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FGSM2 - Formation Générale aux Soins Médicaux de niveau 2 MED0304 – Tissu Sanguin Pr GUILLOU S3 – 31/10/2020 BERTAULT Loïc & LARGET Candice

Correctrice : Aimy Perrin

Cours 17 : exploration de l’hémostase Les 3 phases de l’hémostase (hémostase primaire, coagulation et fibrinolyse) peuvent être explorées par des tests dédiés, cela permet : - Le diagnostic étiologique d’un syndrome hémorragique - L’évaluation du risque hémorragique avant une intervention chirurgicale - La surveillance de certains traitements anticoagulants - La recherche de facteurs biologiques de risques de thromboses

Rappels

• L’hémostase primaire et la coagulation permettent la formation d’un caillot fibrino-plaquettaire

• Phénomènes d’adhésion /activation /agrégation plaquettaire → Formation du clou plaquettaire : → Adhère au collagène du sous endothélium via le facteur Willebrand

• Renforcement du clou par la fibrine issue des réactions protéolytiques de la cascade de coagulation

• Le facteur XIII vient ensuite stabiliser le caillot fibrino-plaquettaire Tous ces phénomènes sont

simultanés même s’ils sont souvent présentés comme se déroulant de manière successive.

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Pré-analytique Le respect des contraintes pré-analytiques est primordial en hémostase pour avoir des résultats interprétables.

Prélèvement

- Prélèvement de sang total par ponction veineuse sur tube citraté (bouchon bleu clair). ➢ Citrate = anticoagulant de choix car il permet une chélation réversible du calcium

(élément indispensable à toutes les réactions de coagulation) ➢ Le tube doit être rempli correctement (élément capital) car le citrate y est sous

forme liquide (le rapport sang/citrate = 9/1). - Tube pas assez rempli : ➢ Citrate pas assez dilué : quantité de citrate trop importante par rapport à la

quantité de sang ➢ Anticoagulation excessive ➢ Temps de coagulation mesurés allongés de façon artéfactuelle

- Tube trop rempli : ➢ Ne permet pas une anticoagulation suffisante ➢ Temps de coagulation mesurés seront faussement raccourcis

Acheminement - Le bilan d’hémostase doit être acheminer au labo à température ambiante, le plus vite

possible (max 4h après le prélèvement)

Vérification - Vérification de la conformité des tubes ➢ Identité ➢ Niveau de remplissage

Traitement avant analyse

- Centrifugation ➢ Objectif : obtenir du plasma pauvre en plaquette (PPP) (les plaquettes servent de

surface catalytique aux réactions de coagulation, elles pourraient interférer avec les tests de coagulation ultérieurs)

- Évaluation de la fonction plaquettaire : ➢ On travaille sur sang total (non centrifugé) ou sur plasma riche en plaquettes (PRP)

obtenu par centrifugation douce

I. EXPLORATIONS DE L’HÉMOSTASE PRIMAIRE

Indications

- Devant tous syndromes hémorragiques cutanéomuqueux ➢ Gingivorragie ➢ Epistaxis ➢ Ecchymose ➢ Ménorragie chez la femme

- Enquête familiale après découverte d’une anomalie de l’hémostase primaire

Objectifs :

- Rechercher une maladie de Willebrand - Rechercher une thrombopathie - Exclure une anomalie de l’hémostase primaire en cas de bilan normal (orientant plutôt

vers un saignement d’origine vasculaire)

Tests disponibles

- Temps d’occlusion plaquettaire qui remplace le temps de saignement - Plaquettes ➢ Numération plaquettaire ➢ Tests fonctionnels

- Facteur Willebrand : ➢ Dosages quantitatifs et qualitatifs ➢ Dosage fonctionnel

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Les différents tests

TEMPS DE SAIGNEMENT (TS)

- N’est plus réalisé actuellement ➔ Temps nécessaire à l’arrêt d’une hémorragie induite par une plaie

cutanée superficielle (normalement compris entre 4 et 8 min) - Méthode d’Ivy ➢ Incision à la face antérieure de l’avant-bras ➢ Peu standardisée ➢ Invasive (cicatrice)

- Désormais remplacé par le temps d’occlusion plaquettaire

TEMPS D’OCCLUSION

PLAQUETTAIRE

- Test global évaluant l’hémostase primaire réalisé sur sang total citraté - Effectué sur un automate spécifique : ➢ PFA-100 ou PFA-200 (Platelet Function Analyzer)

- Mime in vitro les conditions hémodynamiques de l’adhésion et l’activation plaquettaire suite à une brèche vasculaire ➢ Le temps mesuré correspond au temps nécessaire à

l’obturation d’une membrane de collagène par le clou plaquettaire formé en présence d’un agoniste plaquettaire (ADP ou épinéphrine selon la cartouche utilisée), dans des conditions de flux standardisé

- Sensiblité : ➢ Déficits en facteur Willebrand +++ ➢ Thrombopathies +/-

⚠ Non interprétable en cas d’anémie et/ou de thrombopénie

NUMÉRATION PLAQUETTAIRE

- Fait partie de tout bilan d’hémostase primaire ➢ Analyse automatisée (comme le reste de

la numération sanguine)

- ATTENTION aux fausses thrombopénies liées

à l’EDTA : toute thrombopénie doit être confirmées par un frottis sanguin et la vérification de l’absence d’amas plaquettaires. ➢ Chez certains patients, au contact de

l’anticoagulant utilisé pour réaliser la numération formule sanguine = EDTA

➢ Plaquettes agglutinées ➢ Numération sous-estimée (amas compté comme 1 seule plaquette par

l’automate) (cf photo à droite).

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- En cas d’amas mis en évidence et seulement dans ce cas ➢ Contrôle numération sur un autre type d’anticoagulant comme le citrate.

- Intérêt de la morphologie plaquettaire (frottis sanguin coloré au MGG) : anomalie de taille ou de contenu pouvant orienter vers certaines thrombopathies

Photo de plaquettes de taille augmentée

AUTRES TESTS PLAQUETTAIRES

Lorsque les examens précédents ou cliniques font suspecter une thrombopathie : ➢ Etude de la fonctionnalité des plaquettes in vitro. ➢ Deux grands types de tests dans des laboratoires spécialisés

Agrégométrie photométrique

- Etude de l’agrégation des plaquettes en réponse à différents agonistes plaquettaires ➢ ADP ➢ Collagène ➢ Thrombine ➢ Acide arachidonique

- Ci-dessous : tracé d’agrégométrie photométrique, représentant le pourcentage d’agrégation plaquettaire en fonction du temps en réponse à différents agonistes.

Cytométrie en flux

- Etude des récepteurs membranaires plaquettaire (glycoprotéines) par cytométrie en flux ➢ Quantification de l’expression de la GPIIbIIIa ou de la GPIb ➢ Evaluation du niveau d’activation plaquettaire

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FACTEUR WILLEBRAND (vWF)

Dosage fonctionnel

➔ vWF : RCo = Activité cofacteur de la ristocétine (vieil antibiotique qui n’est plus utilisé en thérapeutique mais qui a la particularité d’activer le vWF et d’entrainer une agrégation plaquettaire) → elle sert donc à évaluer la fonctionnalité du Willebrand.

Dosage quantitatif

(antigénique)

➔ vWF : Ag = Détection du vWF par des anticorps spécifiques et quantification des complexes immuns ainsi formés (méthode immunologique)

Pour les 2 tests

Comparaison - Les résultats des 2 dosages doivent être interprétés ensemble et leur comparaison

permet de caractériser l’éventuel déficit en vWF (quantitatif ou qualitatif)

II. EXPLORATIONS DE LA COAGULATION

Indications :

• Bilan préopératoire (risque hémorragique ?)

• Exploration d’un syndrome hémorragique touchant les tissus profond (hématomes musculaires, hémarthrose)

• Surveillance d’un traitement anticoagulant

• Évaluation du risque thrombotique

Rappels : Coagulation = séquence d’activation enzymatique en cascade, les facteurs de la coagulation sont des proenzymes devenant actives sous l’effet d’un autre facteur de la coagulation lui-même sous forme active. La dernière étape permet la transformation du fibrinogène en fibrine. → 2 grandes voies, extrinsèque et intrinsèque :

Valeurs normales pour ces 2 tests : 50-100%

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TESTS DE COAGULATION

Différents tests

- Tests fonctionnels dans la majorité des cas ➢ Evaluent une activité pro ou anti coagulante ➢ La plupart des test fonctionnels de coagulation réalisés en routine sont des

tests chronométriques : mesure du temps nécessaire à la formation des premières traces de fibrine in vitro

- Tests globaux en 1ère intention puis dosages spécifiques de facteurs si anomalies

Principe

- Reproduction in vitro des réactions de la cascade de coagulation : ➢ Présence de Ca2+ ➢ Présence de phospholipides anioniques ➢ Ces présences sont indispensables

1 TEMPS DE CEPHALINE AVEC ACTIVATEUR (TCA)

Évalue la voie commune et intrinsèque :

Mesure du TCA

➢ Le plasma pauvre en plaquettes (PPP) du patient est mélangé volume à volume

avec activateur choisi + phospholipides ➢ Incubation à 37°C ➢ Ajout de calcium → déclenche le début de la réaction de coagulation = début

mesure temps ➢ 1ère trace de fibrine détectée = fin mesure temps

- Informations données par le TCA varient suivant l’activateur choisi (silice, kaolin, acide ellagique…)

- TCA mesuré en seconde, exprimé en ratio par rapport au temps témoin

Valeurs normales (ratio) : 0,8 - 1,2

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Allongement isolé du TCA

- Associé à un temps de quick normal (ratio > 1,2) - Peut avoir différentes causes ➢ Traitement par héparine (héparine non fractionnée > héparine de bas poids

moléculaire) ➢ Déficit en facteur de la voie intrinsèque → VIII, IX, XI, XII, facteurs de la phase

contact ➢ Anticoagulant circulant (ACC)

Sensibilité du test

- Selon le réactif de TCA utilisé, la sensibilité du test au différent cas de figure évoqués précédemment sera variable.

- Ex : Le kaolin est plus sensible à la présence d’un déficit en facteur que les autres réactifs de TCA ➢ Il aura tendance à être allongé de façon + importante qu’avec un autre réactif en

cas de déficit en facteurs de la voie intrinsèque

Revenons sur la notion d’anticoagulant circulant :

ACC

2 TEMPS DE QUICK (TQ)

Explore la voie commune et la voie extrinsèque sauf le facteur tissulaire qui n’est pas exploré en pratique courante. TCA et TQ explore donc tous les deux la voie commune, seul le facteur VII n’est exploré que par le TQ.

Anti-facteur Ac dirigés contre un facteur donné : Ex : anti-VIII = hémophilie A acquise

→ In vitro = allongement du TCA → In vivo = Associés à un risque hémorragique

ACC lupique = anti-phospholipides Ac dirigés contre des protéines à haute affinité

pour les phospholipides

→ Bien qu’allongeant le TCA (in vitro), ils sont associés in vivo à un risque de thrombose →Cliniquement ils sont souvent retrouvés dans des pathologies auto-immunes (lupus)

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Mesure du temps de quick (en secondes)

- Incubation préalable du plasma à 37°C - Ajout du réactif thromboplastine calcique ➢ Il s’agit d’un mélange de facteurs tissulaire d’origine animale ou recombinante ➢ De phospholipides ➢ De calcium

- Réaction de coagulation déclenchée par ce réactif ➢ Le réactif du temps de quick contient un inhibiteur de l’héparine qui le rend insensible

au traitement héparinique sauf en cas de surdosage ou de contamination

Expression du TQ

1. Taux de prothrombine (TP) : - Expression du TQ en pourcentage de la normale (établie à l’aide d’un pool de plasma

humains normaux) - Plus le TQ est court plus le TP sera élevé

- Allongement du TQ → Diminution du TP ➢ Isolé avec un TCA normal

✓ Déficit en facteur VII ✓ Car seul le TP explore ce facteur

➢ Associé à un allongement du TCA (dans la plupart des cas) ✓ Déficit d‘un ou plusieurs facteurs de la voie commune (hypovitaminose K,

Insuffisance Hépato-Cellulaire = IHC, Coagulation IntraVasculaire Disséminée = CIVD)

2. INR (International Normalized Ratio)

INR = (TQ patient/TQ témoin)ISI - Autre expression du TQ réservé à la surveillance des traitements par AVK ➢ Calculé à partir du TQ en seconde du patient et du témoin

- ISI : International Sensitivity Index, dépend du réactif de thromboplastine utilisé - Permet de standardiser le rendu de résultat entre différents laboratoires et donc une

comparaison inter-laboratoire

3 DOSAGE DU FIBRINOGÈNE

- PPP du patient dilué au 10ièm est mis au contact avec de la thrombine en excès

- Le temps de coagulation mesuré est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène

➢ Résultat en g/L mais c’est bien un dosage fonctionnel

Variation du taux de fibrinogène :

- Augmentation ➢ Syndrome inflammatoire

- Diminution ➢ Hypo/dysfibrinogénémie (anomalies

constitutionnelles) ➢ CIVD ➢ IHC ➢ Traitement par chimiothérapie comme la L-

Asparaginase

Valeurs normales : 2-4g/L

Valeurs normales : 70-130%

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4 TEMPS DE THROMBINE

- Mesure du temps de formation d’un caillot en présence de thrombine - Explore la dernière étape de la cascade de la coagulation : ➢ Transformation du fibrinogène en fibrine sous l’action de la thrombine = fibrinoformation

- Allongé : ➢ En cas d’anomalies du fibrinogène ➢ En cas d’inhibition de la thrombine (héparine, dabigatran)

- Temps témoin = 20s

EN PRATIQUE

Comment interprète-t-on les résultats de ces différents tests sur un même bilan ? ➢ Il faut raisonner sur le temps de TCA et sur le TQ : allongement isolé du TQ (ou diminution du TP ?),

du TCA, allongement du TCA associé à un allongent du TQ

Allongement isolé du TCA

- Y a-t-il un traitement héparinique ? ➢ En consultant le dossier du patient ou en contactant le prescripteur ➢ En ajoutant sur le bilan un temps de thrombine +/- mesure de l’activité anti-Xa (lire

« anti dix a ») - Après exclusion du traitement héparinique : dosage des facteurs de la voie intrinsèque ➢ Dosage facteur VIII, IX, XI, XII

- Selon le contexte clinique recherche d’ACC lupique peut être envisagé

Allongement du TCA

associé à un allongement

du TQ

- Recherche d’un traitement par antivitamine K ou par anticoagulant oral direct - Après exclusion de ces traitements, ce profil de résultat fait suspecter un déficit en un

ou plusieurs facteurs de la voie commune : ➢ Dosage du fibrinogène ➢ Dosage d’un facteur vitamine-K dépendant comme le VII ➢ Dosage d’un facteur non vitamine-K dépendant de la voie commune comme le V

- Selon les résultats on s’orientera vers : ➢ Une IHC (l’ensemble des facteurs de coagulation de synthèse hépatique sont

susceptibles d’être diminués ainsi que les plaquettes) ➢ Une hypovitaminose K (seul le facteur VII est diminué) ➢ Une CIVD (le déficit en facteur V est en général assez marqué, le diagnostic

différentiel avec l’IHC peut être fait à l’aide des D-dimères)

Valeurs normales :

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DOSAGE SPÉCIFIQUE DES FACTEURS DE COAGULATION

En fonction des résultats des tests présentés précédemment on peut décider de doser spécifiquement certains facteurs

Principe

- Mesure d’un temps de coagulation (TQ ou TCA) d’un mélange du plasma patient à un plasma déficient en un seul facteur (le facteur à doser) :

- On fait en sorte que le temps de coagulation mesuré ne dépende que du taux de facteur que l’on cherche à doser qui n’est apporté que par le plasma du patient.

- Résultats exprimés en pourcentage de la normale à l’aide d’une droite de calibration

Les tests - Tests dérivés du TCA : FVIII, IX, XI et XII - Tests dérivés du TP : FII, V, VII et X

Valeurs

- Valeurs normales : variables selon le facteur de coagulation ➢ Taux minimal de facteur permettant d’assurer une hémostase chirurgicale ou en cas

de traumatisme (le plus important, encore plus que la valeur normale) - Risque hémorragique potentiel en cas de déficit en facteur de coagulation ➢ Sauf pour le facteur XII

DOSAGE DES INHIBITEURS DE LA COAGULATION

Les inhibiteurs :

- Antithrombine - Protéine C - Protéine S ➔ Ne sont pas explorés par les tests globaux de la coagulation que nous venons de voir : → réaliser un dosage spécifique

Dosages - Dosages fonctionnels et antigéniques ➢ Permettent de caractériser les déficits, quantitatif ou qualitatif

Indications - Bilan de thrombophilie ➢ A la recherche de facteurs biologiques de risque de thrombose

BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

➔ Permet le diagnostic d’anomalies constitutionnelles de la coagulation - Recherche de mutations responsables d’hémophilie A ou B - Recherche de la mutation du facteur V Leiden ou du variant G20210A du gène de la prothrombine :

facteurs biologiques de risque de thrombose veineuse

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III. EXPLORATIONS DE LA FIBRINOLYSE

Rappels

• La fibrinolyse consiste en la dégradation du caillot de fibrine sous l’action de la plasmine

• La plasmine est formée à partir du plasminogène sous l’action du t-PA

• Système finement régulé, avec 2 principaux inhibiteurs : PAI-1 et α2-antiplasmine

• Aboutit à la formation de produits de dégradation de la fibrine

Tests disponibles

Temps de lyse des

euglobulines

- Dépistage des hyperfibrinolyse ➢ Formation d’un caillot composé par les euglobulines (dont fibrinogène et

activateurs de la fibrinolyse) ➢ Lyse spontanée en 3-4h ➢ Raccourcissement de ce délai = hyperfibrinolyse

- Suite de l’exploration : ➢ Dosages spécifiques des activateurs de la fibrinolyse (t-PA, u-PA) ➢ Dosages spécifiques des inhibiteurs de la fibrinolyse (PAI-1, alpha2-antiplasmine)

Dosage du

plasminogène sanguin

- Peu d’intérêt en pratique courante

Dosage des produits de dégradation

de la fibrine et du

fibrinogène (dont D-dimères)

= PDF : intérêt ++ Schéma des différent PDF formés au cours de la fibrinolyse. Nous allons nous intéresser particulièrement aux D-dimères qui sont spécifiques de la fibrine et donc présent en excès en cas d’activation de la coagulation et de la fibrinolyse.

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Les D-dimères • Méthode de dosage immunologique (ELISA, chemiluminescence)

N < 500 ng/ml

• Augmentés au cours de la thrombose et de la CIVD Utiles +++ → Diagnostic exclusion de la thrombose veineuse profonde (TVP) et de l’embolie pulmonaire grâce à leur très bonne « Valeur Prédictive Négative » dans ce contexte En cas de D-dimères inférieurs à 500 ng/mL et de probabilité faible/intermédiaire de thrombose ce diagnostic pourra être exclu.

• Nombreuses autres causes d’augmentation des D-dimères : - Sepsis, post-opératoire, néoplasies - Grossesse, post partum - Age (conduit à adapter leur seuil de positivité à l’âge à partir de 50ans)

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QCM e-learning 1- Concernant les contraintes pré-analytiques en hémostase, quelles affirmations sont exactes ? A. L’anticoagulant de choix est le citrate B. Les prélèvements doivent être acheminés au laboratoire à +4°C C. L’anticoagulant de choix est l’héparine D. Un tube trop rempli n’a pas d’impact sur les résultats obtenus E. Un tube insuffisamment rempli peut fausser les résultats obtenus 2- Quelles sont les causes possibles de diminution du fibrinogène ? A. Insuffisance hépato-cellulaire B. Thrombose C. Traitement par AVK D. Traitement par L-Asparaginase E. CIVD 3- Quels tests permettent d’évaluer la fonction plaquettaire ?

A. Le dosage du facteur Willebrand B. L’agrégométrie C. Le TCA D. Le temps d’occlusion plaquettaire E. Le dosage du fibrinogène 4- Quels tests permettent d’évaluer la fibrinolyse ? A. Le TCA B. Le dosage des D-dimères C. Le temps d’occlusion plaquettaire D. Le dosage du fibrinogène E. Le temps de lyse des euglobulines 5- Quels tests permettent d’évaluer la coagulation ?

A. Le dosage de l’antithrombine B. Le TCA C. Le dosage du fibrinogène D. Le dosage du facteur Willebrand E. Le temps de lyse des euglobulines 6- Quelles sont les causes possibles d’allongement isolé du TCA ? A. Déficit en facteur VIII B. Traitement par AVK C. Présence d’un anticoagulant circulant de type lupique D. CIVD E. Déficit en facteur VII

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7- Quelles sont les caractéristiques du temps d’occlusion plaquettaire ? A. Il remplace le temps de saignement B. Il n’est pas interprétable en cas d’anémie C. Il est très sensible à la majorité des déficits en facteur Willebrand D. Il est très sensible aux thrombopathies E. Il est réalisé sur plasma citraté 8- Dans quelles situations peut-observer une augmentation des D-Dimères ? A. Maladie de Willebrand B. CIVD C. Grossesse D. Hémoglobinopathies E. Sepsis

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AE ADE BD BDE ABC AC ABC BCE

Annales 2019 : Q29- Parmi les examens biologiques suivants, lequel (lesquels) permette(nt) d’explorer l’hémostase primaire ? A - le temps d’occlusion plaquettaire B - le dosage du facteur XIII C - le dosage du facteur Willebrand D - le dosage du fibrinogène E - la numération plaquettaire Q30- Quelle(s) est (sont) la (les) cause(s) possible(s) d’allongement isolé du TCA ? A - un déficit en facteur VIII B - un traitement par héparine non fractionnée C - un déficit en facteur XIII D - un anticoagulant circulant lupique E - un traitement par antivitamine K

Q-29 Q-30

ACE ABD