQE ) guidelines. Fordetails, please refer to the following publication, "Primer Seq uence Disclosure: AClarification of the MIQE Guidelines" (Bustin et al 2011).

Chromosome Location This is the chromosomal location of the amplicon context sequen ce within thegenome.

Assay Design Exonic: Primers sit within the same exon in the mRNA transcript and can potentiallyco-amplify genomic DNA. If performing gene expression analysis , it is suggested thatthe samples be treated with a DNase to eliminate potential unwa nted signal fromcontaminating genomic DNA.

Exon-exon junction: One primer sits on an exon-exon junction i n mRNA. Whenperforming gene expression analysis, this design approach will prevent unwantedsignal from contaminating genomic DNA.

Intron-spanning: Primers sit within different exons while spann ing a large intron in themRNA (intron is greater than 750bp). When performing gene expr ession analysis,this design approach should limit potential unwanted signal fro m contaminatinggenomic DNA.

Small intron-spanning: Primers sit within different exons with a short intron inbetween (intron is smaller than 750bp). Small introns may not prevent unwantedsignal from contaminating genomic DNA.

Efficiency Assay efficiency was determined using a seven-point standard curve from 20 copiesto 20 million copies. While an efficiency of 100% represents a perfect doubling oftemplate at every cycle and is ideal, typical ranges of good assay efficiency arebetween 90-110%. For difficult targets, assay efficiency outside of this range areaccepted and reported accordingly.

R2 The R2 represents the linearity of the standard curve and how well th e standard curvedata points fit the linear regression line. Acceptable values are >0.98.


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Gene InformationGene Name breast cancer 1, early onset

Gene Symbol BRCA1

Organism Human

Gene Summary This gene encodes a nuclear phosphoprotein that plays a role in maintaining genomicstability and it also acts as a tumor suppressor. The encoded protein combines withother tumor suppressors DNA damage sensors and signal transducers to form a largemulti-subunit protein complex known as the BRCA1-associated gen ome surveillancecomplex (BASC). This gene product associates with RNA polymerase II and throug hthe C-terminal domain also interacts with histone deacetylase c omplexes. This proteinthus plays a role in transcription DNA repair of double-strande d breaks andrecombination. Mutations in this gene are responsible for appro ximately 40% ofinherited breast cancers and more than 80% of inherited breast and ovarian cancers.Alternative splicing plays a role in modulating the subcellular localization andphysiological function of this gene. Many alternatively spliced transcript variants someof which are disease-associated mutations have been described for this gene but thefull-length natures of only some of these variants has been described. A relatedpseudogene which is also located on chromosome 17 has been iden tified.

Gene Aliases BRCAI, BRCC1, BROVCA1, IRIS, PNCA4, PSCP, RNF53

RefSeq Accession No. NC_000017.10, NG_005905.2, NT_010783.15

UniGene ID Hs.194143

Ensembl Gene ID ENSG00000012048

Entrez Gene ID 672

Assay InformationUnique Assay ID qHsaCID0020613

Assay Type SYBR® Green

Detected Coding Transcript(s) ENST00000357654#ENST00000471181#ENST00000493795#ENST00000461574#ENST00000412061#ENST00000354071#ENST00000346315#ENST00000309486

Amplicon Context Sequence TGGAAGGGTAGCTGTTAGAAGGCTGGCTCCCATGCTGTTCTAACACAGCTTCTAGTTCAGCCATTTCCTGCTGGAGCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGTATCCCTCTGCTGAGTGGTTAAAATGTCACTCTGAGAGGATAGCCCTGAGCAGTCTTCAGAGACGCTTGTTTCACTCTCACACCCAGATGCTGCTTCACCTAAGTTTGAATCCATGCTTTGCTCTT

Amplicon Length (bp) 195

Chromosome Location 17:41234484-41243478

Assay Design Intron-spanning

Purification Desalted

Validation ResultsEfficiency (%) 98


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BRCA1, HumanAmplification PlotAmplification of cDNA generated from 25 ng of universal referenc e RNA

Melt PeakMelt curve analysis of above amplification

Standard CurveStandard curve generated using 20 million copies of template di luted 10-fold to 20 copies

PrimePCR™ 　リアルタイムアッセイ用製品

プレデザイン　SYBR Greenアッセイヒト、マウス、ラットのトランスクリプトームを網羅したSYBR Greenアッセイ用プライマー。200, 1000, 2500反応分のサイズ

DNAテンプレートリアルタイムPCRのポジティブコントロール実験のために設計された、遺伝子特異的な合成DNAテンプレート

プレデザイン　Probeアッセイ幅広いトランスクリプトームを網羅した遺伝子発現解析用プローブアッセイ。500, 1000, 2500反応分のサイズ、各種蛍光ラベルが選択可能

各種コントロール逆転写反応、RNA品質、ゲノムDNAの混入、PCR反応の評価のための各種コントロール

PreAmpアッセイ標的遺伝子のPreAmpするための、高濃度のプライマー。SYBR Greenアッセイ、Probeアッセイ用の100反応分のサイズ

カスタムアッセイプレデザインにないプライマー、プローブもオーダー可能

感度 20 コピーを正確に検出

特異性プライマーダイマーの形成や、ゲノム DNA に反応性は低くなるように設計。増幅産物は次世代シーケンサーで確認

増幅効率 90-110%

ダイナミックレンジ最低 6 オーダー。合成テンプレートを使った検量線では、20 から 2000 万コピーを検出

R2 ＞ 0.99


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online.











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Gene Symbol BRCA1

Organism Human






Entrez Gene ID 672











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Gene Symbol BRCA1

Organism Human






Entrez Gene ID 672











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online.











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Gene Symbol BRCA1

Organism Human






Entrez Gene ID 672











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プレデザインパスウェイパネル病気や代謝、シグナルパスウェイに関連した9000種以上のプレデザインされたプレートをご用意

カスタムPCRプレート

解析したい遺伝子用のSYBR Greenアッセイ用のプライマーを96ウェルや384ウェルフォーマットでご提供

動物種

シングルアッセイ96ウェルおよび384ウェルでのプレデザインプレート＊

96ウェルおよび384ウェルでのカスタムプレート＊

インターカレーション色素および加水分解プローブアッセイ

＊加水分解プローブアッセイのプレートでの提供はしておりません＊＊マルチスクリーニングキットは、変異の有無を検出するキットです（裏表紙参照）

シングルアッセイマルチスクリーニングキット＊＊

ドロップレットデジタルPCRアッセイリアルタイムPCRアッセイ

PrimePCRアッセイ選択ガイド

Human, mouse, rat, yeast, rhesus monkey, arabidopsis, dog, chicken, zebrafish, cow, pig, rabbit

Gene expressionPreamplification

Human, mouse, rat

Copy number variationMutation detectionGene expression

ケミストリー

アプリケーション

フォーマット

Coming Soon!


解析したい遺伝子のプライマー、アッセイは、WEBで簡単に検索可能

です。qPCR、Droplet Digital PCR（ddPCR）のアッセイ機器を選択後、

アッセイケミストリー、アプリケーションを選択し、検索キーワードを入力

します。

また関連遺伝を含むプレートを検索したい場合などは、Lookupツール

を使った検索方法がお奨めです。

アポトーシス関連パネルの例：このマップの関連遺伝子43個とコントロー

ル遺伝子が96ウェルプレートに分注されている。

プレデザインされたPrimePCR、パスウェイパネル、疾患パネルは

U. S. National library of Medicine（NIH）のデータベースを参照しデ

ザインされています。疾患パネルは特定の病理学的知見に基いた遺伝子

発現差の網羅的解析を可能にします。それぞれの疾患ステージに対する

遺伝子ターゲットは、①バイオマーカー研究における遺伝子発現変化の

頻度、②医学研究全般での注目度、③近年特に注目されている因子、の

基準に従って比較され、ランク付けされています。

この基準より得られた遺伝子のスコアーを元にリアルタイムPCRパネル

は設計されています。非常に高い注目遺伝子を含む疾患には複数種類の

プレートをご用意しています。Tier1プレートは注目度の高いターゲット

を網羅的に含むアッセイプレートです。

すべての検証済みのプライマーは、iScript Advanced cDNA Synthesis

Kit for RT-qPCR（1725037）で逆転写したcDNAを使い、SsoAdvanced

SYBR Green Supermix（1725271）を使って検証しています。また、

自動化されたCFX384 Touch リアルタイムPCR定量システムを使って

います。デジタルPCR用のプライマー、プローブは、QX200システム

を使って検証されています。

得られた各遺伝子の増幅曲線、融解曲線などのデータは、WEBからダ

ウンロードすることが可能です。


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online.











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Gene Symbol BRCA1

Organism Human






Entrez Gene ID 672











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CFX リアルタイム

Droplet Digital PCR　QX200

ご注文方法PrimePCR製品のご注文の際には、バイオ・ラッドの

ホームページから登録が必要です。

ご希望の製品を検索し、ショッピングカートに追加してい

ただきまして、オーダーフォーム（専用注文書）を取得し

てください。ご注文の際は、このオーダーフォームを販売

代理店様にお渡しください。

詳細は、　PrimePCR　で検索

近日発売予定 !

測定原理　キットに含まれる混合プローブ（変異検出プローブ）と1種類

の野生型（WT）検出プローブおよびプライマー、スーパーミックス試薬

が梱包されています。全ての変異検出用プローブにはFAMが、野生型

検出用のプローブにはHEXが設計されており、FAMとHEXの蛍光検出

により変異の比率をコピー濃度にて算出することが可能です。

構成品・複数の加水分解プローブおよびddPCR用のプライマー

・2×1ml ddPCR supermix for probes （no dUTP）

１キットに200アッセイ分の試薬が梱包されています。※サンプルにより制限酵素およびUDGが別途必要となります。

絶対定量・高感度・高精度・高処理性とバランスの良いデジタルPCRシ

ステムとして研究者の方々にご好評いただいておりますDroplet Digital

PCRシステム QXシリーズ（QX100/QX200）は既に400報を超える文

献が報告されています。今回、このシステムに特化した変異検出キットで

あるPrimePCR for ddPCR KRASマルチスクリーニングキットに新た

なRASファミリーおよびBRAFのラインナップが加わりました。全てのキッ

トは1ウェルにてドライバー遺伝子の複数変異を迅速スクリーニングでき

るよう設計されています。

PrimePCRTM for ddPCRTM マルチスクリーニングキット新シリーズ登場

図１　シグナル伝達模式図

Ordering Informationカタログ番号品名対象遺伝子変異1863506 PrimePCR for ddPCR KRAS マルチスクリーニングキット G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D12001006 PrimePCR for ddPCR NRAS Q61 マルチスクリーニングキット Q61H （183A＞C）, Q61H （183A＞T）, Q61K, Q61L, Q61R12001037 PrimePCR for ddPCR BRAF V600 マルチスクリーニングキット V600E, V600K, V600R12001094 PrimePCR for ddPCR NRAS G12 マルチスクリーニングキット G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V 12001626 PrimePCR for ddPCR KRAS Q61 マルチスクリーニングキット Q61H （183A＞C）, Q61H （183A＞T）, Q61K, Q61L, Q61R12001627 PrimePCR for ddPCR NRAS G12/G13 マルチスクリーニングキット G12A, G12C, G12D, G12S, G12V, G13D, G13R, G13V

各キットは200反応分試薬が梱包されており価格はすべて¥193,000です。個別の変異を解析するためのシングルプレックスキットもご用意しております。当キットは研究用試薬であり、QX100/QX200 Droplet Digital PCRシステムにおける専用試薬です。対象生物種はヒトです。

□ 複数の変異の有無が1ウェルにてスクリーニング可能□ 変異検出感度≦0.5%を実現□ cfDNA、FFPEサンプルからも検出可能　　※本キットは研究用試薬です。

PrimePCRTM for ddPCRTM マルチスクリーニングキットKitの特長

表１　注目度の高い各種癌のドライバー遺伝子

遺伝子 LungCancer

ColorectalCancer

OvarianCancer

ThyroidCancer Melanoma GIST* Glioma Breast

CancerPancreatic

CancerBRAF ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦KRAS ◦ ◦ ◦ ◦ ◦NRAS ◦ ◦ ◦ ◦EGFR ◦PIK3CA ◦ ◦ ◦ ◦* GIST, gastrointestinal stromal tumor. EGFR, PIK3CA関連キットも近日中に発売を予定しております。

NEW

C10760 1606A

バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社ライフサイエンス

取扱店www.bio-rad.com 本　　　社〒140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 TEL：03-6361-7000大阪営業所〒532-0025 大阪市淀川区新北野 1-14-11 TEL：06-6308-6568福岡営業所〒812-0013 福岡市博多区博多駅東 2-5-28 TEL：092-475-4856　　　　　　　　　　　　　　　　　* 学術的お問い合わせは TEL：03-6404-0331

＊価格（税抜き）、仕様などは予告無く変更することがありますので、ご了承ください。＊価格は 2016年 6 月現在のもので、メーカー希望小売価格（税別）です。※本カタログに記載されている会社名、商品名は各社の商標または登録商標です。

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Bio-Rad News€¦ · Bio-Rad News Vol.8 Contents 2016年5月 ウェスタンブロッティング実験を加速するトランスブロットTurboブロッティングシステム

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