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ÉTUDE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE
LORS DE LA TRANSFErrrON DE CELLULES
DE GLANDES MAMMAIRES BOVINES
Memoire
présenté
à la Faculté des études supérieures
de 1Tuniversi t6 Laval
pour i'obtention
du grade de maître es sciences (MSc.)
Département des sciences animales
FACULTG DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITE LAVAL
O Charles- Andre Vinette, 1999
National Library of Canada
Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographic Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, nie Wellington Ottawa ON K1A ON4 OttawaON K1AON4 Canada Canada
Yaur I% Votre r&rsnce
Our lSle Notre reMrenca
The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sel1 copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts f?om it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
III
AVANT-PROPOS
L'occasion m'est offerte de remercier tous les gens qui m'ont aidée, encouragé
et soutenu dans mes études de maîtrise. Tout d'abord, je tiens à souligner
l'appréciation du support reçu de ma mere Carole, de mon pere Andre ainsi que de
ma grande sœur Anne-Marie. Je remercie grandement mon directeur de recherche,
Marc-André Sirard, pour toute l'instruction, autant pedagogique que morale et
personnelle, qu'il a su me transmettre, en plus du goût d'aller plus loin ainsi que la
confiance en moi.. . merci pour ta propre confiance. Je remercie également mon CO-
directeur, François Pothier, qui a et& present A tout moment et qui m'a donne de bons
outils pédagogiques. Je n'oublie pas non plus le support de la bourse du FCAR et
ceile du CRBR. Je remercie I'entourage du CRBR, ainsi que celui du departement et
surtout de YACCESA. Entre autre, un gros merci toute la gang du laboratoire à
MAS, en particulier a Anne pour son aide précieuse ainsi qu'a Dominic, sans oublier
Christian et les autres. D'autres mercis tous mes amis (çphalement Patrick B. et
Marc-An&& G.) et amies qui m'ont epaulé lors de mes hauts et de mes bas. En
particulier, un merci spkial à mon bon dium Claude, pour tout ce que je n'ai pas
besoin de lui dire mais qu'on sait pareil.
Merci aussi à AMik qui m'a d o ~ e i'énergie de terminer mon mémoire en beauté.
A tout ce monde, de pres et de loin, je vous dis encore merci beaucoup!
PAGE
RÉSUME . . . o ,ommo. . . .oooooom. .o .o .mmooomoooo~~ooo~ooo~toooo4oom.omoo.ooooooeo .ooooomomoomomooomooooo~o~~oooo~~o~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~*~~ II
AVANT-PROPOS . m o o o o o o . e . o o . . ~ ~ o ~ ~ ~ o o m o o o o o o o o m o o o m m o o o o o o o o o o o o o . o o o o o o o o o o o ~ o o o . o o o o o o o o o ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ m ~ ~ ~ o ~ ~ ~ ~ ~ ~ m o o ~ o o ~ o o o o ~ o o o o o o X I I
TABLE DES ~ ~ ~ È ~ ~ ~ o o o o o * o - o o o m o o o o o o o m ~ o * o m m o o m ~ o o o o o o o o o . o o o m o m o o o o o m o m o o m o o œ m o o m o o a o o o m o m o o o o m o m . * * o o o * * * * * * * * * * m * * * ~ * * * * * ~
..................................................................................................... LISTE DES FIGURES VI1
LISTE DES TABLEAUX . ~ ~ ~ o o O O o o o o ~ o 4 o o o ~ o o o o s m o o o ~ ~ o o o H ~ m o o o o o o H ~ o o o o o o o s o o O O O O O O O O O O O O O O O O O O
.................................................................................................. LISTE DES ABRÉVIATIONS x
2.1 TRANSGÉNÈSE ..................................................................................................... ...*...*.A ........................................ 2.1.1 Prerniees incorporations nucl&ires d'ADN exogène A
2.1.2 Animaux transgéniques ............................................................................................. 5
2.2 CLONAGE ........................................................................................................... ....0=.-=0-..--06
............................................................................. 2.2.1 Clonage chez les vertébre *4œ-0....*-06
2.2.2 Clonage chez les mammifères ............................................................................ 6
2.2.3 TransgQièse couplée au donage ............................................................ .....--=-=......7 2.2.4 Clonage de ceiides adultes ..................................... .. ................................... ----..--*-----?
........................................................................ 2.3 LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 9
..................................................... 2.3.1 Recombinaison homologue et non-homologue 9
2.3.2 Les moddes de recombinaison homologue et non-homologue ...................... 10
2.3.3 Les enzymes impliquées dans le processus de recombinaison ....................... 11
2.3.4 L'importance de la phase du cycle cellulaire pour la recombinaison ............ 12
....................... 2.3.5 Études ex trachromosomiques versus intrachromosomiques 13
2.3.6 Caract4ristiques de la recombinaison homolop ............................................. 14 2.3.7 Methodes d'observations et de sélection d'év&ements de recombinaison
............................................................................................................... homologue 2 0
2.4 OBJECTIFS DU TRAVAIL ET MISE EN PLACE DE LA THO ODE
....................................................................................................................... UTTUSÉE 22
2.4.1 La hansfection et l'expression transitoire ........................................................... -23
........................................................ 2.4.2 Séquences homolo gues, BS. PST1. 18sARN 26
.................. 2.4.3 Utilisation et caracténçtique du transghe rapporteur GFP S65T 28
2.4.4 Identification d'une recombinaison homologue par la m&hode du PCR ..... 30
CHAPITRE III: BTABLISSEMENT ET OPTIMISATION
DES PROTOCOLES DE TRANSFECTION ...................... .. ............. 31
3.1 INTRODUCTION ..................................................................................................... 3 1
3.2 UGNÉES CELLULAIRES ............................................................................................ 32
3.3 PRÉPARATION ET PURIFICATION DE L'ADN ................................................. 3 4
3.4 DIFF&ENTs PROTWOLES DE TRANSFECTION ........................................ 3 5
CHAPITRE IV: MANUSCRIT ............................................................................................. 40
S T n Y OF HOMOLOGOUS RECOMBINATION ON
TRANSFECTED BOVINE MAMMARY GLAND CELLS
R&W& : .................................................................................................................................. 41 ............................................................................................ ABSTRACT : .............................. ... 43
INTRODUCTION : ................................................................................................................. 45
MATERIALS AND METHODS : ......................................................................................... 49
Constnic tions and DNA Purification .......................................................................... 49
Cell Line .......................................................................................................................... 5 0
Transfection Pro tocois ...................................................................................................... 5 0
Transfec tion Ra te Evalua tion .......................................................................................... 50
.................................................... PCR DNA Amplification and Samples Prepara tion 51
RESULTS : ............................................................................................................................. 5 3
....... Transfection Ra te Evalua tion of Different Lengths of BS Bila teral Sequences 53
Transfection Ra te Evalua tion of 18s Bila teral Homology Sequence and PST1
Unilateral Sequence using the FACS Selection ..................................................... 5 4
Evaluation of Homologous Recombination Events by PCR Methods on 18s
................................................................................... and PST1 Homologous Sequences 55
DISCUSSION : ........................................................................................................................ 5 7
ACKNOWLEDGMENTS : .................................... ... .......................................... 7 6
REFERENCES : ..................................................................................................................... 7 7
... ..... CHAPITRE V : CONCLUSION GÉNÉRALE.. ..... .......... ............................ 90
LISTE DES FIGURES
PAGE
MANUSCRIT
Figure 1:
Figure 2:
Figure 3:
Figure 4:
Figure 5:
Plasrnid map of the three constnicts used and the restriction
............................... enzymes sites used to obtain our linear transgenes.. 66
Diagram of homologous recombination detection by specific PCR
amplification of a linear trmsgene at a predefined site in the genome.. ........ .68
PCR analysis of genomic DNA from ceUs transfected with iinear
........................... BS500, B S250, B S50 and O-actin/GFP constructions.. .70
K R analysis of genornic DNA fiom celis tmnsfected with linear
18SICMVlB-actin/GFP constructions on 500 cells (A) and
............. 50 celis (B) 48 hours post-transfection foiiowing FACS selection. -72
PCR analysis of genomic DNA from cells transfected with linear
PST l/CMV/B-actin/GFP constructions on 500 ceiis (A) and
............ 50 cells (B) 48 hours post-transfection following FACS selection.. .74
LISTE DES TABLEAUX
PAGE - Tableau 3.4.1 : Résultats d'optimisation de la transfection des cellules
de glande mammaire bovine au Superfect en duplicata
avec le transgène f3-ac tine/GFP Linéaire selon cinq
diff&entes variantes.. ...................................................... -36
Tableau 3.4.2 : Conditions d'électropora tion tes tées sur des cellules
HERA à 1x10~ celluies/ml avec lug d'ADN plasmidique
et lineaire (separement) dans lOOul ou 400~1, avec une
résistance de 129 ohms a 3 diff6rents voltages et
differentes capacitances .................................................... .39
MANUSCIUT
Table 1: Transfection rate evaluation of our four different transgenic
constructions of BS/S-actin/GFP, under W light using an
hemocytometer, at day 2 and 5 post transfwtion ............................ .62
Table 2: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, of cells
transfected with linear 18S/CMV/B-actin/GFP and linear
............. CMV/f3-actin/GFP at 2,12 and 19 days pst-transfection .... ..63
Table 3: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, from one
replicate of ceUs transfected with linear PSTl/CMV/ Cactin/GFP
and linear CMV/B-actin/GFP at 9,19 and 26 days post-transfection.. ..64
Table 4: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, of cells
transfected with linear PST1 /CMV/ B-actin/GFP and linear
CMV/ P-acün/GFP at 2,12 and 19 days post-transfection.. . . . .. . . . . . . . . . -65
LISTE DES ABRÉVIATIONS
18s
ADN
A R .
f.3
BFP
bp BS
Ca
CaCL,
cm3
cDNA
CHO ceils
CMV
CO2 DPBS
d
DEPC
DMEM
DNA -
EDTA
EGF
ELISA
nom de la séquence codant pour la sous-unité ribosomale 18s
acide désoxyribonud~ique
acide ribonucléique
be ta
blue fluorescent protein
base pair
nom de la séquence sa tefite bovine ADN 1
calcium
chlorure de calcium
centimètre cube
ADN complementaire
chinese hamster ovary ce&
human c ytomegalovirus
bioxyde de carbone
Dulbelco's phosphate buffered saline
days
diéthylp yrocarbona te
Dulbelco's minimum essen tiaf medium
desoxyribonudeic acid
eth ylenediamin te traace tic acid
epithelial growth factor
aiz yme-Wed-immuno-assa y
ES cells
FACS
FCS
GFP
HAT
ms HERA
HPRT
HR
hrs
kD
lin
LP
MDKB
MEM
Mg min
mRNA
W C 0
Na1
NE0
NHR
nm
P
PBS
PCR
PSTl
RH
RNA
embr yonic stem cells
fluorescent activated cell sorter
fetal calf serum
green fluorescent pro tein
hypoxan thine-aminop ter in-thymidine
Hank's balanced salts
human cytomegalovirus epithelial regulation large T antigene
hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase
homologous recombina tion
heures
kilo Dalton
linéaire
lower primer
Madin & Darby kidney bovine c d
minimum essen tial medium
rnagnesium
minute
messanger RNA
molecular weigth cut off
Iodure de sodium
neomycine
non homologous recombination
nanometre
probabilité
paire de bases
phosphate buffered saline
polymerase diain reaction
nom de la séquence dispersée hautement repétée PSTl
recombinaison homologue
ribonucleic acid
XII
RNH
Pm RT-PCR
Ser -Tyr -Gl y
SF
TBE
recombinaison non-homologue
révolution par minute
reverse transcriptase- polymerase chah reaction
sérine-t yrosine-glycine
superfect
single stranded DNA
simian virus
Tris-Bora te-EDTA
tris-EDTA
thymidine kinase
upper primer
utraviolet
Volts
pourcentage
degr4 Celcius
densité
nano, micro-, rnilli-Molaire
rnicro-, milli-, gramme
micro-, milli-, litre
CHAPITRE 1
Au tournant du nouveau millénaire, nous nous retrouvons au début du siede
de la biotechnologie. La biotechnologie découle de la connaissance croissante que
nous avons du vivant tant au niveau microscopique que mol~culaire. Mais la
nouvelle difference est la possibilité d'intervenir par notre savoir dans la modification
du vivant, tant bac térien que végétal, et maintenant animal.
Dans le contexte des sciences animales, les progres réalisés en génétique ne
pouvaient auparavant s'effectuer qu'au rythme lent des croisements de génération en
génération. La venue de la biotechnologie appliqu& aux animaux (transgénese et
clonage) a ouvert les portes à des progrès plus rapides mais surtout B un éventail de
possibilites jusqu'alors inimaginables. Par exemple, énonçons "les améliorntions
génétiques et les avantages agroalimen tnires et économùques ", " l'&de de ma ladies
génétiques ou du domine médical" et " l'utilisation des animaux de f m e s comme
bioréacteurs ".
Les améliorations génétiques et les avantages agroalimentnires et économiqiies
Jusqu'a maintenant, la sélection favorisant certains caractères prédéterminés
des animaux de ferme ne pouvait s'effectuer que par croisements sélectifs. Il est
présentement possible de définir de toutes pièces les caractéristiques des générations
à venir et ce dès la seconde génération. En effet, par la connaissance que nous avons
des gènes, de leur comportement et de leur fonction, il nous est possible de
déterminer le caractère conféré par chaque gène et de ddcider si nous voulons
amplifier sa présence chez l'animal ou l'effacer, ou encore créer une autre
caracMristique désirée. Ainsi, par exemple, il serait possible de rendre moins actif le
gPne responsable du dépôt de gras dorsal chez le porc, ou encore de changer les
composantes du lait produit par une vache. Ces exemples sont des applications
agroalirnentaires et économiques que nous pouvons tirer de la transgénèse.
L'étude de lnalndies génétiques ou du domaine médical
Les animaux de laboratoires, comme les souris, se sont révélés très utiles et
pratiques dans l'étude de nouveaux mbdicaments. Depuis l'avènement de la
transgenèse, ces animaux se sont rév414s indispensables, entre autre pour lëtude de
maladies gén6tiques. En effet, grâce a la mise en place des Embryonic Stem (ES) celis
(cellules souches embryonnaires pluripotentes en culture ayant la capaute de faire
partie integrante d'un autre embryon suite un transfert de ces ceildes au stade
blastocyste) et de la méthode « knock out » (mutageiGse ciblk), il est devenu possible
de déterminer le rôle des gènes en évaluant les effets de leur absence. Cette méthode
h o & out » consiste à cibler un gène précis dans le génome des ES cells, et par
principe de recombinaison homologue, on le remplace par le même gène non-
fonctionnel mais comportant en plus un gène rapporteur. Il est ainsi possible de
çélectiomer les cellules rnodifiiées et de les, transfeer aux blastocystes. Finalement, le
croisement des souris de premiare génération donnera naissance a certaines souris
homozygotes mutantes pour le @ne en question. L'outil de la transgénGse se révèle A
ce jour comme étant très prometteur pour les grandes questions de la méâedne
moderne.
L'utilisation des animaux de ferme comme bioréacteurs
Les techniques de transgénèse vont aussi nous permettre d'utiliser les animaux
de ferme en tant que bioréacteurs. Nous entendons par cela qu'il est possible
d'utiliser un animal et de lui faire produire une protéine ou une mol6cde
prédéterminée directement dans son lait. Nous pouvons diviser cette utilisation en
deux categories. La premiere serait la surproduction de protéines endogbes de
l'animal. Par exemple, chez la vache, on utilise la casbe-kappa dans la production
du fromage. La sur-expression de la caséine-kappa dans le lait d'une vache, suite à
l'introduction d'un transgène codant pour cette protéine à l'intérieur de son génome,
permettrait un meilleur rendement fromage. La seconde catégorie comprend la
production de protéines humaines, ou encore de produits pharmaceutiques, dans le
lait d'une vache ou d'une brebis (Groenen and Vanderpoel, 1994). Ainsi, il est
possible de faire produire le facteur IX de coagulation humaine, destiné aux
h&mop,hiles, dans le lait d'une brebis (Molly et PoUy) (Schnieke et al., 1997), de le
filtrer et d'isoler la protéine synthétisee (revue par Murray (Murray et al., 1999))
Ces possibilit6 sont devenues accessibles grâce a la transgén&e. Bien sûr, une
telle technologie est très prometteuse. Cependant des efforts restent a être fournis en
ce qui concerne L'efficaci~ des procédures, ainsi que la possibilité de reproduire
efficacement ces expériences. Le présent ouvrage devoile des expériences effectuées
dans le but d'augmenter le taux d'efficacite de tels procedes en utiiisant le principe de
la recombinaison homologue applique des cellules épithdiales de glandes
mammaires bovines.
CHAPITRE II
2.1.1 Premières incorporations nucléaires d'ADN exogène
La technologie des animaux transghiques telle que nous la connaissons
aujourd'hui a vu le jour au début des annees 80 (Brinster et al., 1981; Gordon et al.,
1980) alors qu'une souris exprimait un transgène dans certaines de ses cellules, suite à
une microinjection pronucléaire, et qui fut finalement transmis à sa descendance
(Gordon and Ruddle, 1981). Cette incroyable réussite fut le huit de plusieurs progrès
realisbs les uns à la suite des autres. Mis A part les mulaples dkouvertes entourant
l'ADN ainsi que les debuts de la culture cellulaire, les possibilités que nous
co~aissons aujourd'hui originent des expériences de Szybalska et Szybalski qui
&ussirent B incorporer un ADN étranger A l'intérieur de ceiiules de mammifere in
vitro et à le faire transcrire (Szybalska and Szybalski, 1962; Ledoux, 1965). La seconde
grande étape fut le début de la microinjection d'ADN a l'int6rieur d'ovocytes de
Xenopus lamis (Gurdon et al., 1969) suivie par la transcription de cet ADN (Mertz and
Gurdon, 1977) puis sa traduction (De Robertis and Mertz, 1977). L'idée de pratiquer
la transgén2se devenait dès lors plausible.
2.1.2 Animaux transgéniques
Suite A la première lignde de souris transgéniques, produite par infection virale
d'un embryon au stade 4 cellules (laenisch, 1976), et A la première souris transgénique
produite par microinjection de Gordon en 1980 (Gordon et al., 1980) ainsi que la
preuve de la transmission du caractère (Gordon and Ruddle, 1981), d'autres réussites
se succédeent les unes aprPs les autres. Un progr& important fut la culture des
cellules souches embryonnaires ou " embryonic stem (ES) cells ", également en 198 1
(Evans and Kautman, 1981; Martin, 1981) et leur capacité à participer A la formation
d'une souris suite a une injection à I'intérieur d'un blastocyste (Bradley et al., 1984).
Forts de ces possibilités, d'autres chercheurs poussèrent les d4couvertes en
transfectant les ES c d s par vecteur rétroviral et en produisant des souris
transgéniques suite à une intégration aléatoire (Gossler et al., 1986; Robertson et al.,
1986). C'est à partir de ces &!mats que la souk " knock out " a pu voir le jour. Il y eut tout d'abord la reussite des premiees expkriences de ciblage génique ou "gene
targetting" (consistant insérer un gène &un endroit précis dans le génome) realisée
sur des cellules de maIIunif&res par recombinaison homologue (RH) sur le gène de
Bêtaglobine humaine (Smithies et al., 1985), puis sur des ES ceils avec le gène
hypoxanthine-guanine phosphoribosyi tramferase (HPRT) (Thetschman et al., 1987;
Thomas and Capecchi, 1987). Par la suite, on procéda a la selection de ES ceils
mutant HPRT- (obtenu naturellement ou provoqué par infection virale) que l'on
transféra ii un blastocyste et dont le caract&re fut transmis aux descendants (Hooper
et al., 1987; Kuehn et al., 1987). De leur CM, Thompson ainsi que Koller en 1989
produisirent séparément les premières souris transgeiiques sui te la correction du
HPRT' par RH dans des ES ceiis suivi d'un transfert dans un blasctocyste menant la
production de souris "knock in" (Koller et al., 1989; Thompson et al., 1989). Des lors,
Tutiütt? des souris "knock out" et '?uiock in" ne cesse de s'accroître et leur usage
devient de plus en plus courant et diversifie (Bronson and Smithies, 1994; Capecdii,
1989; Capecchi, 1989; Jasin et al., 1996; Kuhn and Schwenk, 1997).
Entre temps, n'oublions pas la première microinjection chez les animaux
domestiques supérieurs (lapin/brebis/porc) en 1985 par Hammer (Hammer et al.,
1985). Cette technique de microinjection pronucl6aire a permis plusieurs applications
comme celie de diriger la production de protéines dans le lait, premierement réalise
avec la B-lactoglobuline de brebis chez la souris, puis chez plusieurs animaux de la
ferme par la suite (Murray et al., 1999; Sirnons et al., 1987).
2.2 CLONAGE
Maintenant, le clonage s'insere dans l'approche transgénique par la possibilité
d'utiliser des cellules somatiques transfectées menant à la formation de nouveau-nés.
23.1 Clonage chez les vertébrés
Les premieres réussites scientifiques dans le domaine du clonage furent
obtenues chez Xenopus laeviç par Brigg et King en 1952 (8riggs and King, 1952) alors
qu'ils obtinrent le premier clone de grenouilie partir de noyaux de cellules du stade
blastula. Les améliorations ne tarderat pas a venir puisque le clonage chez X. laevis
se répéta à partir de cellules de gastrula (King and Briggs, 1955), de cellules de
l'endoderme (Gurdon, 1960) et finalement de cellules épithéliales d'intestin de têtards
(Gurdon, 1962; Gurdon and Uehlinger, 1966). La première expérience de clonage
réalisée à partir de cellules en culture (des cellules épithéliales de têtards) ne fut
tentée qu'en 1970, également par Gurdon (Gurdon and Laskey, 1970; Gurdon and
Laskey, 1970).
2.2.2 Clonage chez les mammifères
Chez les animaux de la ferme, on préconisa d'abord la bissection mécanique
pour obtenir des dones. Ceci fut reaiise par Wuadsen en 1979 chez la brebis
(Willadsen, 1979) et répM en 1980 (Wiiiadsen, 1980) pour ensuite être effectué chez le
bovin en 1981 (Willadsen and Polge, 1981). Le premier vrai clonage par transfert de
noyau d'un blastornere suivi d'une électrofusion ne fut effectué qu'en 1986 par
Willadsen chez la brebis (Willadsen, 1986) et en 1987 chez le bovin par Prather
(Prather et al., 1987)) le tout après que McGrath eut reussi une transplantation de
deux pronoyaux dans un embryon enudéé en 1983 (McGrath and Solter, 1983).
Illmensee rapporta en 1981 le clonage de souris a parür de blastom&es, ce qui ne fut
jamais reproduit ou confirm6, releguant cette réference aux oubliettes (Illmensee and
Hoppe, 1981). Cependant, il ne faudrait pas passer sous silence la reussite de Meng et
ses collaborateurs en 1997 qui réussirent les premiers clones chez les primates (Neti et
Ditto) à partir de cellules de blastomGres produits in vitro (Meng et al., 1997).
2.2.3 Tansgénèse couplée au clonage
Plus récemment, il est devenu possible de combiner hansgei&se et clonage.
Grâce à la mise en culture de diff6rents types cellulaires, notamment des cellules du
disque embryonnaire menant à la production de clones de brebis (Campbell et al.,
1996), ainsi que des cellules fibroblastiques foetales et tipithéliales de glande
mammaire de brebis (Wilmut et al., 1997), il est maintenant possible de les transfecter,
de les s4lectiomer et de transférer leur noyau dans un ovule Qiucléé pour mener à la
production de dones transgéniques. On retrouve ces exemples chez les brebis de
Schnieke (Schnieke et al., 1997) et les veau de Cibelli et Rob1 (Cibelli et al., 1998;
Cibelli et al., 1998).
2.2.4 Clonage de cellules adultes
Cependant, le plus grand &4nement dans le domaine du clonage est sans
aucun doute l'utilisation de cellules adultes différenciées comme donneurs de noyaux
menant à la production d'un clone, comme cela fut le cas avec la désormais céièbre
brebis Dolly (Wilmut et al., 1997). En effet, grâce entre autre A la mise en phase Go du
cycle cellulaire suite h une &te des cellules 6pitMiales de glande mammaire de
Dolly en culture (sérum B 0.5%), une reprogramrnation du noyau et de son génome et
une dedifférenciation de la cellule apermis au nouvel embryon, suite au transfert du
noyau dans un ovule bucléé, de se développer en un être complet. Bien que
controversée au début (Sgarameila and Zinder, 1998), la preuve fut faite que Dolly
provient bel et bien d'une cellule épithéliale de glande mammaire adulte provenant
de la mère donneuse (Ashworth et al., 1998; Signer et al., 1998). De plus, I'expérience
du clonage à partir de cellules adultes fut de nouveau rPussie par Wakayama et
Yanagimachi en 1998 à partir de cellules de cumulus chez la souris (Wakayama et al.,
1998).
Bien que nous avons la certitude aujourd'hui qu'une telle réussite est possible
et reproductible, il n'en reste pas moins que le taux de réussite est très faible. De plus,
si nous envisageons d'appliquer la transgénke au clonage, le taux d'efficacité va
chuter encore plus bas puisque la réussite de la transgenese elle-même a un faible
pourcentage de rendement.
Des améliorations constantes ont été obtenues dans les différentes étapes
menant aux animaw transgéniques, comme la maturation in vitro, la fécondation in
viho et le d6veloppement in vitro. La production de cellules "stem cells iike", est un
&ment qui persiste à ne pas être opümisé chez les animaw de la ferme. Toutefois, le
maiilon faible de la chaîne de production d'animaux transgéniques demeure le faible
t a u d'intégration stable du transgène A l'int&ieur du génome de la cellule. En effet,
avec la microinjection on peut espérer avoir un taux d'animaux transgéniques de
0.79% chez le bovin suite au faible taux d'intégration du transgène (Murray et al.,
1999), alors que dans les cellules somatiques transfectées de facon stable, ce taux est
ridiculement bas, surtout lorsque comparé a l'expression transitoire ou au nombre de
cellules totales transfectées. Le problème réside dans le fait que les &anismes
dfint6gration de l'ADN exogène sont Ws mais connus et qu'il semble difficile d'en
optimiser les résultats.
Une porte prometteuse a toutefois semble s'ouvrir avec l'idge de la
recombinaison homologue. Effectivement, l'ualisation de la RH donna
d'encourageants résultats dans l'augmentation de l'intégration des transgènes
microinject6s dans les embryons bovins (Rieth et al., 1999) allant jusqu'a 60%.
L'emploi de la RH, déjà largement utilisée et employée dans la fabrication de souris
"knock out", ne fut toutefois pas ~ 6 s efficace à ses débuts, alors que l'on dénotait un
taux de RH de 1/ 100 à 1/1000 recombinaisons non-homologues (RNH) (Koller and
Smithies, 1989; Sargent et al., 1997; Sedivy and Sharp, 1989; Thomas and Capecchi,
1987), soit un t a w de 1 cellule ayant subi la recombinaison homologue sur 106
cellules transfectées (Kim et al., 1991; Lin et al., 1985). Par contre, l'attirance de l'ADN
pour une sequence semblable facilite l'intégration d'un gène a un endroit dome une
fois sur mille alors qu'il y a des miilions d'autres sites possibles.
2.3 LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE
2.3.1 Recombinaison homologue et non-homologue
La recombinaison homologue se veut un événement biologique ou une
m4thode consistant B faire de l'appariement de bases entre deux séquences d'ADN
homologues, les portant à se recombiner Pune avec l'autre. Cet événement nahuel
peut être mis à profit entre autre pour augmenter i'insertion d'un transgeie à un site
particulier il l'intérieur du geiorne de l'organisme &tudi&. Bien sûr, ce mkanisme
complexe exécute à l'aide d'enzymes n'est pas encore tout à fait ducid& mais de plus
en plus les piéces du casse-tête tombent en place. La recombinaison non-homologue,
quant a eue. est le resultat de la jonction ou la recombinaison de deux segments
d'ADN ne possédant pas d'homologie connue. Cette seconde éventuaïité se produit
beaucoup plus fréquemment que celle d'une RH. Cependant, la mise à profit d'un
site homologue connu étant répété plus de 100 000 fois travers le génome peut
servir à parer le manque d'efficacité relative de la recombinaison homologue versus
non-homologue. Cependant, comme l'utilisation du site homologue connu est
100 000 fois plus attirant, il y a là des possibilités de s'en servir et des mettre à profit.
2.3.2 Les modèles de recombinaison homologue et non-homologue
Afin de mieux comprendre et visualiser les principes impliqués lors d'une
recombinaison, des modèles de ces phénomènes ont été proposés. Le premier
émettre une hypoth6se ht Holliday en 1964 qui préconisa la formation d'une jonction
mieux connue sous le nom de jonction d'Holiiday (Holliday, 1964). Cette jonction se
voulait la base de l'appariement homologue et des croisements permettant de definir
et d'expliquer les résultats d'une conversion génique (échange de segments d'ADN)
entre deux brins d'ADN, soit un échange de brins complémentaires. Plus tard,
Meselson et Rading en 1975 proposèrent un ajustement au modèle en stipulant qu'un
segment d'ADN simple brin (single s trand DNA (ssDNA)) provoquait Pappariement
des bases avec une autre molécule d'ADN homologue (Meselson and Radding, 1975).
Depuis ce temps, et au fil des nouvelles découvertes, d'autres modeles prirent place.
Parmi c e w u , plusieurs stipulérent l'importance d'un bris du double brin (Szostak et
al., 1983; Shinohara and Ogawa, 1995; Lin et al., 1984), où Lin mit en évidence l'action
d'exonucléases 5' pour rendre simple le brin complémentaire (Lin et al., 1987).
Certains, comme Stasiak (Stasiak, 1992), mirent l'emphase sur un intermédiaire de
triple hgiice d'ADN, peut-être influencé par la découverte de Rauth où un ADN
simple brin pouvait faire de ia RH (Rauth et al., 1986), tandis que d'autres suggérèrent
un mécanisme basé sur le "one-sided invasion model" (Belmaaza and Chartrand,
1994).
En ce qui concerne les modeles de recombinaisons énoncés, plusieurs
s'attardèrent plus spécifiquement à la RNH. Ces derniers trouvèrent qu'il existait
apparemment deux diff&ents mécanismes par lesquelles une RNH pouvait survenir.
Ces deux principes sont ceux de "jonction des extrémités" et de "recombinaison
ill4gitime" avec une ou quelques bases d'homologie (Roth et al., 1985). Le premier,
comme l'indique le nom, est la simple ligation de deux extrémités de molécule (Thode
et al., 1990) d'ADN entre lesquelles aucune homologie n'est présente ou seulement de
1 a 10 nucléotides (Letunan et al., 1994). Selon Roth, trois modèles peuvent expiiquer
la ligation des extrémités, soit le "le brin simple", le "template directed" (moulage
induit) et le "postrepair liga tion" (Liaison pst-répara tion (Roth and Wilson, 1986)). L e
second mécanisme consis te plu tôt à une recombinaison ex tramoléculaire aléatoire
mais qui peut souvent être provoquée par la pr6sence d'une très courte s4quence
d'homologie (autour de 5pb) entre les deux molécules d'ADN (Stringer, 1982). Ce cas
est bien identifié aussi dans le modele de Hamada (Hamada et al., 1993).
2.3.3 Les enzymes impliquées dans le processus de recombinaison
Tant in vitro qu'in vivo, la recombinaison de brins d'ADN ne peut être effectuée
qu'en présence d'enzymes bien s@cifiques. Il subsiste encore beaucoup
d'interrogations à savoir queiles sont toutes les enzymes impliquées dans une telle
opération, quels sont leurs rdes precis et à quel moment ou dans queiles
circonstances interviennen t-elles? Les études effectuees chez les bactéries (Escherich iu
coli) nous ont beaucoup appris sur la nature des enzymes qui doivent être présentes
pour produire des recombinaisons, soit la RecA (Kurumizaka and Shibata, 1996; Rao
et al., 1995; Stasiak, 1996), les RecBCD, des "prot6ines s'attachant au simple brind" et
autres enzymes (Kowalczykowski, 1994). On retrouva par la suite chez les eucaryotes
(la levure entre autre) des enzymes analogues il celles des bactéries, comme la Rad51
(Edelmann and Kudierlapati, 1996; Rao et al., 1995) et autres (revue (Camerini-Otero
and Hsieh, 1995)). Ii fut donc determine que les cellules de m a d i i r e s possédaient
la machinerie nécessaire pour faire la RH (Kudierlapati et al., 1984), et dans un
second temps, que les enzymes responsables des recombinaisons sont essentiellement
les mêmes que celles impliquées dans la dparation de 1'ADN génornique des
spécimens (Ayares et al., 1987). Un bon exemple de ce cas est celui de i'ADN
topoisornérase type 1 (Been et al., 1984). Rappelons-nous aussi le rdle que semble
jouer Yexonucléase 5' dans le modde de Lui, et dont la présence grandissante lors de
la maturation des ovocytes de Xmopus correspond A une augmentation de la RH
(Lehman et al., 1993). Les récents progrès scientifiques ont même pennis de
cristalliser et de photographier les protéines, tel que RuvC (Shinagawa and Iwasaki,
1996), où encore de photographier la structure d'enzymes, tel que RuvB, par
microscopie électronique à transmission (Ldey, 1994), permettant de mieux dCfinU
leur rôle. Des mutants de ces enzymes, comme avec la P53 (Bertrand et al., 1997), ou
l'uolisation d'inhibiteurs spéllfiques, comme avec les topoisornérases (Aratani et al.,
1996), nous permettrons un jour de déterminer le véritable principe mécanique de la
recombinaison en remplacement de modèles hypothétiques. Les connaissances
acquises découlant de lëtude de ces enzymes permettent d'envisager l'uolisation de
ces dernières, tel que la RecA, dans des protocoles standards de transfection afin
d'augmenter le taux d'int6gration de nos transgènes (Rieth in progress).
2.3.4 L'importance de la phase du cycle cellulaire pour la recombinaison
En etroite relation avec la présence des enzymes, il a et& demontre que la phase
du cycle ceilulaire dans laquelie se trouvent les cellules influençait le taux de RH.
Ainsi, Wong détermina que du debut jusqu'au milieu de la phase-S, les
recombinaisons peuvent être jusqu'a 15 fois plus &levées qu'en phase G1 (Wong and
Capecchi, 1985; Wong and Capecchi, 1987). Ceci est venu appuyer les résultats de
Subramani voulant que la recombinaison, tant homologue que non-homologue,
pouvait s'effectuer en absence de réplication mais qu'de était toutefois stimulée par
ceileu (Subramani and Berg, 1983). Dans la même optique, des mutants de la P53
(protéine du " check point" de G1) auront un plus haut taux de recombinaison intra-
chromosomique, possiblement parce que la durée de cette demiete phase,
défavorable aux recombinaisons, est raccourcie. Un second facteur de lëtat cellulaire
influençant la recombinaison semblerait être la difference entre l'utilisation des
cellules immortalisées ou non-transformées. C'est ce que Finn stipula en démontrant
une diminution de la recombinaison extrachromosornique dans les cellules non-
transform6es comparativement & ceiles immortalisées (Finn et al., 1989), ce que
Thyagarajan appuya lorsqu'il démontra un taux de RH extrachromosomique près de
100 bis plus éleve dans des extraits de cellules immortalisées que non-transfomées
(Thyagarajan et al., 1996).
2.3.5 Études extra-chromosomiques versus intra-chromosomiques
Dans la panoplie dr&udes ayant et6 effectuées sur la RH, plusieurs ont été
effectuées in vitro, avec des extraits cellulaires (Boan et al., 1998; Kucherlapati et al.,
1985; Thyagarajan et al., 1996), ou encore in vivo, à l'intérieure même de cellules
vivantes. Parmi ces deux catégories, nous retrouvons une subdivision qui separe les
études de recombinaisons comme étant soit extra-chromosomiques ou intra-
chromosomiques.
Les études de recombinaisons extra-chromosorniques se limitent A la
recombinaison entre deux molécules d'ADN, souvent entre deux plasmides ou deux
brins d'ADN linbahes. Dans ces cas là, nous parlons de recombinaison extra-
moléculaire. A l'opposé, la recombinaison intra-moléculaire serait le cas ou
lëvénemen t de recombinaison observe s'effectuerait à l'intérieur de la même molécule
d'ADN. Ces cas sont observ& par exemple lorsque l'on coupe un plasmide en deux
et que l'on observe le produit de sa iigation (procédé qui s'effectue en moins d'une
h e m (Folger et al., 1985)), dont cette dernière permet la s61ection du plasmide
recircularisé suite a l'expression d'une pïotme quelconque (voir le point 2.7).
Les &tudes intrachromosomiques sont les expériences où hWnement d'une
recombinaison s'effectue entre I'ADN exogène, ciradaire ou Maire, et les
chromosomes de I'ADN génomique, à I'intMeur même de ceux-ci. Nous verrons
plus loin, au point 2.7, les methodes de sélection et d'observation de tels événements.
2.3.6 Caractéristiques de la recombinaison homologue
Lorsque les termes "recombinaison non-homologue" ou "recombinaison
illégitime" sont employés, ils réfèrent à un événement de recombinaison, c'est-àdire
d'Mange (réciproque ou non) de segments de nucléotides entre deux molécules
d'ADN, qui n'ont aucune sbquence de nucléotides en commun, donc aucune
homologie spécifique connue partagée. J'insiste ici sur le terme "spécifique connue"
car, comme mentionné dans le point 2.2 sur les modèles, dans certains cas de JXNH,
on decouvre après coup que l'endroit où a eu lieu la recombinaison comportait une
courte série de nucléotides (2 6) identiques à la seconde molécule d'ADN qui se
recombine (Ruley and Fried, 1983; Stary and Sarasin, 1992). Il en va de même chez les
bactéries (Marvo et al., 1983). Parfois même, dans ces cas, Yon découvrira l'ajout de
d'autres nucléotides a la jonction (Mumane et al., 1990) où encore, dans certains
exemples, il arrive que l'on retrouve des delétions allant jusqu'h 62 pb au site de la
ligation terminale (Rohan et al., 1990). Ainsi, il apparaît que la RNH ou illégitime
s'effectue parfois à raide d'une courte sbquence d'homologie. Dans les autres cas où
absolument aucune homologie n'est présente (donc indétectable), la recombinaison
s'effectuerait à l'aide des enzymes de réparation suite une brisure dans l'ADN au
point de recombinaison.
Le terme "recombinaison homologue", lorsque employé, réfère B un ~ v b e m e n t
de recombinaison, c'est-à-dire d'échange rkiproque (Kucherlapati et al., 1984) ou
non-réciproque (Folger et al., 1985) de segments de nucléotides entre deux molécules
d'ADN, qui ont une sequence de nucléotides homologues connue en commun, donc
avec une homologie speufique réciproque. Bien que les mécanismes précis par
lesquels un tel processus se produit restent encore a être &lucidés, les diverses
expériences menées sur le sujet ont permis d'observer certaines caractt!ristiques qui
pouvaient influencer le comportement et l'efficacité de la technique de la RH.
23.6.1 Le minimum d'homologie requis pour provoquer une recombinaison
homologue
A partir du début des années 80, les chercheurs s'interrogèrent à savoir quelles
etaient les conditions minimales a remplir afin de pouvoir provoquer une RH ciblée.
Même si lors de RNH un certain degré d'homologie peut être impliqué, celleci n'est
pas ciblée et encore moins provoquée. Par la contribution de Rubnitz et Ayares, il fut
des lors possible de determiner qu'avec une sequence homologue de 14 (Rubnitz and
Subramani, 1984) à 25 (Ayares et al., 1986) nucléotides seulement, nous pouvions
établir des conditions permettant l'éventualite d'une RH. Le minimum de longueur
d'homologie requis pour provoquer une RH etait dès lors détermin& puis confirmé
par la suite par Hua en 1997 (Hua et al., 1997). En ce qui concerne le t a u
d'homologie en tant qu'intbgrite de la sbquence, la littérature demontre dans un cas
particulier qu'il ne semble pas y avoir de différences dans le taux de RH entre des
séquences à 95% ou à 85% d'homologie avec relémm génomique (Villemure et al.,
1997). Tout ceci entre toutefois en contradiction avec les études de Waldman
(Waldman and Liskay, 1988) qui démontra qu'un simple doublet de paire de bases
qui est changé a Pint&ieur d'une longueur d'homologie define, peut diminuer le taux
de RH d'un facteur de 20, et que la longueur totale d'homologie non-interrompue
etait un el6ment considbrer dans l'optimisation d'un tel processus.
23.62 L'effet de la longueur d'homologie
Encore plus précis que la longueur d'homologie non interrompue, la longueur
totale d'homologie est un critere qui est proportionnel au taux de réussite de la RH.
Certains travaux firent ressortir le fait qu'une augmentation de la longueur
d'homologie augmente aussi le ratio de RH versus la RNH (Chang and Wilson, 1987;
Roth and Wilson, 1985) ou tout simplement le taux de réussite d'une RH ("RWXUS and
Capecchi, 1987; Valancius and Srnithies, 1991) (Berinsteh et ai., 1992; Liskay et al.,
1987; Rubnitz and Subramani, 1984). Des &tudes plus speuhques à ce sujet (Ayares et
al., 1986; Rubnitz and Subramani, 1984) d&rnontr&ent que plus la séquence
homologue etait grande, plus le t a u de RH augmentait, mais que concernant de
courtes séquences, un changement dramatique dans la correlation survenait entre des
longueurs de 30pb à 60pb (Hua et al., 1997) et entre 163 à 214 (Rubnib and
Subramani, 1984). Ce n'est qu'en 1995 que Fujitani détermina une règle
approximative stipulant que pour de courtes homologies, la proportion de la reussite
d'une RH est de ~3 (où N =le nombre de nucléotides) alors que pour de grandes
homologies, la relation est linéaire (Fujitani et al., 1995).
2.3.6.3 L'influence des extrémités du segment transgénique
Afin de rendre l'éveiement de la RH encore plus performant, d'autres études
porterent leur attention sur la nature des extrémit& des molécules d'ADN. Ainsi, en
accord avec la proposition des modeles du "bris du double b ~ " , lorsque l'ADN se
retrouve avec les extrhit6s libres (sous une forme linéaire), il est beaucoup plus apte
à effectuer une RH que s'il se retrouve sous une forme circulaire (ou plasmidique)
(Lin et al., 1984). Ceci est d'autant plus vrai si les deux molécules sont linéaires (et ce,
tant irz vifro qu'in vivo) (Song et al., 1985), alors que la recombinaison s'effectuera
pr6férablement par les extrémités (Anderson and Eliason, 1986). Une fois l'ADN
lin4aris&, la forme des extrémit4s n'influencera pas autant la reussite d'une
recombinaison ciblée. Ainsi, si la linearisation est provoquée et s'effectue par des
enzymes de restriction, aucun avantage de RH ne sera conf6re a w segments
possédant des extr4mit6s cohesives, comparativement ceux ayant des bouts francs
(Chang and Wilson, 1987; Wake et al., 1984; Wake et al., 1985). Dans cette optique,
l'utilisation d'un enzyme particulier, soit ceiie de mitochondrie de levure (la 1-SceI)
qui reconnaît une séquence de 18 pb, semble particuliérement favoriser la RH extra-
chromosomale (Rouet et al., 1994) ainsi qu'intrachromosomale (Donoho et al., 1998).
Toutefois, si les nudeotides temiinaux sont des didéoxynbonudéotides, le ratio de
RH versus RNH augmentera dû à la diminution de cette derniee (Chang and Wilson,
1987; Wake et al., 1985). En plus de l'homologie utilisée et de sa longueur, l'endroit
où elle se trouvera sur notre ttansgène influencera le comportement du brui d'ADN.
Ainsi, l'homologie d'ADN utilisée peut se trouver soit de chaque côté du transgène
ou soit d'un seul côté de ce dernier. Aucun avantage notable ne semble être conféré
lorsqu'une sepence homologue se retrouve de part et d'autre du transgene ou d'un
seul côté, la longueur totale d'homologie étant la plus déterminante (Berinstein et ai.,
1992; Thomas et al., 1992). Finalement, il fut 4tabii que suite la position des
séquences homologues, la présence de séquences non-homologues l'extr4mité de
celles-ci semble ne diminuer en rien le t a u d'échanges homologues (Wake et al.,
1985), ou si peu (surtout si la sequeme h&térologue est grande), mais peu importe
qu'elle soit d'un côté ou des deux côtés du transgène (Kumar and Simons, 1993).
Suite ai ces dom&s, il reste difficile de trouver le lien exact avec le rôle différent
qu'alloua Villemure en 1997 aux deux extc&nités dans la reparation d'un "bris du
double brin " par RH (Villemure et al., 1997).
23.6.4 L'effet de l'origine de la séquence homologue et l'instabilité relative
Lors de l'utilisation de la RH pour un projet de recherche, il faut d'abord
determiner le but visé, pouvant être soit de faire du remplacement ou de la mutation
génique (gene targeüng ou knock out), ou tout simplement l'introduction stable d'un
nouveau gène (transgénèse). L'importance de bien cerner i'utilisation teside dans le
choix de la séquence homologue a utüiser. Bien évidemment, si le but est de proceder
a des mutations dirigées ou des réparations d'un geie spécifique, il va de soi que la
sequeme homologue employ4e sera celle du gène visé avec la simple modification
voulue. Cependant, si l'objectif est d'intégrer un nouveau gène de façon stable dans
le génome afin qu'il puisse s'exprimer, les sequences homologues destinées il cibler
cette recombinaison devront résulter d'un choix réfléchi. Dans ce cas il est
avantageux de cibler une int6gration permettant aussi une meilleure regdation de
l'expression, car si FévQiement est &abire, l'expression est changeante d'un clone a l'autre et difficiiement contrôlable (Bronson et al., 1996). Sans avoir trouvé un site de
recombinaison mirade, certaines r6gions semblent favoriser un tel 4vgiement, et on
les nomme "hot spot" (Smith, 1994). Certaines de ces régions ont éte déterminées
comme ayant préferablement une séquence A-U riche (Nagy and Bujarski, 1997).
Allen,puis par la suite Boàn, démontrèrent que les séquences minisateilites humaines . ..
favorisent un plus haut taux d'intégration (Men et al., 1994; Born et al., 1998), ou
encore celles d'ADN satellite péricentromérique de souris (Butner and Lo, 1986), tout
comme les séquences ou 6lénients répétitik en geiéral (Kato et al., 1986; Richard et
al., 1994; Wallenburg et al., 1987). Konopka de son côté etabha un lien favorable
entre la RNH et les séquences de reco~aissance de la topoisornérase type 1
(Konopka, 1988). Néanmoins, certaines de ces regions hautement répétées furent
identifiées comme étant instables pour les gènes integrés. Ainsi, Butner, avec l'ADN
satellite péricentrornérique (Butner and Lo, 1986), Heartlein et Murnane avec les
séquences hautement rép6tées, tel qu'ALU où il y a des duplkations (Heartlein et al.,
1988; Murnane and Young, 1989) dtkouvrirent tous un lieu génomique revêtant cette
instabilité. L'instabilité des intégrations fut aussi d6noncée par Davies, alors qu'il
avait déjà démontr4 que même la correction d'un gène mutant par une réversion
pouvait être rérevertée suite à divers changements dans la chromatine (Davies et al.,
1982). De plus, Brinster démontra que pres de 50% des intégrations obtenues par RH
ne permettaient pas de produire la prot6ine voulue ( B ~ s t e r et al., 1989). Dans un cas
semblable où deux gènes de thymidine kinase (TK) s'intégrèrent dans
l'hétérochromatine et reussirent à s'exprimer, l'augmentation du taux de méthylation
ou des réarrangements au niveau de l'ADN pouvaient reprimer l'expression (Butner
and Lo, 1986). Une autre forme d'instabilité découle du fait que l'integration ciblée
dans un exon spécifique entraîne parfois la disparition de l'intron adjacent (Hunger
Bertling et al., 1990). On pourrait croire que pour obtenir une bonne expression du
transgène, il faut cibler un lieu deja hautement transcrit, au minimum dans
l'euduomatine. Pourtant, Johnson ainsi que BMster témoignèrent du fait que le
ciblage genomique d'un hansghe à l'intérieur de gènes inactifs ou non-exprim4s
n'empêche en rien la transcription de l'exogène, et ce ii des taux semblables a des
gènes actifs (Brinster et al., 1989; Johnson et al., 1989). En revanche, d'autres auteurs
tels que Steele ne reussirent jamais à obtenir une intégration homologue dans
certaines sequences geiomiques, même en ciblant des gPnes constitutivement
exprimes comme l'ADN ribosomal (Steele et al., 1984). Tous ces cas d'expression
differentielle d'un transgène sont largement discutes par Bishop (Bishop, 1996;
Bishop and Smith, 1989).
2.3.6.5 L'effet du nombre de répétition de la séquence cible dans le génome
'Une seconde composante faisant partie de la sélection d'une séquence d'ADN
ghomique cible est le nombre de fois que cette demière se retrouve à travers le
génome. Évidemment, le principe appliqué ici est que plus il y a de séquences
génorniques cibles homologues au transgène, plus il y a de chance que ces deux
segments se rencontrent et se recombinent entre eux. Toutefois, d'autres études nous
portent croire que le nombre de séquences extrachromosomiques n'est pas iëtape
limitante de la RH. Ainsi, peu importe le nombre de copies qui etaient introduites
dans les cellules, le taux de recombinaison extraduomosomique ne variait pas d'une
concentration à i'autre. Waldman a confirme par une étude de cornpetition entre
deux sequemes quasi homologues (une fonctionneUe et l'autre non), que la recherche
de l'homologie n'est pas un facteur limitant pour la RH extrachromosomique
(Waldman, 1994). Cette affirmation fait suite à celle de Folger qui demontrait, dans
des expériences de RH extrachromosomiques, que le petit nombre de copies (aussi
peu que 5 rnoldcules d'ADN) n'est pas un obstade à la rbussite d'une RH (Folger et
al., 1985) et que même l'utilisation d'un seul fragment d'ADN permet d'induire la RH
intrachromosomique dans des cellules de marnrnifi!res (Hunger Bertüng et al., 1990).
D'autres, comme Jasin et Zheng effectueent des expériences semblables avec des RH
intradiromoçorniques et trouvèrent également que l'efficacite du taux de R H ne
dependait pas du nombre de copies homologues dans le génome, qu'elles soient 7 fois
plus nombreuses (Jasin et al., 1985) ou même 400 fois plus nombreuses (Zheng and
Wilson, 1990), la recherche d'homologie ne semblant donc pas être limitante.
2.3.7 Méthodes d'observations et de sélection d'bvènements
homologue
de recombinaison
Bien que le but ultime des chercheurs en ce domaine soit d'augmenter le taux
d'intégration d'un transgène et que la méthode préférentiellement employée est par
RH, encore faut-il être en mesure de prouver I'observation d'un tel pheiomène, et
encore mieux de sélectionner en faveur d'un tel événement. Sur ce point, ce ne sont
pas les idées et l'imagination qui ont fait défaut.
2.3.7.1 Détection d'un événement de recombinaison homologue
Les premiers moyens utilisés pour observer le résultat d'une RH se résumaient
au séquençage. Puisque ces premieres études étaient extrachromosomiques, les
sequences des deux mol6cules d'ADN étant connues et l'endroit de l'éventuelie RH
dejà déterminé, il était assez simple de séquencer la region désirée et d'en deduire s'il
y avait RH ou non. Selon le résultat de la RH attendu, une digestion spécifique aux
enzymes de restriction peut aider B déterminer si le transgene s'est integré a la
position désirée (de Saint Vincent and Wahl, 1983). Pour encore plus de précision,
surtout en presence d'ADN génomique, il est efficace de proceder à une hybridation
avec une sonde. Cette façon de procéder par le Southern a dbjà été mise à profit par
Smithies (Srnithies et al., 1985). Une troisième methode fort efficace est un procédé
d'amplification par PCR d'un segment spkifique d'ADN qui ne peut être présent
qu'en étant le h i t d'une RH (Joyner et al., 1989; Kim et al., 1991; Kim and Smithies,
1988; Zimmer and Gruss, 1989). Le principe est que la séquence d'une des deux
amorces ne se retrouve qu'a f'intérieur du transgbe, alors que la seconde se retrouve
seulement au lieu ciblé de la RH. De cette façon, une integration par RNH ne
provoquera aucune ampiification, alors que seul une RH permettra une amplifcation
par PCR. D'autres tediniques d'observation de l'efficacitk d'une RH, pouvant
conférer certains avantages selon le type d'approche utilis&, sont le recours au RT-
PCR (Danoff et al., 1997), l'utiüsation d'un ELISA dirigé vers une protéine de fusion
présente seulement a la suite d'une RH désirée (Williams et al., 1994), ou encore
même par l'utiüsation de l'hybridation in s i h (Brouillette and Chartrand, 1987).
2.3.7.2 Sélection d'une R H
II n'en reste pas moins que le principe le plus couramment utilisé pour
permettre une augmentation du taux de RH versus la RNH est le recours a un
système de sélection par le biais de la production ou non-production d'une protéine
spécifique (seulement suite à une RH), laquelie confère la possibllite de sélectionner
en faveur ou défaveur de sa presence. La littérature évoque plusieurs de ces
exemples extra-chromosomiques concernant entre autre deux gènes &O (Capecchi,
1990; Kudierlapati et al., 1984; Sedivy and Sharp, 1989), deux gènes TK (Brenner et
al., 1985; Small and Scangos, 1983), deux gènes HPRT (Hunger dertling et al., 1990;
Valancius and Smithies, 1991), APRT (Aratani et al., 1992), ou deux ghes uridine- (de
Saint Vincent and Wahl, 1983) ayant des mutations differentes et sans chevauchement
et dont seule une RH permettrait le rétablissement du gène fonctionnel. L'expression
de la protéine fonctionnelle qui en résulte permet de &lectiomer, dans un milieu
approprié (comme le milieu hypoxanthine-aminopterh-thymidine (HAT) pour les
cellules HPRT), les cellules ayant effectuees une telle reparation. Il existe aussi
plusieurs exemples employant cette technique dans des expériences de
recombinaisons intrachromosomiques (Lin et al., 1985). Dans ces cas là, seul notre
transgéne possède une partie de la séquence d'ADN fonctionnelle du gène
permettant la correction d'une mutation par RH. Cependant, la sélection n'est pas
parfaite a 100% puisque certains transgènes peuvent être corrigés par homologie du
génomique puis s'implanter aléatoirement par la suite (Aratani et al., 1992). est
aussi possible de provoquer une mutation specifique dans un gène fonctionnel par les
mêmes principes de base. D m ces cas b, il peut être possible de sélectionner pour le
g&e mutant (si ce dernia le permet) ou plutôt de procéder a la mutation en intégrant
un gène rapporteur permettant de sélectionner pour ce dernier, comme le g h e NÉ0
fréquemment utilise et qui conf&e une résistance au -18 (Smithies et al., 1985).
D'autres exemples éloquents de ce principe ont depuis été publies (Zijlstra et al., 1989;
Koiier and Srnithies, 1989), dont la double sélection négative/positive (Mansour et al.,
1988).
Une seconde tactique visant 3 sélectionner et enrichir les événements de RH est
la mise en pratique des "trappes", soit le "promoter trap" (Jasin and Berg, 1988), le
"peptide signal sequence trap" ou l'ensemble des deux (Jasin et al., 1990), le "polyA
signal trap" (Skryabin and çdunauss, 1997) ou encore même "l'anti-NÉo ribozymes
trap" et la "promoter NÉo mRNA anti-sens trap" (Skryabin and Sdunauss, 1997).
Cette stratégie consiste a ualiser la s6quence d'un @ne mais sans sa région
prom&rice, ou son signal polyAJ et dont i'hornologie devrait le recombiner en aval du
promoteur, ou en amont du signal polyA dbsigné, perntettant ainsi son expression
suite une RH. Bien entendu, un événement de RNH pourrait permettre
l'intégration du transgène à un autre endroit ailouant l'expression de ce dernier. Il
faut par contre se rappeler que ces tactiques visent à ameliorer la sélection
&bernent de RH ainsi que le ratio de recombinant homologue versus
homologue.
d'un
non-
Jusqu'a présent, nous avons demont& au fil des exemples et des reférences
mentionnées précedemment, les multiples utilités, possibilit6s et avenues
prometteuses que nous réservent les applications de la recombinaison dans le
domaine de la transg6nèçe. Les points qui suivent vont exposer de quelle faqon nous
avons applique nos comaissances de la RH et dans quels buts.
Le prdsent ouvrage se veut une étude de la recombinaison homologue en
fonction de la longueur d'homologie, selon le site d'intégration et son nombre de
répétitions, dans des cellules &pithéliales de glandes mammaires bovines transfectées.
Le but du travail était de définir des conditions favorables à L'obtention d'un haut
taux de RH en variant les caracteristiques précédenunent mentionnées. Une &de
fort semblable, produite par Anne Reith chez des embryons de bovins microinjectt5s,
nous fournit des resultats encourageants d6montrant la possibilité d'obtenir jusqu'à
60% de recombinaison homologue en utilisant une séquence PST1.
Les composantes du prksent ouvrage revêtent l'utilisation de six grands
aspects dont ii sera question dans cette sktion, soit:
-La transfection de cellules somatiques en culture
-L'utilisation de trois différentes longueurs d'homologie pour une sequence en
particulier
-L'utilisation de trois sequences génorniques cibles différentes
-L1uülisation de la GFP comme gène rapporteur
-La s61ection de cellules fluorescentes à l'aide du Fluorescent activated cell sorter
-Le recours à la méthode du PCR afin de révder la présence d'un événement de RH
2.4.1 ~a transfection et l'expression transitoire
Afin de proc6de.r des études de recombinaison homologue, nous devions
&idemment parvenir à incorporer notre transgène dans le noyau de nos cellules. Un
tel processus se nomme "transfection" pour de l'ADN qui s'incorpore dans des
cellules eukaryo tes, alors qu'on parle de "transformation" lorsqu'il s'agit de
prokaryotes. Cependant, une multitude de méthodes offrent la capacite d'effectuer
de telles transformations ou transfections, comme par exemple: les r6trovinis (Cepko
et al., 1984; Mulligan et al., 1979), les capsides virales vides (Slilaty and Aposhian,
1983; Slilaty et al., 1982), la fusion de protoplastes (SandriGoldin et al., 1981;
Schafher, 1980), les liposomes (Bangham et al., 1965; Fraley et al., 1980; Mukherjee et
al., 1978), les liposomes cationiques (Felgner et al., 1987; Stegmann and Legendre,
1997) (Xu and Szoka, 1996), la microinjection nudbaire (Capecchi, 1980; Diacumakos,
1973), l'électroporation (Neumann et al., 1982; Zimmermann, 1982), la précipitation
au phosphate de calcium (Chen and Okayama, 1988; Graham and Eb, 1973), le DEAE-
dextran (McCutchan and Pagano, 1968; Vaheri and Pagano, 1965), par i'intermediaire
de chargement mécanique à la seringue (Waldman and Waldman, 1998), et
récemment par phosphonolipides (Floch et al., 1998) ou par transfert intracellulaire
bacterien direct (GriiiotCourvalin et al., 1998).
Malgré toute cette panoplie de méthodes et de composés commercialement
disponibles, notre choix s'arrêta sur un principe basé sur la technologie de
dendrimeres cationiques non-lipidiques. Ce choix fut basé sur le grand pouvoir
transfectant du produit, la faible toxicité du composant, le côte pratique du protocole
mais surtout dans le but de proceder ultérieurement a des transfections in vivo,
lesquelles semblaient être inhibées par l'utilisation de liposomes. Ces dendrj.mères
sont commercialement disponibles (Qiagen) sous le nom de SuperFect. SuperFect est
un dendrimère G6 polyamidoamine avec 7nm de diamètre et un poids d'environ
30kD. Formé par des monomères de methacrylate et d'ethylenediamine, une fois
activé par hydrolyse, le dendrimere aura environ 140 groupes aminos proton& a 90%. Une fois lié a l'ADN (l'ADN s'enroule autour comme sur des histones), le
complexe aura un diamétre de 90 à 130nm (Tang and Szoka, 1997; Haensler and
Szoka, 1993).
Au cours des années et des multiples expériences de transfection effectuées,
plusieurs données int&essantes sur certains détails techniques se sont accumulées.
Ainsi, nous dénotons: 1) un manque de corrélation entre la réussite de melanges
lipidiques et i'efficacité de leur transfection (Stegmann and Legendre, 1997), 2)
l'importance de la pureté de I'ADN (Ehiert et al., 1993), 3) l'influence de la dimension
du vecteur (Showe et al., 1992), 4) l'importance d'une combinaison appropriée de
promoteur / amplifica teur/et type cellulaire (Wenger et al., 1994), ainsi que la
combinaison promoteu./in bons/ termina teur de transcription/et type cellulaire lors
de transfections (Petitclerc et al., 1995), 5) la connaissance du pic d'expression
transitoire de notre transgène (F?och et al., 1998), ainsi que 6) la différence
d'expression possible entre un tramgène transitoire ou intégr4 (Beilmann et al., 1991).
Il doit aussi exister un moyen dëvaluer la réussite de notre transfection. On
peut utiliser les gènes rapporteurs, la précipitation de l'ADN total (Murphey and
Chrysogelos, 1995), l'hybridation in situ (Cheng et al., 1996), ou la "CR-based
method" (Morales and Gottlieb, 1993), ou encore un moyen de sdectiomer les
ceilules transfectées, comme avec le gène NÉo (Colbere-Garapin et al., 1981; Wobus
et al., 1984), ou bien la combinaison de deux de ces méthodes.
Dans notre étude, l'utilisation de la GFP comme @ne rapporteur (voir point
3.4), couplée i3 une utilisation adéquate du "Fluorescent-Activated Cell Sorter" (FACS)
nous a permis ainsi de sélectionner et de récupbrer nos ceilules transfectt2es et de les
remettre en culture. Cet appareil (le FACS) est conçu pour pouvoir mesurer
l'intensité de la fluorescence a 11int6rieur d'une population de cellules en plus de
pouvoir sélectionner et isoler les cellules fluorescentes des autres (Adams et al., 1997).
De cette maniere, il nous fut possible d'évaluer le taux de transfection transitoire
(48hrs apr&s transfection) et de comparer le taux de transfectants stables (20 jours
après transfec tion) tout en maintenant la survie cellulaire d'une même population. Ici
le terme de transfection transitoire designe le fait qu'un transgène dussisse a se
rendre à l'intérieur du noyau, ce qui lui permet d'être transcrit, sans toutefois que le
transgène ne soit integr6 ii I'intMeur du génome cellulaire. Cela entraîne une
dilution du transgène à chaque division cellulaire. Par opposition, une transfection
stable fait r6Mrence a un transgène qui s'est intégr6 a l'intérieur des chromosomes, et
dont la sequace sera transmise à chacune des cellules filles.
Comme mentiom6 ci-haut, dans l'optique de I'utiüsation de la transfection in
vivo sur les glandes mammaires de vaches, nous avons utilisé des celiules epithéliales
de glandes mammaires bovines immortalisées A i'antighe grand-T ("Human
cytomegalovirus Epithelial Regdation large-T Antigene" (HEM)). Bien que nos
constructions ne furent pas dirigées vers une spéaficit6 tissulaire de la glande
mammaire, une transfection par seringue ou par projecteur de particules pourrait être
envisagée. L'objectif de notre démarche est de pouvoir modifier la composition du
lait de la vache et d'y faire produire de nouvelles proteines, qu'elles soient pour
enrichir le lait de certaines protéines endogènes (comme la kappacaseine pour faire
du fromage) ou encore de mol&ules exogènes (comme des produits pharmaceutiques
(Yom and Bremel, 1993)).
2.4.2 Séquences homologues, BS, PST1,lSsARN
Comme nous travaillons sur l'étude de la recombinaison homologue chez le
bovin, il est très important que nos sequences homologues soient d'origine
génomique bovine. Pour diverses raisons pratiques, nous avons utilisé les trois
séquences suivantes: une séquence satellite bovine (BS), une séquence hautement
répétée et disperske (Pstl) et une séquence codant pour la sous-unité 18s de l 'AM
ribosomal(18S).
La premiere sequence appartient a la grande famille des ADNs satellites
bovins. Cette famille comprend les ADNs satellites bovins 1, II, III et IV, auxquelles
correspond une densite respective de 1.715,1.723,1.705 et 1.710 g/cm3 (Filipski et al.,
1973; Kumit et al., 1973; Macaya et al., 1978; Çkowronski et al., 1984). Notre séquence
satellite bovine ADN 1 est une skquence de 1400pb (Botchan, 1974) retrouvée en
tandem, repetés dans l'h~térochromatine centromérique de tous les autosomes
bovins (Kurnit et al., 1973) pour un total de 100,000 copies, representant de 5 A 7% du
@nome bovin (Filipski et al., 1973; Macaya et al., 1978). De plus, cette séquence a la
caractéristique de renfermer elle-même des sous-séquences répétées (Plucie~iczak et
al., 1982; Taparowsky and Gerbi, 1982) et semble jouer un rôle dans L'initiation de la
réplication Ws tôt dans la phase S (Matsumoto and Gerbi, 1982). Cette s6quence que
nous avons utiüsée, dénommée BS, a servi h étudier l'effet de la longueur
d'homologie sur la recombinaison homoiogue. En effet, a i'aide d'enzymes de
restrictions il fut possible d'obtenir 500,250 ou 50 paires de bases d'homologie de
chaque côté de notre transgène. De plus, cette séquence BS a servi a étudier B la fois
l'effet du nombre de copies cibles a travers le génome ainsi que l'effet du ciblage dans
des regions d1h6térochroma tine centromérique.
La seconde séquence, dénommé Pstl, appartient Zi une famille de séquences
hautement répétitives dispersées à l'intérieur du génome bovin. Cette séquence d'une
longueur de 510pb se retrouve à 2x105 copies (Majewska et al., 1988). Cette s&quence,
accolée d'un seul côté de notre transgeie, fut utilisée afin de d6terminer a la fois
l'effet du nombre de copies cibles à travers le génome ainsi que l'effet du ciblage dans
des régions d'hétéroduomatine ou d'eudirornatine.
La demiere sbquence homologue, soit celle codant pour la sous-unit6 18s de
I'ARN rîbosomal, provient du cDNA de cette sbquence d'ARN (Sylvie Bilodeau, these
de Doctorat). Cette sequence euchromatique se retrouve A près de 200 copies dans le
génome bovin et est transcrite de façon constitutive.
Dans nos constructions, nous avons fait l'usage d'un promoteur ubiquitaire et
constitutif. Il s'agit en fait du promoteur du gène de la B-actine du poulet (Fregien
and Davidson, 1986; Miyazaki et al., 1989). Ce promoteur est connu pour être assez
fort puisque l'actine est une des proteines les plus abondante dans plusieurs celiules,
ayant aussi un taux dev4 d'ARN messager.
De plus, pour les constructions contenant les séquences de 18s et de Pstl, une
sequence ampMcatrice du "Human cytomegalovhs" (CMV) (Hennighausen and
Fleckenstein, 1986) fut accolée devant notre promoteur. Cette combinaison de
CMV/B-actine a d6ja demontré la production d'un haut niveau de transcription dans
des cellules "Chinese hamster ovary" transfectées (Niwa et al., 1991).
Le gène rapporteur utüis5 fut celui de la "Green fluorescent protein" S65T
(Heirn et al., 1995).
2.4.3 Utilisation et caractéristique du tansgène rapporteur GFP S65T
.Ltualisation du cDNA de la protéine verte fluorescente (" Green Fluorescent
Protein " (GFP) mutante S-65-T (Heim et al., 1995) a été le moyen utüisé afin de
determiner l'efficacite de nos transfections. La protéine naturelle de la GFP provient
en fait de 1'Aequoren victoria, une meduse du nord-ouest du Pacifique dont le cDNA
fut cloné par Prasher (Prasher et al., 1992). Dans cet organisme, la GFl? est
naturellement excitée par la photoprot6ine "aequorine" qui elle est activée par une
liaison au calcium en émettant une lumihe bleue a 470nm, mieux connue sous le
nom de " blue-fluorescent protein " (BFP) (phénomène de chimiluminescence)
(Inouye et al., 1985; Prasher et al., 1985). Cette protgine de type sauvage est composée
de 238 audes aminés (encodk par 714 paires de bases) ce qui lui confère un poids
d'environ 27 kD. Son principal pic d'excitation se situe 395111x1 et le second i3 470nm,
alors que le principal pic d'hission est de 509nm et le second a 540nm (Chalfie et al.,
1994). L'bmission de la fluorescence provient d'un chromophore 4-p-
hydr&xybenzyfidene-imidazolidi-5ane suite il une etape de cydisation et
d'oxydation (d'une durée de 4 heures) du trimPre forme de Ser-TyrCly aux positions
65-67 (Magrave et al., 1995; Heim et al., 1994). La structure de cette proteine
demontre un enroulement de 11 feuillets bêta autour d'une seule h&ce alpha centrale
(Ormo et al., 1996; Yang et al., 1996). On estime qu'une concentration de luM de cette
GFP cytoplasmique est nkessaire pour la detection d'un signal de fluorescence
(Niswender et al., 1995). Maheureusement, cette proteine endogène était sujette a une saturation photographique (pho tobleaching) entre les longueurs d'onde de
340m a 440nm (Chaifie et al., 1994). C'est pourquoi Heim produisit la GFP S-65-T
(OU encore ThP5~FP) qui a les propriét6s de se former jusqu'à 4 fois plus vite que le
type sauvage et n'a désormais qu'un pic d'excitation à 490nm et une seule émission a 510m (Heim et al., 1995). De plus, ce dérive de la GFP est jusqu'h 6 fois plus
fluorescent et est détectable a -2ûûnM, soit environ 10 000 molécules (Fatterson et al.,
1997). Subramanian et Srienc (Subramanian and Srienc, 1996) démontrèfent, suite a une lipofection, que le pic dt4mission de GFP transitoire se situait à 36-48 heures post-
transfection et que la division cellulaire était le principal facteur de diminution du
signal, impliquant une dilution de la protéine et du plasmide, et en second lieu la
degradation du tramgène. De plus, ce mutant de la GFP se montre très r6sistant au
"photobleaching" ainsi qu'a d'autres conditions extrêmes de dénaturation (Cubitt et
al., 1995) et il ne semble pas conferrer de desavantage de croissance aux cellules de
mammif$res (Gubin et al., 1997).
.Depuis l'apparition de la GFP, l'utilisation de cette protéine fut mise A profit
d'une part pour en produire d'autres mutants, que ce soit par mutagei&e (Delagrave
et al., 1995; Heim and Tsien, 1996), comme la Enhance GFP de Cormack [F64L/S65T]
(Cormack et al., 1996; Zhang et al., 1996) ou par DNA " shuffling " (Crameri et al.,
1996), et d'autre part, on l'utilisa amplement afin d'en vis;ialiser l'expression in vivo
et cela pour diverses applications t e k que: l'observation des organelles in vivo (De
Giorgi et al., 1996; Rizzuto et al., 1996; Rizzuto et al., 1995), le transport et la
localisation des proteines (Girotti and Banting, 1996; Kaether and Gerdes, 1995
Kalejta et al., 1997; Ludin et al., 1996; Pines, 1995; Suarez et al., 1997) ou encore le
simple comportement de la protéine (Cheng et al., 1996; Gubin et al., 1997; Ogawa et
al., 1995; Yokoe and Meyer, 1996) et autres (Gerdes and Kaether, 1996). Tout
récemment, grâce à l'utilisation de la GFP, Takada démontra qu'il est possible
d'augmenter le taux de transgénèse chez la souris en sélectionnant les embryons
expririiant la GFP avant de les transférer (Takada et al., 1997).
Pour tous les avantages, ci-haut mentionnés, que nous conférait la GFP-S65T,
nous en avons fait l'ualisation en tant que gène rapporteur lors de nos transfections.
Un gène rapporteur peut être defini comme: "une séquence de nuclhtides
determinés qui, lorsque introduite dans un système biologique, va foumir une lecture
pheiotypiquement mesurable suite a son expression. Ceci fournit un paramgtre
déchiffrable et quantifiable en corrélation avec l'événement moléculaire associé à
l'expression génétique" (Wood, 1995).
Pour repondre de telles exigences, un &entail de gènes s'offre nous, il
commencer par le premier uolisé comme tel, soit la "chloramphénicol
acétyltransférase" (Gorman et al., 1982). Vient par la suite l'utilisation de la "L3-
galactosidase" (An et al., 1982; Fowler and Zabin, 1983), de la "thymidine kinase"
(Searle et al., 1985), de tll'aéquorine" (Inouye et al., 1985; Prasher et al., 1985), et de
"l'hormone de croissance humaine" (DeNoto et al., 1981; Selden et al., 1986), suivi de
la "firefly luciferase" (de Wet et al., 1987; de Wet et al., 1985), la "B-gIucuronidase"
chez les plantes (Jefferson et al., 1986; Jefferson et al., 1987) ainsi que "l'alkahe
phosphatase secrétee" (Berger et al., 1988; Yoon et al., 1988).
2.4.4 Identification d'une recombinaison homologue par la méthode du PCR
.Afin de pouvoir déterminer parmi nos cellules transfectees ceiles qui ont subi
une RH, nous avons utilise une méthode de détection basée sur un principe de PCR
sklecüf à un 6vénement de recombinaison homologue (Kim and Srnithies, 1988;
Zimmer and Gruss; 1989; Joyner et al, 1989) (voir figure 2). Les analyses
d'amplification exponentielle ( K R ) furent effectuées directement sur des cellules
(Saiki et al., 1988; Saki et al., 1985).
CHAPITRE III
ÉTABLISSEMENT ET OPTIMISATION DES PROTOCOLES DE TRANSFECTION
Au cours des exp6riences menant A l'étude de la recombinaison homologue, la
mise au point du protocole fut le résultat de l'utilisation de quatre types de lignées
cellulaires, de trois protocoles de transfection et de deux méthodes de purification
d'ADN.
3.1 INTRODUCTION
Ce chapitre se veut une explication de toutes les mesures d'optimisation de la
méthode et du protocole utilisé afin de procéder convenablement nos etudes de
recombinaison homologue.
Comme nos &tudes sur la recombinaison homologue ont eté effectu6es en
employant des séquences homologues du génome bovin, il était essentiel d'utillw
des cellules provenant de l'espèce bovine. Pour ce faire, nous avons eu recours a la
mise en culture de trois Lignées cellulaires bovines, soit des cellules de rein, des
fibroblastes ou des cellules &pithéliales de glande mammaire, afin de déterminer
laquelie de ces lignées &ait la plus facilement transfectable.
Une fois qu'il fut designé que la lignée des cellules épithéliales de glande
mammaire répondait le mieux a nos besoins, nous avons tenté de trouver la meilleure
façon qu'il soit pour purifier et r6cupérer de grandes quantites d'ADN Maire. En
comparant la méthode d'électroélution à celle du "glass powder elution ", nous nous
sommes rendu compte que seul le second protocole nous permettait d'utiliser l'ADN
résultant pour effectuer des transfections.
Finalement, le moyen le plus efficace de transfecter nos celiules fut aussi mis
Mtude. Tout d'abord, utilisant le Superfect la base de nos expériences avec le
protocole de la compagnie, il fut essentiel d'optimiser ce protocole en fonction de
notre type cellulaire et de nos constructions iirteaires. Une fois cette étape accomplie,
nous avons compare nos taux de transkction transitoire obtenus en utilisant cette
nouvelle optimisation, avec d'autres protocoles de transfection, soit l'électroporation
et la précipitation au chlorure de calcium. Comme ces deux derniers protocoles
étaient trop dommageables à la survie cellulaire et ne donnaient qu'un très faible taux
de transfection, nous avons garde le Superfect comme &ment de transfection.
Les points qui suivent donnent tous les détails de la mise en place des
optimisations ci-haut mentionnées ainsi que les protocoles et les résultats de
transfections prdiminaires obtenus. Bien que certains protocoles ne permirent
aucunement d'obtenir un taux de transfection acceptable, il est justifik ici df81aborer
sur les m&hodes employées afin que cet ouvrage exhaustif ne soit pas répete
inutilement.
3.2 LIGNEES CELLULAIRES
La sdection d'une bonne lign& cellulaire etait importante et ces cellules,
d'origine bovine, devaient avoir la qualité d'être facilement transfectable. Afin de
faire le meilleur choix possible, le protocole général de transfection de Qiagen avec le
Superfect fut appiiqub à nos sélections cdulaires en utilisant des cellules COS7, dejà
réputées pour leur hcilité à être transfect&s, comme contrôle positif.
La première lignée cellulaire à être testée fut des cellules épith4liales de rein de
bovin provenant de « Y American Type Culture Collection » numéro CCL-22, cornue
sous le nom de MDKB (Madin & Darby Kydney Bovine cell). En paraiide, comme
mentiom4, nous avons utilise la iigné de cellules COS7, lesquelles sont des cellules
épithéliales de rein de singe aisement transfectables. Malheureusement, les MDKB ne
domerent que de très faibles taux de transfection, alors que les COS7 domaient un
r4sdtat satisfaisant.
Nous avons dès lors procedé à la mise e;i culture de notre propre lignée
cellulaire de fibroblastes foetaux. Pour y parvenir, nous avons disseque, partir
d'une patte de fcetus bovin prélevée 3 l'abattoir, les tissus interstitiels des muscles et
les tendons des musdes. Ces tissus furent digbres à l'aide d'enzymes et les cellules
r4cup4r&es par la suite furent placees en culture. Le milieu de culture pour ces
cellules était du MEM avec 5% de FCS d&omplt!menté (Fetal Calf Serum), add i t io~e
d'antibiotiques. Malheureusement, la transfection de ces cellules ne permit pas
d'obtenir les résultats souhaités ou équivalents à la transfection des COS7.
Par la suite, nous avons obtenu une lignée cellulaire de cellules épithéliales de
glande mammaire bovine immortalisées uülisant l'antigihe grand-T du simian virus
40 (HERA) (D. Petitclerc, CRDBW, Agriculture and Agri-Food Canada, Leruioxvilie,
Quebec, Canada JlM 123). Les premières tentatives de transfection nous ont dome
des taux comparables A ceux des COS7, et voyant leur potentiel de transfeaion, nous
avons continue d'utiliser cette lignée cellulaire pour poursuivre nos recherches.
3.3 PRÉPARATION ET PURIFICATION DE L'ADN :
Tous les plasmides produits furent récupérés sur colonne Maxiprep (Qiagen)
selon le protocole du fournisseur. Selon les constructions héaires testées, différents
enzymes de restrictions furent utiüsés pour obtenir les segments voulus, mais tous
provenaient de New England Biolab (voir figure 1).
La récupération de notre ADN linéaire fut sujette à deux protocoles. La
première méthode employée fut celle du a Glass powder elution (slurry). Par cette
technique de récupération d'ADN Linéaire, il nous fut possible d'obtenir de bons taux
de transfec tion.
Un second protocole permettant de récupérer de grandes quantites d'ADN
linéaire (-50ug), soit l'électroélu tion et i'extraction au phénol/ chioroforme, fut aussi
tes té. Malheureusement, bien qu'efficace pour récupPrer de grandes quantites
d'ADN a bon rendement, l'ADN linéaire ainsi récupére s'avéra impropre la
transfection. Le moyen d'y remédier fut de récupérer l'ADN pr6cipit6 avec la
méthode du a glass powder elution ». C'est donc cette technique du « glass powder
elution » qui fut adoptée. Toutes les quantifications d'ADN, tant plasmidiques que
linéaires, furent effectuées sur un spectrophotomètre a 260nm dans des cuvettes de
quartz.
Le protocole de transfection préconise fut l'utilisation du dendrimere
cationique Superfect (SF) (Qiagen). Les premi&es transfections furent effectuées en
se fiant au protocole généralise de la compagnie.
Les cellules HEIU furent retenues comme matériel d'exp4rience a partir
duquel nous avons optimisé le protocole de transfection pour de l'ADN Maire
(tableau 3.4.1). Pour ce faire, nous avons analyse l'effet du ratio ADN/SF (A), la
quantité de miheu MEM rajouter (B), le temps de contact avec les cellules (C), le
volume de DMEM-FI2 à rajouter @), et le temps d'incubation (E). Les paramétres ii
tester furent établis a partir d'expériences préliminaires mais l'évaluation finale fut
basée sur le pourcentage de transfection transitoire 48 heurcs aprés la transfection.
Les celiules furent placées sur un Wmacyrn&tre et analydes sous un microscope a fluorescence. Les conditions de base de nos transfections contrôles consistèrent dés
lors a utiiiser un ratio dfADN/SF de 1:1, dans un volume de 40ul de MEM (sans
sérum ni antibiotique) pendant 15 minutes, puis de rajouter 250ul de milieu DMEM-
FI2 complet et de mettre le tout en contact 5 heures avec les cellules.
Tableau 3.4.1 : R6sultats d'optimisation de la transfection des cellules de glande
mammaire bovine au Superfect en duplicata (A et B) avec le transgèxte B-actine/GFP
linéaire selon cinq ciifferentes variantes.
B. Muence du volume de MEM dans lequel la formation du complexe à lieu.
A. *Influence du ratio ADN/Superfect
RATIO
211
1:l
1:2 1
2:2
C. Innuence du temps alloué pour la formation du complexe ADNSuperfect.
Volume du
complexe de
formation (ul)
L
60
40
20
Nombre de
cellules comptées
Temps
(min) I
1
15 ,
20
A 1270
1150
1560
1090
Nombre de
cellules comptées
Nombre de
cellules vertes -
B 1250
IO80
1255
875
A
810
1150
1130
I . 25 1 53s 1 1 2o 1 1 3,74 1 I
A
10
41
37
36
Pourcentage %
B
870
1110
1270
Nombre de
cellules vertes
B 5
36
29
30
A
0'8
3,56
2,37
3 3
A
35
49
24
Pourcentage %
Pourcentage % Nombre de
cellules compt6es
B
0,4
3/33
231
3,43
B
39
63
33
A
432
4,26
2,12
A
5,05
335
Nombre de
cellules vertes
A
475
1295
1
B iI
4,48
5,68
2'60
B
4,8
4,08
A
24
46
B
810
785
B
39
32
D. Influence du volume de DMEM-FI2 ajoute au complexe et mis en contact
avec les ceilules.
I Volume ajouté
(d)
Nombre de 1 Nombre de Pourcentage % I I
E. InHuence du temps de contact du complexe avec les ceildes en culture.
contact (hrs)
cellules compt6es
Nombre de Nombre de Pourcentage %
cellules comptées cellules vertes
A 1 B A 1 B A 1 B
A
1335
1410
1505
**Les lignes en caractère gras de chaque tableau indiquent la condition qui a permis
d'obtenir le meiiieur pourcentage de transfection transitoire. Ce sont donc les
conditions qui ont été retenues lors des transfections subséquentes.
B
1260
1210
cellules vertes
A
41
57
34
A
3,07
4,04
2,26
B
50
30
B
3,96
2,48
Par la suite, le recours à d'autres protocoles de transfection ainsi que d'autres
mises au point furent envisag6es afin de vérifier si une augmentation du taux de
transf&tion déjà atteint était possible. Une seconde méthode envisagée fut donc celle
de précipitation au chlorure de calcium.
Malheureusement, ce protocole de base était extrêmement dommageable pour
la survie des cellules et non-propice à la transfection de nos cellules HERA. Pour
tenter de ne pas compromettre la survie de nos ceilules, nous avons tenté alors de les
transfecter tout en diminuant le volume de notre complexe ADNKaC12 mis en
contact avec nos cellules, en ajoutant la moitié, le tiers ou le quart. La survie de nos
cellules était faiblement affectee lorsque le tiers du complexe initial &ait ajouté, mais
nous n'avons observe qu'un très faible taux de transfection.
Une troisième méthode, celle de I'électroporation, fut aussi envisagée. En se
référant à des methodes d'articles antérieurs sur la transformation par élecboporation
de cellules épithéliales de r n a d i k e (Baum et al., 1994; Chu et al., 1987; Spencer,
1993; Webster et al., 1993), il nous fut possible d'daborer une stratbgie
d'4lectropora tion pour nos propres HERA (tableau 3.4.2).
Malheureusement, ce protocole semblait affecter la survie de nos cellules outre
mesure. La mise au point de cette methode nous pennis de d6terminer des
conditions favorables a la s w i e cellulaire. Cependant, dans ces conditions plus
souples, tout comme dans les autres conditions, le taux de transfection de nos HERA
n'était que très faible et n'atteignait pas les niveaux observés en ayant recours au
Superfect
Tableau 3.42 : Conditions d'électropotation testees sur des ceUuleç HERA 1x10~
cellules/ml avec lug d'ADN plasmidique et linéaire (séparément) dans lOOul ou
400111, avec une résistance de 129 ohms il 3 différents voltages et differentes
capacitances.
l O O u l de milieu
(uFarads)
400111 de milieu
(uFarads) L
200 Volts
1
250 Volts
1600
300 Vols
1600
1600
1000
750
1 6 0
100
750
1600
1000
750
500
1600
100
750
500
CHAPITRE IV
MANUSCRIT
STUDY OF HOMOLOGOUS RECOMBINATION ON
TRANSFECTED BOVINE MAMMARY GLAND CELLS
Charles-Andrb Vinette, Anne Rieth, François Pothier and Marc-André Sirard*
Centre de Recherche en Biologie de la Reproduction, Département des Sciences
animales, UniversiM Laval, SainteFoy (Québec), Canada GIK 7P4
'author for correspondence
Running title : Homologous recombination in bovine somatic cells
Key words : homologous recombination, transfection, GFP, soma tic cells,
transgene integration
La recombinaison homologue (RH) est une méthode consistant à pairer les
bases de deux séquences d'ADN homologues qui se recombineront ensemble. Cette
rnétho.de est utilisée pour provoquer et diriger l'int6gration stable d'un transgène a un site spécifique dans le génome de l'hote. Cette technique est couramment utilisée
dans les "knock out" comme eile peut aussi l'être pour augmenter le taux g a r a 1 de
réussite transgénique. Dans cet article, nous présentons une étude sur quelques
caractéristiques de la RH en évaluant différentes séquences d'homologie et leur
capacité a provoquer un événement de RH selon: 1) le statut de leur ADN
(euchromatine ou h&térochromatine), 2) leur nombre de rép6titions a travers le
génome, et pour une d'entre elles, 3) l'influence de la longueur d'homologie. Nous
avons utilise trois d i f f h t e s séquences homologues, soit: l'ADN satellite bovine 1
(BS), la sous-unit4 ribosomale 18s (18s) et l'&ment dispersé et hautement répet6 Pst1
(PST1). Toutes nos constructions furent transfectées à l'aide du dendrydre
polycationique "Superfect transfection reagent" (Qiagen) dans des cellules
épithéliales immortalisées de la glande mammaire bovine en uaüsan t l'antigène
grand-T du virus simian 40. Dans la première partie de nos exp&iences, la moitié des
sequences BS furent placées de chaque côté de notre transgène contrôle Beta-
actine/GFP, et différentes longueurs d'homologie furent obtenues par digestion
enzymatique (500pb' 250pb, 50pb et Opb) pour ktudier leur efficacite relative 3
transfecter ainsi qu'a engendrer la RH. Dans la seconde partie de nos expériences,
l'amplificateur du cytom~galovirus humain (CMV) fut placé devant notre contrôle
précédent, donnant le transgPne linéaire CMV/Beta-actine/GFP, où les séquences
homologues 18s et PST1 y furent accol6es. En 6valuant les événements de RH l'aide
d'une methode spéafique de PCR, nous avons et4 capables de prouver que toutes nos
constnictions linbaires engendraient la RH moins de 48 heures après transfection.
Pour les séquences BS, un signal d'amplification plus intense fut obtenu avec 500pb
d'homologie comparativement a 250pb ou 5Opb. Au cours des passages cellulaires
subs&quents, le signal d'amplification -des trois constructions eu tendance i3
s'estomper puis disparaître.
En ce qui concerne les séquences homologues 18S, le signal d'amplification ne
fut détecté que 48 heures post-transfection. Apr& 12 jours, aucune intégration ne fut
décelée. Pour les séquences homologues PSTl, le signal d'amplification était
apparent 48 heures post-transfection ainsi que 12 jours après mais non 19 jours plus
tard. Le pourcentage de cellules transfectees de façon stable en utilisant les séquences
homologues 18s fut significativement plus bas que le taux obtenu avec le contrôle,
alors que le pourcentage d'integration de ceilules transfectées a l'aide des sequences
homologues PSTl fut siguhcativement plus élevé que le taux obtenu avec le contrôle.
Afin de s'assurer que l'expression de notre transgène Beta-actine/GFP n'était pas
dommageable A la cellule, une ligne cellulaire clonale ayant intégr6 de fqon stable
notre contrôle fut produite et aucun désavantage de croissance ne fut observé. Nos
résultats demontrent qu'il est possible de quantifier l'efficacité de diffgrentes
approches en recombinaison homologue en ayant recours au trie cellulaire suite iî la
transfection de cellules en culture à l'aide de la GFP
Finalement, nos résultats démontrent que l'utilisation de cellules somatiques
(disponible en grand nombre) avec un système stable et reproductible de transfection
jumelée a une methode pratique d'evaluation de la transfection et de sPlection des
cellules transfectées d6sirées (en utiiisant le "fluorescent activateci celi sorter"
(FACS)), il est possible de fournir des données quantitatives permettant de condure a quel point les techniques de RH sont efficaces dans un système in vitro.
'Homologous recombination @ER) is a method consisting in base-pairing two
homologous DNA sequences that will recombine together, and it is used to provoke
and direct the stable integration of a transgene at a specific site in the host geqome.
This technique is commonly used in knock outs as it can be used to increase the
general rate of transgenesis. In this paper, we present a study on some characteristics
of the HR by evaluating different sequences of homology and their capacity to
provoke an HR event according to: 1) their DNA status (heterochrornatine or
euchromatine), 2) their number of repeats through aii the genome and for one of
hem, 3) the infiuence of the length of homology. In Our work, we used three
different homologous sequences, which are: bovine satellite D?JA 1 (BS), 18s bovine
ribosomal sub-unit (1%) and PstI bovine repetitive element (PSTI). AU of our
constructions were transfected by the polycationic dendrirner "Superfect transfection
reagent" (Qiagen) inside a bovine mammary epithelial ce11 line irnmortalized using
large-T antigen from simian virus 40. In the first part of Our experiments, haIf of BS
sequences were placed at both sides of our h e a r Beta-actin/GFP control transgene
and different lengths of homology were obtained by enzymatic digestions (500bp,
250bp, 50bp and Obp) to study their relative effect on transfection efficiency and HR
competence. In the second part of out experiments, a human cytomegalovirus
enhancer (CMV) was placed in front of the previous control, to give CMV/Beta-
actin/GFP linear transgene, where 18s and PST1 homologous sequences were added
to it. By evaluating HR events using specific PCR methods, we were able to prove
that ail of our linear construcs underwent HR within 48 hous p s t transfection. For
the BS sequences, stronger signais were obtained when 500bp of homology were used
compared to 25Obp or SObp, but they all tend to faint and disappear through the
consecutive ceii passages.
For the 18s homologous sequences, the amplification signal was only apparent
48 hours post hansfection but not 12 days after. For the PSTl homologous sequence,
the amplification signal was apparent 48 hours post transfection as weil as 12 days
after hansfection, but not afier 19 days. The percentage of stably transfected celis
using 18s homologous sequences was significantly lower than the rate obtained in
our control, as the percentage of PSTl homologous sequences was sigruhcantiy
higher than the rate obtained in o u control. To make sure that the expression of OUT
linear & t a - a c t i n / ~ ~ ~ transgene was not ha& to the cells, a clone ceil line that has
stably integrated our control was produced and no growth disadvantage was found.
Finaliy, this paper demonstrates that by using somatic cells with a stable and
reproductive system of transfection cornbined with a practical way to evaluate
transfection rate and select for desirable transfected cells (using a fluorescent
activated ceU sorter (FACS)), it is possible to provide quantitative data to conclude on
how effective HR tediniques are in an in vitro system.
INTRODUCTION :
In the early SO's, out knowledge in molecular biology leads to the appearance
of transgenesis and ail of its applications. In the past two decades, incredibly rapid
developments were made in this field, starting with: the fmt transgenic mouse by
microinjection (Gordon et al., 1980) and its germ line transmission (Brinster et al.,
1981; Cordon and Ruddle, 1981), followed by rabbit, sheep and pigs (Hammer et al.,
1985), stem ceils establishment (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981) and their
capacity to participate to the embryo formation (Bradley et al., 1984), k n d out mice
techniques (Koller et al., 1989; Thompson et al., 1989), and protein secretion directeci
in milk (Simons et al., 1987). Lately, the possibility of cloning admals from foetal
fibroblasts and adult ceiis (Wakayama et al., 1998; W h u t et al., 1997) opened the
possihility of cornbining the transgenesis teduiology to doning features (Cibeiii et al.,
1998; Cibelii et al., 1998; Schnieke et al., 1997).
In mammalian embryos or ce11 lines in culture, the event of stable integration is
awfully low. Furthermore, if we want the integration to be made at a specific site
using homologous recombina tion (HR) techniques, the ratio of iniegration by HR
compared to non-homologous recombina tion (NHR) Vary from 1 / 1 0 to 1 / 1000
(Koiler and Smithies, 1989; Sargent et al., 1997; Sedivy and Sharp, 1989; Thomas and
Capecchi, 1987) which is a rate of one event per 106 transfected ceiis (Kim et al., 1991;
Lin et al., 1985).
This targeted integration is mainly
specific gene can be deleted, and in gene
used in knock-out
replacement where
techniques, where a
a mutated gene can
regain its previous wild-type functions. The first gene targeting event by HR to be
reported was on mammalian cells with the human beta globulin gene (Smithies et al.,
1985), then with the HPRT gene in ES ceils @oetsdunan et al., 1987; Thomas and
Capecchi, 1987). Two years later, selection of the correction of the HPRT- gene by HR
on ES celis lead to the production of the first knodc out mice (Kolier et al., 1989;
Thompson et al., 1989).
Through the years, many characteristics of the HR technique have been
studied. Some of them concerned the total length of homology required to provoke
HR. It was found that a minimum of 14 to 25 nucleotides is enough to direct an HR
(Ayares et al., 1986; Hua et al., 1997; Rubnitz and Subramani, 1984), and that HR
events increases, as well as the ratio of HR to NHR, as the length of homology
increases (Ayares et al., 1986; Chang and Wilson, 1987; Fujitani et al., 1995; Liskay et
al., 1987; Roth and Wilson, 1985; Rubnitz and Subramani, 1984; Thomas and
Capecdii, 1987). It was also found that the total length of uninterrupted homology
has a greater influence on the ratio than the overall hornology (Waldmar. and Liskay,
1988).
In cultured rnammalian ceils, using SV40 early region sites in COS cells or
using dihydrofolate reductase gene in CHO cells, the number of repetitions of the
target site in the genome does not seem to increase the HR events (Jasin et al., 1985;
Zheng and Wilson, 1990). However, some specific sequences, named hot-spot (Smith,
1994), seemed more appropriate to allow recombination events, like human
minisatellite (Allen et al., 1994; Boan et al., 1998), mouse centromeric satellite DNA
(Butner and Lo, 1986), as well as repetitive DNA elements in general (Kato et al., 1986;
Richard et al., 1994; Wallenburg et al., 1987).
The objectives of our study were to evaluate different sequences of homology
and their capacity to provoke an HR event to our Beta-actin/GFF' transgene
according to: 1) their DNA sta tu (heteroduomatine or euchromatine), 2) their
number of repeats through all the genome and for one of hem, 3) the influence of the
length of homology. We also dernonstrate a proper way to evaluate the transfection
rate efficiency (transient and stable) of any homologous hansgene construction using
a fluorescent marker, such as GFP, combined with the FACS possibilities and specific
PCR stra tegy to demons trate a genornic integra tion by HR.
To do so, three different sequences of homology were analyzed. The first one
is the bovine satellite DNA 1 sequence (1.715 @m3) (Plucienniczak et al., 1982;
Taparowsky and Gerbi, 1982), which is a 1400bp repeat found in tandem in the
centromeric heterochroma tine of al1 bovine autosomes (Botchan, 1974; Kumit et al.,
1973). These BS sequences were placed at each end of o u linear control transgene
with a remaining 500bp, 250bp and 50bp as three different length of homology
(respectively named BS500,85250 and BS50).
The second sequence used is the cDNA sequence of the 18s ribosonal sub-unit
(kindly provided by Sylvie Bilodeau, Agriculture Canada, Lethbridge) where each
half of the 340bp long sequence were placed at the extremities of Our linear control
transgene. The 18s sub-unit sequences are individually found through out the
genome for a total of 200 copies in the bovine euchrornaüne.
The third sequence used in our experiments, named PSTI, belong to a hmily of
highly repetitive diçpersed sequences (Majewska et al., 1988). This 510bp sequence,
5 found in 2x10 copies and dispersed through the bovine genome, was placed at one
end of our linear control transgene.
Our control transgene is composed of the improved green fluorescent protein
(GFP) (Heim et al., 1995) preceded by the chicken Beta-actin promoter (Fregien and
Davidson, 1986; Miyazaki et al., 1989). The utilization of this marker protein, doned
in 1992 (Prasher et al., 1992), tum out to be very effective for our work due to its
transient ernission pick at 36 to 48 hours post-transfection (Subramanian and Srienc,
1996), its detection at low concentration (-2ûûnM, or 1OOûû molecules) (Patterson et
al., 1997), and its resistance to premature photobleachhg and denaturing condition
(Chaffie et al., 1994; Cubitt et al., 1995). In two of o u experiments the human
cytomegalovinis enhancer (CMV) was added in front of our transgene
(Hennighausen and Heckenstein, 1986).
Encouraging results of integration by HR have already been obtained with
microinjected embryos (Rieth et al., 1999) using BS sequences as weli as others like
Pst1 (in progress). As mentioned above, now that transgenisis technology c m
combine with cloning, we wanted to evaluate the use of speufc sequences (BS, PSU,
18s) to provoke HR in somatic ceiis. Therefore, aii of Our experiments were
conducted on bovine epithelial mammary gland cells in culture that were transfected
with the Qiagen Superfect cationic dendrimer.
MATEIUALS AND METHODS :
Constructions and DNA Purification
For the first part of our experiments, our control transgene was composed of
the 8-actin promoter of chicken and the gene coding for the S65T Green Fluorescent
Protein (GFP, Clontech). For our tesüng conshuctions, we inserted our &actin/GFP
transgene in the middle of a BS sequence (1400bp) leaving about 700bp on each side
of ourcontrol construction, already inserted inside the pPolIII plasmid. To obtain the
different lengths of BS sequences on each side of the construction, we used enzymatic
digestions (New England Biolab) leading to fragments of t SObp, 250bp or 500bp
(Fig. 1A).
For the constructions used in the second part of our experimenb, the human
cytomegalovims (CMV) sequence was added in front of Our control B-actin
promoter/GFP transgene to give our new linear control as CMV/Sactin/GFP
transgene. As for Our other testing constructions, primers were designed according
to the Pstl sequence (Majewska et al., 1988) for amplification by PCR using a proof
reading polymerase. The sequence was then inserted into the pCR2.1 plasmid. The
18s bovine sequence was kindly provided by Dr. Bilodeau in the pBSSK plasmid.
The CMV/B-actin/GFP marker was then placed in the middle or a t one side (in the
case of Pstl) of these sequences using standard cloning procedures. The
cons truc tions ob tained were diges ted with the appropria te restriction enzymes to
give the following fragments each containing about 200 bp of the repeated target
sequence (Fig. 2B.2C).
All the plasmids were purified from Qiagen Maxi Prep, and the linear
constnictions used were isolated and purified by glass powder elution (Vogelstein
and Gillespie, 1979) and both diluted in TloE0.1 buffer (TE lOmM, EDTA O.lmM,
pH=7.4).
Cell Line
The ceU line used in o u experiments waç kindly provided by Dr Denis
Petitclerc (Agriculture and Agri-Food Canada, Le~oxviile) and consists in epithelial
bovine mammary gland celis immortalised using large-T antigen from simian virus
40. C e h were cultured in D-MEM/F12 culture medium (Gibco-BRL) with 5% horse
serum (Sigma), appropriate antibiotics, and incubated at 37'~ with 5% C02.
Transfection Protocols
After opümization of the Qiagen Superfect protocol, transfections were made
in 24 weils plate at 50% confluence (24 hours after replating) with 1pg DNA (either
linear or plasmidic) in 40 jd of medium (without antibiotic nor serum) mixed with lpi
of Superfect (Qiagen) in an ependorf tube and incubated at room temperature for 15
minutes. Culture media (250 pi) was then added to the complex and incubated with
the ceils for 5 hours at 37'~ with 5% CO2, and then replaced by kesh culture medium
with serum and antibiotics.
Transfection Rate Evaluation
For the ceils that have been transfected with out BS/i3-actin/GFP linear
constmctions, we evaluated the transient transfection rate after 48h of incubation
pos t-transfection by observation of the trypsinized cells (tr ypsin-EDTA 0.25%)
expressing the GFP under fluorescent rnicroscopy (Nikon), with a B2A filter (490nm
excitation/ 5 l5nm emission) using
of the cells in culture (without
evalua tion.
For the cells that have been
an hemocytometer. At each passage, we kept 1/8
any selection) for more passages and further
transfected with our 18S/CMV/B-actin/GFP and
PST1 / C m / B-actin/ GFP constructions (either linear or plasmidic), every rate of GFP
expression had been made by Fluorescent Activated Ceil Sorter (FACS). In this case,
cek were also trypsinized, then suspendeci in 300ul of culture media, evaluated by
the FACS and separately recuperated after a selection of green cells or white cells had
been made. These green ceus expressing GFP were then replated until the next day of
evalua tion.
PCR PNA Amplification and Samples Preparation
Detection of HR was carried out according to Kim and Srnithies (Kim and
Smithies, 1988) using a primer specific to the hea r constniction transfected and
another outside the transgene construction transfected but present in the genomic
part of the BS, 18s or Pstl sequences (at the integration site) that give respectively rise
to 700pb (for ail BS transgenes), 900bp and 650bp PCR fragments amplification
(Fig .2).
Oligonucleo tide primer sequences :
UP BS 5'-TTGTGACGGTCTCTTGGAGC-3'
LP BS 5'-ATCAATGTATCTTATCATGTCTGGC-3'
UP 18s 5'-CTATGGAACTGATGAATGGGAGCAG-3'
LP 18s 5'-GACACTCAGCTAAGAGCATCAAG-3'
UP Pst1 5'-CAACAAAGGTCCGTCTAGTCAAGGC-3'
LP PS t l 5'-CCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC-3'
UP GFP 5'-CGTCCATGCCGAGAGTGATCCC3'
LP GFP 5'-ACGGCAACATCCTGGGGCAC-3'
PCR conditions were as follow:
The amplification was carried out using a thermo-cyder (PTC 100, MJ research
inc.). The procedure consisted of denaturation at 94OC for lrnin, annealing at 61°C for
1Jmin (-0.3T per cycle), extension at 7Z°C for lSmin, al1 for 20 cycles followed by 15
cycles of 94°C lmin denaturation, 5S°C lmin annealing and ldrnin extension at 72OC.
Following amplification, 10 of each sample was submitted to electrophoresis on a
1% agarose gel.
For
5 celldpl
our BS/GFP experiments, PCRs were performed on 20@ samples of a
(in water) solution of celis that was made of either white or green c&.
These cells solutions were made ai each passage, the first one beuig 48 hours post
transfection, the second after 5 days, the third afier 9 days and the fourth after 12
days.
The samples for 18s and PST1 experiments consisted in cells that had been
evduated and selected by the FACS at every analysis. They were centrifuged and
ressuspended in DEPC wa ter, and then diluted with the proper c d number in 30 @
steriie water in PCR tubes and frozen. For evaluation, samples were first treated with
proteinase K as proposed by Kim and Smithies (Kim and Smithies, 1988) which
consist in boiling the ceiis at îûû°C for 10 min., then add 1fl of a long/$ proteinase K
(Sigma) at 55OC for 30 min. and then reboiled at 100°C for 10 min. before addition of
the PCR reaction mixture to a final volume of 50 pl. The mixture consisted of 1X PCR
buffer (10 rnM TRISHU pH=8.3, 50 mM K I ) , 2 rnM MgCl2, 20 mM of each
deoxynudeotide, 0.25 pM of each primer, and 1.5 uM of Perkin E h e r LD Taq
poiymerase.
The sensitivity of the false positive primer was tested as previously shown
(Rieth et al., 1999). Before transfection, aii the constructions were tested by PCR with
the primers designeci to detect HR to ensure that there was no amplification.
RESULTS :
~ransfection Rate Evaluation of Different Lengths of BS Bilateral Sequences
In the fint part of our experiments, using different BS bilateral sequences
lengths added to our control transgene, ,transien t transfection rate evalua tion was
made possible by observing the green fluorescent c& expressing Il-actin/GFP linear
control or BS/ B-actin/GFP linear transgenes with an hemocytometer under
fluorescent microscopy using appropriate filter.
The first evaluations of transfection rates were made 48 hours post transfection
on a sample of the cells after trypsinization. Transfection efficiency, as revealed by
expression of GFP, lead to percentage as high as 6.176, for our linear control
construction and 2.1%, 1.9% and 3.4% respectively for 8550, BS250 and BS500
transgenes (table 1). Passages were made at a 1:6 ratio and these cells were then
replated without any selection (green and white cells together) and reevaluated three
days la ter. By that time, the rate of fluorescent ceiis had drop below 1% for ail four
constructions. Nevertheless, subsequent passages were made every three da ys a t a
1:6 ratio for another twelve days where a sample of a 5ceUs/pl (in water) solution was
frozen at each passage.
According to our specific PCR system, enabling us to detect a genornic
integration of o u transgenes by homologous recombination, we showed that all of
three linear transgenes containing BS sequences underwent HR and that the
amplification showing an HR tend to faint from passage O passage for a l three
constructs (Fig. 3). These PCRs were performed on 20pl of Our 5ceils/pl sample
solution.
Transfecüon Rate Evaluation of 18s Bilateral Homology Sequence and PSTl
Unilateral Sequence using the FACS Selection
In the second part of our experiments, using either 18s bilateral sequence or
Pst1 unilateral sequence added to our new CMV/Bactin/GFP h e a r control
transgene, transfection rate evaluation was made possible by using the FACS
apparatus. To do so, at each passage cells were trypsuiised and send to the FACS
apparatus where their fluorescence was evaluated and where they were recoiiected in
two different tubes whether they were fluorescent or not. Samples for PCR
evaluation were made fiom these tubes as mentioned in the material and methods
section. Each thne, ceiis expressing the green fluorescent protein were replated and
cultured upon the next day of evaluation.
From the data obtained by the FACS on the evaluation of the fluorescent
versus non-fluorescent transfected cds, Anova statistical analysis was performed
taking into account the week effect Our results showed a sigruficant difference in the
rate of remaining stable transfected celis after the thitd FACS selection (after 19 days)
when an 18s homologous sequence was added to the linear control transgene or not.
In this case, linear lBS/CMV/B-actin/GFP transgene gave lower percentage of cells
expressing the GFP compared to our linear control CMV/lGactin/GFP. These
evaluations were aii made fiom triplicate experiments where the percentage of
fluorescent selected celis obtained at 48 hrs, 12 days and 19 days post-transfection
were multiplieci together to give the overaii remaining rate of green cells (table 2).
As far as Our PSTl transgene construct is concerneci, the different data
obtained by the fluorescent evaluation tend to demonstrate a higher percentage of
cells transfected by or PST1 /CMV/ B-actin/GFP hear transgene expressing the GFP
compared to our control. The first result showed an overall rate of stable integration,
from the first selection to the thud, almost five times higher for out PSTl/CMV/ IE
actin/GFP linear transgene compared to our CMV/ B-actin/GFP linear control
(table 3).
Applying our new selection method properiy to our PSTl construct, o u
results showed a significant difference in the rate of stable transfected celis after the
third FACS selection (after 19 days) when a PSTl homologous sequence was added to
our iinear control transgene or not. In this case, linear PSTl/CMV/13-actin/GFP
transgene showed a tendency of a higher percentage of cek expressing the GFP
compared to our control CMV/D-actin/GFP (p c 0.05) These evaluations were ali
made from tripkate experiments where the percentage of fluorescent selected cells
obtained at 48 hrs, 12 days and 19 days post-transfection were multiplied together to
give the overali remaining rate of greeri ceiis (table 4).
Evaluation of Homologous Recombination Events by PCR Methods on 18s and
PSTl Homologous Sequences
PCR techniques were appropriate to determine if an HR event had taken place
among the genomic DNA of Our transfected and selected ceiis. The two first PCRs
indicated that our lbS/CMV/ D-actin/GFP linear transgene underwent HR in out
transfected cells within the first 48 hours post transfection (Fig. 4). More specificaliy,
it showed that ampiifkation of a HR event of our h e a r transgene was possible from
500 fluorescent or non-fluorescent cells sample whiie only fluorescent cells sample
permits an amplification when using 50 cells. Amplification signal from the samples
of cells transfected with plasmidic constructions does not prove any HR event since
both primer a ~ e a l i n g sequences, aliowing the amplification to proceed, are on the
plasmid.
The last PCR to be performed on ceus transfected with our 18S/CMV/13-
actin/GFP linear transgene was made on four replicates samples obtained at the third
FACS selection (data not shown). No ampiification signals were observable in any of
our samples. As control, we proceeded in a PCR with our GFP primers, which gave
us an amplification signal for ail of our samples (linear or plasmid transfected, green
or white ceUs selected) (data not shown). This means that transgenes are stiii ptesent
in the genome (entirely or in part), but not integrated by HR and not necessarily
expressed.
The two next PCR results demonstrated tha t our PST1 /CMV/ &actin/GFP
h e a r transgene undement HR in our transfected cells within the first 48 hours post
transfection (Fig. 7). More specifically, it shows that amplification of a HR event of
our linear transgene was possible from both 500 and 50 fluorescent or non-fluorescent
ceils sample. As far as the samples obtained from the second FACS selection (12 days
post-transfection) are concemed, a lost of amplification signal proving HR events was
lost when using non-fluorescent cells while it remained when using green fluorescent
celis and plasmid transfected ce& (fluorescent or not) (data not shown).
Amplification signal from the samples of ce& transfected with plasmidic
constructions does not prove any HR event since both primer annealing sequences
are on the plasmid.
The last PCR to be performed on celis transfected with our PSTl/CMV/P-
actin/GFP transgene was made on four replicates samples obtained at the third FACS
selection (data not shown). The only ampiifïcation signals that were obtained were in
aiI four samples of the 500 green fluorescent c d s previously transfected with the
PST1-plasmid DNA. As control, we proceeded in a PCR with our GFP primers which
gave us an amplification signal for all of Our samples (linear or plasmid transfected,
green or white cells selected) (data not shown).
DISCUSSION :
Up to now, the most common way to produce transgenic animals was by
pronuclear microinjection, which leads to very low rate of transgene integration and
transgenic offspring (Murray et al., 1999). However, Rieth and coauthors recently
showed encouraging resulh which demonstrate that by adding bovine satellite
DNA 1 (BS) homologous sequences to a control transgene, the integration rate by HR
could increases up to 43% of the microinjected embryos (Rieth et al., 1999). In
mammalian ce&, the first gene targeüng event to be performed was on a human
chromosomal beta-globin locus by Smithies in 1985 (Smithies et al., 1985), twenty-
three years after the first incorporation of transgenic DNA by a marnmalian ceU
reported by Szybalska (Szybalska and Szybalski, 1962).
The low efficiency rate reach by HR strategy has always been a problem.
Effectively, only one HR event happens by 100 to 1000 non-HR integrations, or in one
transfected ceIl over a rniilion ones. To increase the ratio, people have looked into:
the enzymes implicated in the process (Rao et al., 1995; Stasiak, 1996), the phase of the
ceil cycle (Subramani and Berg, 1983; Wong and Capecchi, 1985; Wong and Capecchi,
1987), the significance of the homology length (Ayares et al., 1986; Berinstein et al.,
1992; Roth et al., 1985; Rubnitz and Subramani, 1984; Thomas et al., 1992), the
influence of the linear transgene ex tremities (Chang and Wilson, 1987; Lin et al., 1984;
Wake et al*, 1985) and the chosen sequence according to its origin and its genomic
Irequehcy (Allen et al., 1994; Boan et al., 1998; Butner and Lo, 1986; Jasin et al., 1985;
Kato et al., 1986; Richard et al., 1994; Smith, 1994; Wailenburg et al., 1987; Zheng and
Wilson, 1990). To overcome the low HR efficiency, other approaches have been used
like: the positive selection (Zijlstra ei al., 1989), the positive and negative seiection
method (Mansour et al., 1988), and the promoter less or polyA signai trap (Jasin and
Berg, 1988; Skryabin and Schmauss, 1997).
The goal of our research was to find a way to inuease the integration efficiency
of a transgene in marnmalian cells using HR methods. To do so, we first established a
convenient way to evaluate the transfection rate efficiency of our transfection
procedure, coupled with the cell selection of those expressing a fluorescent marker
(ail by FACS (Adams et al., 1997)) and a reliable PCR based technique to iden* HR
events (Kim and Srnithies, 1988). Among many transfection protocols available, such
as: electroporation (Neumann et al., 1982; Zimmermann, 1982)) calcium phosphate
precipitation (Chen and Okayama, 1988; Graham and Eb, 1973), DEAEdextran
(McCutchan and Pagano, 1968; Vaheri and Pagano, 1965), liposomes (Bangham et al.,
1965; Felgner et al., 1987; Stegmam and Legendre, 1997) and nuclear microinjection
(Capecchi, 1980; Diacumakos, 1973), cationic dendrimer technology (Haensler and
Szoka, 1993; Tang and Szoka, 1997) was preferred to others for efficiency, non-toxic
effect, friendly usage and other future considerations. At that point, we evaluated the
capability of three different homologous sequences to provoke an HR event
according to: 1) their DNA status (heterochrornatine or euchromaîine), 2) th&
number of repeats through aii the genome and for one of hm, 3) the influence of the
length of homology.
The first homologous sequence to be tested aside our 8-actin/GFP h e a r
control transgene was the 8s DNAl sequence (Plucienniczak et al., 1982) found in
about one hundred thousands copies in the bovine genome. Primary evaluation of
the transfection efficiency tends to demonstrate a slight advantage to our BS500/13-
actin/GFP transgene compared to the two other lengths used. These data could be in
agreement with Ayares, Roth and others who demonstrateci that the increase length
of homology also increase the rate of homologous recombina tion (Ayares et al., 1986;
Fujitani et al., 1995; Liskay et al., 1987; Roth and Wilson, 1985; Rubnitz and
Subramani, 1984). However, we believe that our overail transfection rates were
under estimated due to the fact that the evaluation under a microscope using an
hemocytometer was not a sensitive method to detect the Iower fluorescent cells.
Nevertheless, the PCR based method developed by Kim and coworkers to
demonstrate HR events (Kim and Srnithies, 1988), and applied here to our samples,
allowed us to show that ali of our constructs underwent integration by HR, the BS500
one giving the stronger amplification signal. The gradua1 fainting in the PCR
amplification signal observed fiom one cell passage to another could be due to
different factors. The first reasonable influence to think of would either be the
competing B-actin promoter or the detrimental biological effects of produced GFP.
These possibilities were put aside when a clona1 celi line, which was made fiom an
isolated single ceii that has stably incorporated the B-actin/GFP linear control
bansgene, was put in culture and that no growth disadvantage were found, even in
coculture with wild type ceils. This support the report of others where the GFP
expression gave no growth disadvantage to mammalian c e k (Gubin et al., 1997;
Takada et al., 1997). It especialiy shows once more the in vitro utility of the GFP, as
already demonstrated by many scientists (Cheng et al., 1996; Gerdes and Kaether,
1996; Kalejta et al., 1997; Rizzuto et al., 1996). The second possible detrimental aspect
related to the survival of these cells is the heterochromatin centromeric position and
the high sepetition of these BS sequences. It is well known that in these chromosome
regions, many DNA binding proteins accomplish their action during ceU division.
Thus, having an integrated and not wanted BS/ P-actin/GFP transgene at this site
could a m the process leading to a toxic effect (Haaf et al., 1992; Rieth et al., 1999). At
this point, both the fact of having a highly repeated sequence and located in the
heterochromatin region may help the integration rate, which would however be
armfui to the ceL Even if the literature has not proved a direct iink between the
number of homologous genomic copies and the integration rate (Jasin et al., 1985;
Zheng and Wilson, 1990), o u results suggest that the number of homology sites is not
the limiting step (Folger et al., 1985; Hunger Bertling et al., 1990; Waldman, 1994).
A sirnilar kind of toxic effect rnight also be involved with out 18S/CMV/&
actin/GFP linear transgene. First of ail, based on our PCR results, genomic HR is
present after 48 hours post-transfection with our IBS/CMV/&actin/GFP (Fig. 4) but
not at the second selection 12 days later. The HR integration either clhappeareci by
king expelled or it conferred a growth disadvantage. This genomic integration by
Hl3 effectively proves that it is possible to target cellular ribosomal genes in cultureci
cells unüke reported by Steele who did not observe any of these events in seven
different mouse c d lines with either circdar or linear DNA (Steele et al., 1984). Here,
the identification of a minimal basal integration is in iine with the mention that there
should not be any ditference in the integration efficiency due to the fact that the target
gene is transcnbed or not (Brinster et al., 1989; Johnson et al., 1989). The observation
of transgene integration by HR in non-fluorescent ceUs (Fig. 5) is also in line with the
fact that up to 50% of these integrations might not aiiow proiein formation (Brinster
et al., 1989). However, the significantiy lower overall rate of stable integration
obtained with this tes ted transgene compared to our CMV/ B-actin/GFP h e a r
control tends more to demonstrate that there is a disadvantage growth effect to the
cells that have integrated the 18S/CMV/@actin/GFP linear construction. Even if this
ribosomal sub-unit sequence is present a t 200 copies in the genome, its rela tively high
importance due to its euchromath status and the high concentration of ribosomal
RNA in each cells (meaning a high transcnptiomal activity) indicates that it might
not be suitable to target for HR and stable expression.
Finally, the third homologous sequence to be tested in our experiment is a
highiy repetitive disperseci element narned PST1 and found at about 2x10~ ümes
through ali the bovine genome. By using PSTl/CMV/B-actin/GFP linear transgene
we obtained a sigdicant higher overall rate of stable integration compared to the
CMV/B-actin/GFP îinear control. This PST1 site wiii now figure among other highly
repetitive elements that aUow high rate of recombination events (Men et al., 1994;
b a n et al., 1998; Butner and Lo, 1986; Kato et al., 1986; Richard et al., 1994;
Wallenburg et al., 1987). However, the fact that HR was observeci at 48 hours and 12
days pst-transfection with our linear PST1 / C m / &actin/GFP transgene but not
after 19 days is ambiguous. It can although be explaineci by saying that this targeting
site, available in large amount, allow HR of a transgene to happen but wiU tend to
reject it or that it will provoke another growth disadvantage. This fact goes along
with other reports revealing instability to integrated transgenes in these highiy
repeated sequences (Butner and Lo, 1986; Davies et al., 1982; Heartlein et al., 1988;
Mumane and Young, 1989). A reason why we still obsewed ceiIs with the
homobgously recombine linear transgene at day twelve is possibly a consequence of
its integration effectiveness. The remaining PCR amplification signal at day 19 from
the PST1 plasmid transfected ceils is unlikely to be transient DNA, but unfortunately
our primers sets cannot allow us to confirm that observation nor to iden* a HR
event.
In conclusion, we showed that bovine satellite DNA 1 homology sequences
stimulate transgene integration by HR, but we did not find a relative significance of
the different lengths used. We also proved that it is possible to target integration in a
cellular ribosomal gene by HR using a 18s sub-unit sequence, and we showed that
the highly repetitive PST1 element significantly increases the rate of transgene
integration through HR events, even Y it appeared to be unstable and to disappear in
the . For this last construct, we demonstrated that HR events were detectable in at
least one ceil out of fifty transfected ones. This indicates that it is possible to obtain
higher rates of integration by HR than the 1 to 10hnsfected cells ratio mentioned
before (Kim et al., 1991; Lin et al., 1985), and even greater than the ones of 1:150
achieved by Zimmer (Zimmer and Gniss, 1989).
Linear transgenes 1 Transfwtion rate after 1 Transfection rate afkr
8-ac tin / GFP
BS50/ 8-actin/GFl? I
BS250 / f3-actin/GFP
Table 1: Transfection rate evaluation of our four different transgenic linear
constiuctions of BSfB-actin/GFP, under W tight using an hemocytometer, at day 2
and 5 p s t transfection
, BS5ûû/ &actin/GFP 1 3.4
48 hrs (Yi)
6.1
2.1
1.9 1
Less then 1.0
5 days (Oh)
1
Less then 1.0
Less then 1.0
Less then 1.0
Days post-
transfection
r
OveraU rate of stable
1 iniegra tion fiam the
1 first selection to day
18s lin GFP Lin I
Table 2: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, of cells transfected
with linear lSS/CMV/B-actin/GFP (185 Iin) and linear CMV/B-actin/GFP (GFP lin)
at 2,12 and 19 days post-transfection in triplicates (A,B,C). h o v a was perforrned
on the overaii rate of stable integration from the firs t selection to day 19, which was
obtain by multiplying the percentage of fluorescent ceUs fiom each three passage
(example for the first column: 5,0% x 2,6% x 71,6% = 0.092%)). C = p < 0.05)
Days post-transfection 1 E T 1 Lin (5%) 1 GFP Lin (%)
Table 3: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, from one replicate
of cells transfected with linear PSTl/CMVf&actinlGFP (PST1 Lin) and linear
CMVIB-actinlGFP (GFP Lin) at 9,19 and 26 days post-transfection. Overall rate of
stable integration fiom the first selection to day 26, was obtain by multiplying the
percentage of fluorescent cells from each three passage.
(example for the first column: 0,6% x 45,4% x 806% = 0.2%).
9 d
19 d
26 d
Overall rate of stable integra tion
from the first selection to day 26
0,6
45,4
80,8
0.22%
0 3
183
80,l
0.044%
L
Days post-
1 transfection
2 d
12 d b
19 d
Overail rate of stable
integra tion from the
first selection to dav
19
0.196 * xxxxx
PST1 lin 1 GFP lin
Table 4: Rate of fluorescent cells determined by FACS selection, of cells transfected
with linear PSTl/CMVA3-actin/GFP (PST1 lin) and linear CMVIB-actin/GFPs(GFP
lin) at 2, 12 and 19 days post-transfection in tnplicates (A,B,C). Anova was
performed on the overaii rate of stable integration from the first selection to day 19,
which was obtain by mdtiplying the percentage of fluorescent cells from each three
passage.
(example for the first column: 825% x 34% x 79,1% = 0.196%) (x = missing value)
(* = p < 0.05)
Figure 1: Piasmid map of the three constructs used and the restriction enzymes sites
used to obtain our Unear transgenes. A) Plasmid BSIB-actinlGFP, B) Plasmid 18S/CMV/B-
actin/GFP , C) Plasmid PST KMVIO-actin/GFP.
Figure 2: Diagram of HR deteetion by specific PCR amplification of a ünear transgene
at a predeflned site in the genome. Using one primer which can only pair to the imnsgene
(primer 1 ) and a second one that can only pair in the genome (primer 2), an amplification
signai of the proper length can only aise if the integration happened at the predicted genomic
site. No amplification wül be perfonned on the linear transgene alone nor the genomic DNA
and neither if the transgene integrates randomly. BS sequences were arbitrary used to help the
identification of the segments as a general pattern.
Figure 3. PCR analysis of genomic DNA from cefis transfected witb BS500, BS250, BS50
and fi-actin/GFP iinear co~t~tnwrtions. The set of primers upBS and lpBS were used to
arnplify a 700bp HR fragment. Reactiuns are: 1 W DNA ladder (lane 1, 10 and 19), positive
BS plasmid control (lane 20), negative linear control (lane 21), BS500 transfected ceiis
sampled 2 days, 5 days, 8 days and 1 1 days post transfection (lane 2-5 respectively), BS250
transfected cells sampled 2 days, 5 days, 8 days and 1 1 days post transfection (lane 6-9)
respectively), BSSO transfected ceils sampled 2 days, 5 days, 8 days and 11 days post
transfec tion (lane 1 1 - 14 respec tively). 8-ac tin/GFP transfected ceUs sampled 2 days, 5 days, 8
days and 1 1 days post transfection (lane 15- 18 respectively).
Figure 4. PCR analysis of genomic DNA fmm ce& trnnsfected with 18S/CMVIBœ
actidGFP Unar constructions on 500 cells (A) and 50 cells (B) 48 hours post-
tradkcîion following FACS seleetion. The set of primer upl8S and lp18S used are to
ampli@ a 9ûûbp HR Fragment. Reactions are: 1 Kb ladder (lane 1). positive 18s plasmid
control (lane 2), negative linear 18s control (lane 3). green fluorescent selected ceiis
transfected by the linear 18S/CMV/B-actinlGFP transgene (lane 4) or the 18s plasmid (lane 5) ,
non-fluorescent selected ceiis transfected by the linear 18S/CMV/D-actin/GFP tmsgene (lane
6) or the 18s plasmid (lane 7), genomic negative control500 green fluorescent cells from our
clone ce11 line (lane 8).
Figure 5.
actidGFP
PCR analysis of genomic DNA from celis bsnsfeeted with PSTl/CMV/II-
Unear constructions on 500 celis (A) and 50 ceiis (B) 48 h o w post-
trandixtion foilowing FACS selection. The set of primer upPSTl and lpPSTl used are to
ampli9 a 650bp BR fragment. Reactions are: 1 Kb ladder (lane l),positive PST1 plasmid
control (lane 2), negative linear PST 1 control (lane 3), genomic negative control of500 green
fluorescent cells from our clone celi line (lane 4). green fluorescent selected cells transfected
by the hear PST1KMVIB-actin/GFP transgene (lane 5) or the PST1 plasmid (lane 6). non-
fluorescent selected ceiis transfected by the linear PSTl/CMV/B-actin/GFP transgene (lane 7)
or the PST 1 plasmid (lane 8).
ACKNOWLEDGMENTS :
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Research
Council of Canada (NSERC), and the " Fonds pour la Formation de Chercheurs et
l'Aide a la Recherche" (FCAR) student scholarship to G A . V. We would also like to
thank D. Petitclerc and D. Labrecque for providing the mammary gland ceiis, as weii
as M. Dufour who operated the FACS.
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CHAPITRE V
Dans un monde où la transgénese devient un outi! de développement de la
recherche, mais dont les taux de réussite sont encore très bas, nous avons tenté au
cours de nos recherches d'augmenter ce t a u d'efficacité en mettant i3 profit les
principes de la recombinaison homologue. Par l'utilisation d'un tel principe appliqué
aux embryons bovins, des resultats très encourageants furent obtenus dans nos
laboratoires ( Rieth et al., 1999). Le but de nos travaux consista donc a 4tudier
I'efficacittS de ce principe sur un modéle de cellules somatiques bovines fors de leur
transfection. Nous avions comme hypothese que l'utilisation de séquences
spécifiques auraient pour effet d'augmenter le taux de RH versus le taux de RNH.
Tout d'abord, afin de pouvoir procéder une évaluation fiable de notre
hypothbe, nous avons effectue la mise au point des protocoles de transfection et
surtout etabli un processus stable permettant l'&aluation comparative des taux de
transfection et l'analyse spéufique du potentiel de RH des séquences à l'essai.
C'est ainsi qu'il nous a ét6 possible d'étudier le comportement de trois
différentes sequences homologues, accolées à notre transgène contr6le lineaire de
Be ta-actine/ GFP, lors de leur transfection aux dendrimPres cationiques sur des
cellules épithéliales de la glande mammaire bovine.
Les résultats obtenus nous ont permis de conclure en premier lieu que les trois
séquences à l'essai, soit l'ADN 1 satellite bovine, la sequeme de la sous-unité
ribosomale 18s et 1' unite dispersée hautement répété PST 1, permirent d'engendrer la
RH a nos transgenes linéaires. Malheureusement, il nous a été impossible de fournir
les mêmes preuves pour nos plasmides puisque les séquences complémentaires des
deux amorces utiiisées se retrouvent sur le plasmide. Dans un second lieu, il fut
déterminé que l'utilisation des sequences 18s rendait siçphcativement moins apte le
transgène h obtenir un taux global de transfectants stables élevé comparativement au
contrôle. Et dans un troisième temps, il fut démontré que l'emploi de la sPquence
PST1 tendait le transgene significativement plus apte provoquer l'obtention d'un
taux global de transfectants stables plus élevé comparativement au contrôle.
L'importance de l'obtention de ces résultats reside dans la preuve de
l'établissement approprié et fonctionnel du processus d'évaluation tant pour le t a u
global de transfection que celui de la RH. Ainsi, il est dorénavant possible d'gvaluer
l'emploi d'une multitude de séquences homologues pour en évaluer le taux
d'efficacité.
Dans notre cas, nous avons observé et quantifi6 pour la première fois
l'apparition et la disparition des 6vhements de RH à l'intérieur du @nome de
m a d e r e s supérieurs. Nous avons toutefois obtenu repense à notre hypothèse,
bien qu'il n'ait pas &te possible d'augmenter de façon drastique le taux de RH long
terme de nos transgènes lors de leur transfection dans des cellules épithéliales de la
glande mammaire bovine.
Quant aux recherches futures dans ce domaine, l'analyse de YefficaciM des
séquences homologues sera maintenant plus aisée et efficace. L'augmentation du
taux d'integration génomique des txansgènes reste un élément essentiel pour
rentabiliser la production des animaux transghiques, mais jusqu'a présent,
l'utilisation de la RH sur des cellules somatiques ne semble pas aussi prometteuse
qu'avec les cellules embryonnaires. Il faut donc non seulement intensifier nos efforts
de ce côté en cherchant à mieux connaître les mécanismes impliqués, mais aussi
tenter de soulever d'autres principes cellulaires d'intégration de l'ADN pour arriver à
augmenter le taux de réussite et d'efficacité de la production d'animaux
transgéniques.
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