Cahier de TP d’Hémato-biochimie ANNEE 2013-2014 · Objectifs du TP • Pas de redite ... • Chez chien et chat : ... • Souvent avec polyglobulie physiologique associée (contraction

Réalisation : Dr. Eve Ramery

LABORATOIRE DE BIOLOGIE CLINIQUE, Faculté de Médecine Vétérinaire , ULg 1

Cahier de TP d’Hémato-biochimie

ANNEE 2013-2014

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PREPARATION AUX TP DE BIOCHIMIE - ANNEE 2013-2014

Objectifs du TP

• Pas de redite du cours

• Mise en application du cours (interprétation de profils complets)

• Acquisition des gestes techniques de base

– Réaliser un frottis

– Utilisation du microscope

Prérequis

• Début des TP 9h00

• Avoir la blouse sinon pas de TP

• Avoir à disposition le cours et le cahier de TP (disponibles sur my ulg)

• Le cours est accessible en ligne :

• http://www.fmv-dsfo.ulg.ac.be/biomol/pwd_telechargement_2annee.php

• Intitulé du cours : Biochimie médicale vétérinaire

• Mot de passe : biochimie2m

Lien internet utile : La plupart des photos de l’atlas en sont tirées

http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/

http://www.fmv-dsfo.ulg.ac.be/biomol/pwd_telechargement_2annee.php

http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/

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Biochimie

• Le foie

– Intégrité des hépatocytes

• AST, ALT, GLDH, SDH, OCT, bilirubine

– Ex : Intoxication aux alpha-toxines cheval

– Cholestase

• PAL, GGT, bilirubine

– Ex: lipidose hépatique chez le chat

– Fonction hépatique

• Acides biliaires, ammonium, bilirubine, albumine (hypo),

facteurs de coagulation (quick, tck, ATIII)

– Ex: shunt porto-systémique

• Le rein

– Non-spécifique

• Protéines totales

• Albumine

• Phosphates

• GR, Htc., MCV

– Pseudo-spécifique

• Urée

• Créatinine

– Spécifique

• Analyse d’urine

– Densité urinaire

– Rapport Protéines/Créatinine urinaires

– Culot urinaire

• Le pancréas

– Non-spécifique

• Amylase (rein aussi)

• Lipase (rein aussi)

• Cholestérol (hypercholestérolémie en cas de pancréatite)

• Leucopénie/leucocytose/left shift (pancréatite)

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• Souvent les enzymes hépatiques sont affectées en cas de

pancréatite

– Spécifique

• cPLI, fPLI (Iddex): pancreatic lipase immunoreactivity

– Pancréatite

• TLI: Trypsin-like immunoreactivity

– Insuffisance du pancréas exocrine

• Maldigestion-Malabsorption

– Non-spécifique

• Protéines totales

• Albumine

• Triglycérides

• Cholestérol

• Temps de coagulations (facteurs vitamine K dépendants)

– Spécifique

• Folates

• B12

• Evaluation du pancréas (TLI)

• Le muscle

– Non-spécifique

• AST, ALT, LDH

– Spécifique

• CPK

• Myoglobinurie

• Homéostasie du glucose

– Hyperglycémies

• De stress

• Post-prandiales

• Cortico-induites

• Endocriniennes(diabète, cushing, diestrus prolongé)

– Glucosurie sans hyperglycémie

• Dommage tubulaire congénital ou acquis

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– Fanconni

– Leptospirose

– Hypoglycémie

• D’effort

• Peri-partum

• Insulinome

• La coagulation

– Primaire

• Plaquettes

– Nombre

– Fonction

• Facteur de vwb

– Secondaire

• Quick (voie extrinsèque + commune)

• APTT (voie intrinsèque + commune)

• Temps de thrombine (voie commune)

• Fibrinogène (voie commune-inflammation)

• Anti-thrombine (inhibiteur de la voie commune)

– Fibrinolyse

• D-dimères

• PDF

– Récapitulatif CIVD

• Hypercoagulabilité suivie d’une hypocoagulabilité par

consommation des plaquettes et des facteurs de coagulation

– Thrombocytopénie

– Temps de coagulation tous prolongés

– Fibrinogène diminué (parfois non car inflammation

concommitente: l’inflammation augmente le

fibrinogène)

– FDP et D-dimères augmentent

– Cliniquement: pétéchies

– Poïkilocytose au frottis souvent

! Attention!!! Temps de coagulation sur tube citrate UNIQUEMENT

Le délai a de l’importance: APTT ininterprétable passé 12h post-prélèvement!!!

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Hématologie

I. Rappels théoriques :

• Globules rouges

– Erythrocytose

- Relative (Déshydratation)

- Absolue physiologique (contraction splénique)

- Absolue pathologique (rare : Polycythemia vera)

– Anémie

- 1) Déterminer si elle est régénérative

• Chez chien et chat : voir les valeurs absolues des réticulocytes.

Régénératif si :

• > 100.000/µl (chien)

• > 75.000/µl (chat)

• Chez les ruminants et chevaux, respectivement peu et pas de

réticulocytes. Régénératif si :

• Anémie macrocytaire hypochrome

• Piquetage basophile des globules rouges

• Anémie non-régénérative

• Inflammation chronique

• Insuffisance rénale

• MO

• Carence (eg fer, cuivre)

• Médiation immune

• Anémie régénérative

• Hémorragie (régénération apparaît 4-5 jours après)

• Hémolyse


• Fragmentation des GR (au frottis : schistocytes,

kératocytes, acanthocytes)

• CIVD

• Vasculite

• Hemangiosarcome

• Infection (Mycoplasmes, FeLV, babesia)

• Désordres métaboliques (eg. Stress oxydatif)

- 2) Définir l’anémie sur base des paramètres du profil

hématologique

• MCV=VGM= volume globulaire moyen

• Volume des globules rouges : qualifie l’anémie de

• Macrocytaire

• Normocytaire

• Microcytaire

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• MCH =HCM= Hemoglobine (Hb) corpusculaire moyenne

• Quantité d’Hb dans un globule rouge

• MCHC=CCMH= Concentration corpusculaire moyenne en

hémoglobine.

• Donne une idée de la dilution de l’Hb dans le GR et

donc de la couleur, qualifie l’anémie de

• Hypochrome

• Normochrome

• L’hyperchromie n’existe pas. Si le CCMH est

augmenté, cela signifie la présence d’hémolyse.

– Anomalies morphologiques

- Anisocytose : différentes tailles de globules rouges : les globules

rouges deviennent plus petits en vieillissant, les réticulocytes sont plus

grands.

- Polychromatose : différentes couleurs de globules rouges: Plus pâles en

cas d’hypochromie, les réticulocytes sont plus bleus.

- Poikilocytose : différentes formes de globules rouges (voir Atlas en fin

de cahier)

- Inclusions (corps de Howell-Jolly, GR nucléés=erythroblastes)

• Globules Blancs

– Leucopénie : - La demande excède la production.

• Défaut de synthèse (MO)

• Surconsommation (inflammation aigue)

– Leucocytose

- Leucogramme lié à la présence de corticoïdes (endogènes :stress,

cushing ; ou exogènes : iatrogénique)

• Neutrophilie

• Lymphopénie

• Eosinopénie

• Parfois monocytose

- Leucogramme adrénergique (exercice, stress)

• Lymphocytose

• Parfois neutrophilie

• Souvent avec polyglobulie physiologique associée (contraction

splénique)

- Inflammation

- Stimulation de la moelle osseuse (AHMI, Syndrome para-néoplasique)

- Leucémie

– Neutropénie (cf leucopénie)

– Neutrophilie

- Corticoïdes

- Inflammation

- Réaction leukémoïde :

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• réaction inflammatoire extrême : jusqu’à 70.000 neutrophiles

/µl

• se rencontre notamment de processus infectieux d’origine

bactérienne de type pyomètre, syndrome para-néoplasique,

IMHA

• s’accompagne généralement (presque toujours) d’un left shift et

de modifications toxiques des neutrophiles (corps de Dhöle,

basophilie, vacuolations)

- Leucémie neutrophilique chronique (rare : la neutrophilie doit être

extreme >50.000/µl)

– Left shift des neutrophiles - virage à gauche de la formule d’Arneth ie. neutrophiles immatures et

hyposegmentés : bands, métamyélocytes.

– Modifications toxiques des neutrophiles

- Corps de Dhöle, basophilie, vacuolations, granules magenta

- Accompagnent généralement un processus inflammatoire d’origine

septique (ie infectieuse, le plus souvent bactérienne, le plus souvent

gram négatives)

– Lymphopénie

- Corticoïdes

- Inflammation aigue

- Perte de lymphe (eg. Chylothorax)

– Lymphocytose

- Stimulation adrénergique

- Inflammation chronique

- Stimulation antigénique (vaccin)

- Lymphome

- Leucémie lymphoïde

- Hypoadrénocorticisme

– Monocytose

- Inflammation

- Corticoïdes

- Leucémie monocytique ou myélomonocytique

– Eosinophilie

- Hypersensibilité (allergies)

- Parasitisme (ectodermes et parasites tissulaires migrants)

- Dégranulation des mastocytes

- Conditions idiopathiques (eg. Gastroentérite éosinophilique)

- Paranéoplasique (eg. tumeurs mastocytaires)

– Basophilie

- Réactions allergiques

- Parasitisme

- Paranéoplasique

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• Plaquettes

– Thrombocytopénie

- En l’absence d’autre désordre, on a rarement de prolongement du temps

de saignement tant qu’on n’est pas < 50.000 plaquettes/µl, et rarement

de saignement spontanés avant <20.000 plaquettes/µl

- En premier lieu, vérifier que la thrombocytopénie est vraie !!!

- Très souvent, la formation d’amas plaquettaires empêche un comptage

correct (surtout chez le chat mais aussi chez les autres espèces). La

présence d’amas se vérifie à faible grossissement en queue de frottis.

- Si les amas sont présents : le comptage est sous-estimé par l’automate.

- Diagnostique différentiel

• Sequestration (rate)

• Défaut de production (chimio, oestrogènes, leucémie)

• Infection (presque toujours en cas de maladies transmises par

les tiques)

• Congénital chez les Cavalier King Charles : sans signes

cliniques associés


• CIVD

• Néoplasie

• Hémorragie aigue et sévère (intoxication aux rodenticides)

– Thrombocytose - Réactive secondaire le plus souvent

• Stimulation adrénergique

• Inflammation

• Carence en fer

• Rebond suite à thrombocytopénie

• Hémorragie

• Post-splénectomie

• Néoplasme non-hémique

• Néoplasme hémique

• Agents infectieux sanguins

– L’identification de la plupart des agents infectieux dans le sang nécessite une

certaine expérience. De plus nombre d’entre eux (eg.mycoplasmes, anaplasma,

theileria), peuvent facilement être confondus avec des artéfacts tels que des

grains de colorant. Il est donc préférable de confier l’identification de ces

agents à des spécialistes. Même dans ce cas, l’observation au microscope, bien

que très spécifique, reste peu sensible, surtout si l’animal a déjà reçu un

traitement, ou si la phase pyrogène est passée. En cas de forte présomption

clinique, et si la phase pyrogène est passée, une PCR peut s’avérer plus

intéressante.

II. Aspects techniques

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• Réalisation du frottis sanguin

– Toujours se placer devant la goutte pour ne pas écraser les cellules (le sang

migre par capillarité, on ne le pousse pas)

– L’inclinaison détermine l’épaisseur du frottis : au moins on met d’inclinaison,

au plus le frottis sera long et fin ; inversément au plus on s’approche de la

verticale, au plus le frottis sera court et épais

– Il faut veiller à ce que le frottis soit assez long pour avoir une zone de lecture

assez grande mais sans atteindre le bout de la lame car sinon, on n’arrivera pas

à observer la queue de frottis au gros objectif (le porte-objet gène).

– Le frottis doit être séché rapidement pour éviter les artéfacts de séchage

(échinocytes). On peut le cas échéant utiliser un sèche-cheveux : mode froid.

•

• Coloration rapide de type Diff-quick ou hemacolor (Merck)

– Se présente sous la forme de 3 bains :

- Un fixateur transparent de type methanol

- Un colorant (rouge)

- Un contre-colorant (bleu)

– 5 à 10 secondes dans chaque bain suffisent

– Laisser sécher à l’air libre

• Coloration au bleu de méthylène (reticulocyte stain, Sigma Aldrich) – Identification et dénombrement des réticulocytes

– Identification et dénombrement des corps de heinz.

– Mode opératoire :

- Mélanger volume pour volume de solution et de sang complet (eg. 20

µl).

- Laisser reposer 10-20 minutes

- Dans ce cas, le frottis est réalisé après l’interaction avec le colorant.

- Sécher à l’air libre

– Facilite aussi l’identification des éléments cellulaire lors de l’analyse du culot

urinaire :

- Danc ce cas s’utilise en mode « wet »

• Déposer une goutte de sédiment resuspendu sur une lame

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• Ajouter une goutte de solution de bleu de méthylène

• Recouvrir avec un couvre-objet

• Attendre une ou 2 minutes

• Observer rapidement (ne pas laisser sécher)

• Lecture du frottis sanguin

– D’abord scanner toute la lame à l’objectif x10 pour identifier la présence

d’amas plaquettaire et d’éléments inhabituels ; choisir les belles zones de

lecture, évaluer la cellularité (GR, GB et plaquettes)

– Observer la morphologie des cellules à fort grossissement (objectif x40 et

x100).

– En queue de frottis et sur les bords :

- on retrouve les éléments les plus lourds : les cellules nucléées sont en

plus grand nombre et en particulier les monocytes.

- Si l’animal a des parasites sanguins c’est là qu’on a le plus de chances

de les trouver.

- Les amas plaquettaires sont les plus nombreux à cet endroit

(observation à l’objectif x10)

- Endroit idéal pour observer un grand nombre ce cellules nucléées et

apprécier leur cellularité (leukocytose, leukopénie)

- En revanche, comme la couche est très fine, les cellules peuvent êtres

abimées. De plus, comme elles sont nombreuses à cet endroit, elles ont

tendance à se superposer. Ce n’est donc pas l’endroit idéal pour

apprécier leur morphologie.

– Au niveau de la monocouche ou couche monocellulaire :

- Environ la moitié des globules rouges se touchent

- Les leucocytes apparaissent comme « des œufs sur le plat »

- C’est l’endroit idéal pour évaluer la morphologie des GR et des GB,

ainsi que pour apprécier le degré d’anémie le cas échéant.

- Si on veut faire une estimation visuelle du nombre de plaquette/µl, c’est

aussi à cet endroit: nombre moyen de plaquettes à l’objectif 100 (sur 10

champs) x 20.000

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III. Morphologie : Atlas

III.a : Erythrocytes matures

Chien : Paleur centrale bien marquée. Chat : GR plus petits, paleur centrale moindre (idem

Cheval). Sphérocytes difficilement identifiables.

! Oiseaux et reptiles ont des GR et des plaquettes nucléés

III.b : Réticulocytes = Erythrocytes immatures anucléés, identifiés à la coloration au bleu de

méthylène par leurs granules (Images de gauche). Les réticulocytes agrégés apparaissent

polychromatophiles : plus bleus et plus grands au Diff-Quick (Images de droite). Chez le chat, on

observe en plus des réticulocytes agrégés des réticulocytes ponctués. En général dans les comptages

donnés par le labo, seuls les agrégés sont repris. Erythroblastes = GR nucléés.

CHIEN CHAT

!

réticulocytes

ponctués

réticulocytes

aggrégés

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III.c : Leucocytes

NEUTROPHILES LYMPHOCYTES

LEFT SCHIFT (C et D) et MONOCYTES

CHANGEMENTS TOXIQUES (B et D)

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EOSINOPHILES BASOPHILES

III.d. Plaquettes

Canine Equine Feline

Bovine Fibrin clump Platelet clump

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Analyse d’urine

Procedure

Couleur : sans couleur/ léger/moyen/ foncé ; jaune, orange, vert, rouge, noir

Odeur : normale, fétide, sucrée/

Turbidité : Claire/ légère à forte

Gravité spécifique (réfractomètre)

pH

Cellules epitheliales : quelques/1+/2+/3+

Globules rouges : quelques/1+/2+/3+

Globules blancs : quelques/1+/2+/3+

Protéines :

Glucose

Cétones

Urobilinogène

Bilirubine

Sang

Cylindres : quelques/1+/2+/3+

Cristaux : quelques/1+/2+/3+

Bactéries : quelques/1+/2+/3+

Quelques= 2-3 par champ

1+= >5 par champ

2+= >15 par champ

3+= > 20 par champ

! pour les cylindres : observation au 10x

Réalisation du sédiment : Mélanger l’échantillon d’urine, remplir un tube conique avec 10

mL d’urine. Centrifuger 5 min 1500 rpm. Retirer le surnageant et resuspendre dans la goutte

d’urine restante (environ 0,5 mL). Pipetter une goutte sur une lame. Couvrir avec lamelle

couvre)objet. Observer au x40.

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Cristaux les plus courants

Urine neutre/alkaline :

Urine acide : Indifférent

Calcium carbonates

Struvites (magnesium ammonium tri-phosphate)

Billirubine

Phosphates amorphes : incolores

Urates amorphes : couleur jaune-brun

Xantine

Biurates d’ammonium

(Dalmatians, Bulldogs)

Acide urique

Calcium oxalate dihydrates Miniature Schnauzer prédisposés

http://bp3.blogger.com/_Dhc3DQNl49k/Rq6w8ZbmzaI/AAAAAAAAACM/jc59qsAaQoU/s1600-h/UA42f.jpeg

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Cystine : Défaut congenital de la reabsorption tubulaire rénale de la cystine (mâles uniquement) .

Calcium oxalate monohydrates : Différents

désordres. La forme

en piquet de cloture est caractéristique d’une intox. à l’éthylène glycol.

Hempseed-orzo form

Ampicilline crystals

Sulfa-drugs

cat

Horse

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Cylindres

• Un cylindre est un moulage de tubule

– La protéine de Tamm Horsfall en est le ciment.

– Elle est normalement sécrétée par les cellules ascendantes de l’anse de

Henlé mais se dissous à pH alcalin.

• Cylindres Hyalin chez carnivores sains et ruminants sous régime

lacté

• On n’observe généralement pas de cylindres chez les ruminants

adultes

• Ce « ciment » emprisonne toutes particules (normalement

absentes) qu’il rencontre dans les tubules

– Débris cellulaires (cylindres granuleux) : atteinte rénale

d’étiologie indéterminée.

– GR : hémorragie rénale

– GB : pyélonéphrite

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Cas Cliniques BIOCHIMIE

• Cas n°1 :

– Présentation: Tex, chien cocker mâle de 11 ans

– Présenté pour vomissements, abattement, anorexie

– Le propriétaire reporte quelques nocturies récemment et une prise de

boisson augmentée (pu/pd)

Analyse d’urine: prise au jet, à mi-micturition

Densité: 1011

pH: 5

protéines 2+

GB et GR: 0-5/HPF

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• Interprétation Cas n°1 :

– Liste des anomalies

– Rassembler les anomalies par système

– Interprétation

– Présomption diagnostique

– Examen complémentaire suggéré

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• Cas n°2 :

– Présentation: Colette, chienne Spitz de 11 ans

– Présentée pour vomissements, abdomen aigü, abbattement

– Hématologie: leucopénie neutropénique avec left shift

• Cas n°3 :

– Présentation: Cibelle, cheval DS de 14 ans

– Présentée pour raideur

– Randonnée ce we

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– Interprétation






– Interprétation



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• Cas n°4 :

– Présentation: Heyfer, veau holstein de 2 semaines

– Déprimé, faible, incapable de tenir debout

– Tachycarde, hypotherme, déshydratation sévère, muqueuses pâles, TRC

prolongé

– Abdomen distendu, bruits digestifs absents

– L’ombilic est propre et les articulations non-distendues

Les résultats d’analyse sont obtenus après fluido aggressive

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– Interprétation



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• Cas n°5 :

- Présentation:

• Femelle bouledogue français de 10 mois

• Vomissements depuis hier

• Historique: elle aurait mangé des noyaux de cerise

• Traitée par antibios et fluides sous-cutanées

• Depuis elle s’est effondrée et présente de l’hematochésie > référée

- Examen clinique:

• Muqueuses blanches

• Vomi du sang digéré

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– Interprétation



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HEMATOLOGIE

• Cas n°6 :

- Présentation:

• Clochette : femelle cocker de 12 ans

• Présentée pour faiblesse

- Examen clinique:

• Muqueuses blanches

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– Interprétation



– Lame de frottis correspondante

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• Cas n°7 :

- Présentation:

• Jade : chat européen de 11 ans

• Présentée pour check-up

- Examen clinique:

• RAS

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– Interprétation




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• Cas n°8 :

- Présentation:

• Pepke : chien mâle de 8 ans

• Présenté pour abattement, perte d’appétit, amaigrissement

- Examen clinique:

• RAS

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• Interprétation Cas n°8:


– Interprétation




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• Cas n°9 :

- Présentation:

• Miel : chat mâle de 7 ans

• Présenté pour saignements

- Examen clinique:

• Nombreuses pétéchies et echymoses, melena

• Felv-FIV négatif

- Lame 204

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– Liste des anomalies à l’automate

– Liste des anomalies sur la lame

– Interprétation



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• Cas n°10 :

- Présentation:

• Jessy, chienne CDR de 8 ans

• Présentée pour fièvre, vomissements, abattement

- Examen clinique:

• Pétéchies, masse abdominale à la palpation

- Lame 1966, leukocytose +++

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– Liste des anomalies à l’automate

– Liste des anomalies sur la lame

– Interprétation



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Lame 1

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Lame 3

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Lame 4

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Lame 204

Coloration Bleu de Méthylène (New Méthylene blue)

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Lame 1966-leukocytose

Documents

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