Interleukine 33

de la reconnaissance de l’allergène

au relargage actif de la cytokine

Tinturier Dimitri

Contini Thomas

Sansen Thibault

Durand Virginie 2018/2019

Remerciements

Nous tenons premièrement à remercier Rémy Poupot pour ses précieux conseils,

sa disponibilité et son aide tout au long de ce projet.

Un immense merci à Corinne Cayrol de nous avoir reçu et d’avoir pris le temps

de nous conseiller et de nous aider afin de nous orienter dans la gestion du

projet.

Merci à toute l’équipe enseignante du Master 2 EGPR, et plus particulièrement

à Laurent Paquereau, pour leur bienveillance, leur investissement et leur

encouragement.

Enfin, un grand merci aux copains de la promo d’avoir été présents dans les

bons et les mauvais moments tout au long de ce semestre.

Résumé

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique qui touche aujourd’hui plus de 235

millions de personnes dans le monde. La réaction inflammatoire allergique intervient dans les

premiers instants d’une crise allergique. Les mécanismes mis en place par le système

immunitaire pour lutter contre un allergène sont aujourd’hui bien documentés et de nombreux

traitements existent pour atténuer cette réaction inflammatoire. Ces traitements agissent

cependant sur les conséquences de la réaction inflammatoire (par exemple diminuer le

gonflement des muscles des voies respiratoires pour l’asthme). Il n’existe aujourd’hui aucun

traitement permettant de prévenir complètement cette réaction allergique. Il est donc

nécessaire de mettre au point de nouveaux traitements ciblant les premiers intervenants de la

réaction inflammatoire allergique.

Dans ce contexte, nous focalisons notre projet de recherche sur l’interleukine 33. IL-33 est

une cytokine pro-inflammatoire stockée dans le noyau des cellules endothéliales et

épithéliales. Lorsque ces cellules reconnaissent un allergène, l’IL-33 est libérée et se fixe sur

les cellules immunitaires présentant son récepteur ST2, les alertant de ce fait du danger. Ce

relargage rapide fait d’IL-33 un des premiers messagers relargués par les cellules après

exposition à un allergène. IL-33 est ainsi qualifiée “d’alarmine”. Les mécanismes engendrés

par la fixation de l’IL-33 sur son récepteur sont aujourd’hui bien documentés. Cependant, le

mécanisme de relargage d’IL-33 reste à ce jour méconnu. La découverte d’une voie de

signalisation menant au relargage de l’alarmine permettrait l’identification de nombreuses

cibles thérapeutiques intéressantes pour l’élaboration d’un traitement.

Au cours de ce projet de recherche, nous formulons plusieurs hypothèses concernant ce

mécanisme de relargage en se basant sur des informations recueillies dans la littérature. Nous

basons notre recherche bibliographique sur 3 axes : la détection de l’allergène par la cellule,

la signalisation de cette détection jusqu’au noyau et la sortie d’IL-33 de la cellule. Nous

procédons ensuite à une validation de nos hypothèses dans le but de proposer un modèle du

relargage de l’IL-33 dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.

Table des matières

Introduction Bibliographique ..................................................... 1

I. Signaux de dangers ......................................................................................... 3

II. Récepteurs impliqués dans la détection des protéases des

allergènes ................................................................................................................ 5

III. Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation du

danger ...................................................................................................................... 9

IV. Décrochage d’IL-33 de la chromatine et sortie de la cellule ..... 11

I. Lignées cellulaires ............................................................... 15

II. Approche globale, validation du modèle ............................... 17

III. Etude du rôle des récepteurs PAR2 et purinergiques ........... 21

IV. Etude du rôle de l’inflammasome dans le relargage d’IL-33

................................................................................................ 25

V. Etude du rôle d’IL-1β et de la voie des MAPK dans le

relargage d’IL-33 ..................................................................... 29

VI. Recherche de modifications post-traductionnelles sur l’IL-33

relarguée .................................................................................. 33

VII. Recherche d’une protéine impliquée directement dans

l’export d’IL-33 du noyau ........................................................ 37

Bibliographie : ......................................................................... 45

Abréviations :

ADN : acide désoxyribonucléique

AEBSF : fluorure de 4-(2-

aminoéthyl)benzènesulfonyle

AIM 2 : absent in melanoma 2

ARNm : acide ribonucléique messager

ASC : adaptor protein apoptosis-associated

speck-like protein containing CARD

ATP : adénosine tri-phosphate

BALF : fluide de lavage bronchoalvéolaire

C : cystéine

Ca2+ : ion calcium

CO2 : dioxyde de carbone

DAMP : damage-associated molecular

pattern

DMSO : diméthylsulfoxyde

ERK : extracellular signal-regulated kinase

ESI : electrospray ionisation

HBSS : hepes buffer saline solution

HDM : house dust mite

HMGB1 : high-mobility group box 1

HPLC : high-pressure liquid

chromatography

IL-(1β, 33, 5, 6, 18) : interleukine

LPS : lipopolysaccharide

kDa : kilo dalton

K+ : ion potassium

KO : Knock-out

MS : mass spectrometry

MAPK : mitogen-activated protein kinases

MEL : Mouse erythroleukemia cells

MPT : modification post-traductionnelle

NES : nuclear export sequence

NHBE : Human bronchial epithelial cells

NLRC4 : NLR family CARD domain-

containing protein 4

NLRP(1, 3) : NOD-like receptor family,

pyrin domain-containing

NLS : nuclear localization sequence

NPOT : nematic protein organisation

technique

P2X7 : purinergic receptor X7

P2Y2 : purinergic receptor Y2

PAR2 : protease-activated receptor 2

PBS : Phosphate buffer saline

ROS : reactive oxygen species

RT-qPCR : reverse transcription-

quantitative polymerase chain reaction

siRNA : small interfering ribonucleic acid

SD : Standard deviation

SEM : Standard error of the mean

TIRF : total internal reflection

fluorescence microscopy

TLR4 : toll-like receptor 4

TQMS : spectromètre de masse avec un

triple quadrupôle

WT : Wild Type

1

Introduction Bibliographique

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique qui touche plus de 235 millions de

personnes dans le monde (OMS). Cette pathologie se manifeste communément par une

respiration courte et sifflante et une toux persistante. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement

qui permet de guérir l’asthme. Il existe cependant de nombreux traitements permettant de

contrôler la réaction asthmatique après qu’elle soit survenue tels que :

- Des corticostéroïdes qui permettent de réduire le gonflement des voies respiratoires.

- La théophylline qui aide à ouvrir les voies respiratoires en relaxant les muscles lisses

autour des voies respiratoires.

La réaction inflammatoire allergique joue un rôle dominant dans les pathologies allergiques

telles que l’asthme. La détection d’allergènes par les cellules des voies respiratoires entraîne

une forte production de mucus et un recrutement de cellules de l’immunité innée

(éosinophiles) menant à une forte réaction inflammatoire localisée. (Cayrol.C et al., 2018)

Dans leur article de 2018 « Environmental allergens induce allergic inflammation through

proteolytic maturation of IL-33 », Corinne Cayrol et son équipe identifient IL-33 comme un

acteur majeur de la réaction inflammatoire allergique, agissant comme une « alarmine », un

des premiers messagers impliqué dans l’induction de la réaction inflammatoire allergique

dans des cellules épithéliales pulmonaires et des modèles murins. L’implication d’IL-33 dans

la réaction inflammatoire est bien documentée dans la littérature, ainsi que ses cibles et son

mécanisme d’action. Cette cytokine représente une cible de choix dans l’élaboration d’un

traitement visant à atténuer, voire complètement supprimer la réaction inflammatoire

allergique.

Lorsqu’un allergène est détecté par les cellules épithéliales des voies respiratoires, ces

cellules relarguent très rapidement dans le milieu extracellulaire l’IL-33, stockée en temps

normal dans le noyau, complexée à la chromatine. Le clivage d’IL-33 par les protéases

d’allergènes va grandement augmenter son activité biologique (Cayrol.C et al., 2018). Une

fois relarguée et clivée par les protéases d’allergène, IL-33 se fixe sur son récepteur

ST2/IL1RAP, via son extrémité C-terminale. Cette fixation active la voie de signalisation

NFκB par l’intermédiaire de la protéine Myd88 et entraîne la production de cytokines pro-

inflammatoires (IL-6 et IL-13), spécifiques de la réaction allergique. (Lingel.A et al., 2009)

Figure 1: L’exposition des cellules aux allergènes entraînent très rapidement une

augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ et une augmentation de la

concentration extra-cellulaire d’ATP.

(Kouzaki.H et al., J Immunol. 2011) A-/ Les cellules NHBE ont été traitées avec du milieu,

avec A.Alternata ou avec des extraits de blattes orientales (allergène). La cinétique des

concentrations d'ATP dans les surnageants a été mesurée. Les barres représentent la moyenne

± SEM (quatre expériences indépendantes). *p < 0,05, **p < 0,01 comparé au milieu seul par

le test Mann-Whitney U. B-/ Les cellules NHBE ont été chargées de fura 2-AM (indicateur

fluorescent de la concentration Ca2+ intracellulaire) et exposées à un extrait d'A.Alternata. La

fluorescence dans les cellules individuelles a été surveillée et analysée par microscopie

inversée. Les observations obtenues montrent [Ca2+] intracellulaire(i) dans la monocouche de

cellules NHBE avec des pseudo couleurs (vert < jaune < orange < rouge < blanc dans l'ordre

de [Ca2+]i. Le panneau de gauche montre avant l'exposition, et le panneau de droite montre

300s après l'exposition à A.Alternata. Les résultats sont représentatifs de cinq expériences

indépendantes.

3

Cependant, le mécanisme de relargage d’IL-33 n’est pas connu et peu abordé dans la

littérature. C’est pourquoi nous avons dirigé notre travail de recherche bibliographique selon

3 axes :

- La détection de l’allergène par la cellule

- Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation de cette détection jusqu’au

noyau

- Le mécanisme permettant le décrochage d’IL-33 de la chromatine et sa sortie du

noyau et de la cellule.

Nous proposons une hypothétique voie de signalisation permettant le relargage d’IL-33 des

cellules épithéliales pulmonaires dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.

I. Signaux de dangers

L’exposition des cellules aux allergènes entraînent très rapidement une augmentation

de la concentration intracellulaire de Ca2+ et un efflux de K+, ainsi qu’un relargage

extracellulaire d’ATP (Kouzaki.H et al., 2011) (Figure 1). L’ATP est considéré comme le

premier signal de danger. Le stress oxydatif, et notamment la production de ROS (espèces

réactives de l’oxygène), est impliqué dans le relargage extra-cellulaire d’ATP et

l’augmentation de la concentration calcique intracellulaire. (Cruz.CM et al., 2007)

Figure 2: A-/ Reconnaissance des protéases d’A.Alternata par le récepteur PAR2 in vivo.

(Snelgrove.RJ et al., J Allergy Clin Immunol. 2014) Histogramme représentant la concentration d’IL-

33 dans le BALF chez des souris traitées par A.Alternata, ou par A.Alternata et la suramine

(antagoniste des récepteurs purinergiques), ou par A.Alternata et l’AEBSF (inhibiteur de PAR2).*p <

0,05 par rapport aux souris traitées au PBS. †p < 0,05 par rapport aux souris traitées par A.Alternata.

B-/ Les souris KO PAR2 ont une diminution de la concentration d’éosinophiles dans le BALF. (Boer

et al, 2014). Histogramme représentant la concentration d’éosinophiles dans le BALF chez des souris

sauvages, soit chez des souris sauvages en présence de HDM (allergènes acariens), soit chez des

souris KO PAR2, soit chez des souris KO PAR2 en présence de HDM. Les données sont des

moyennes SEM (105 cellules/ml) de 8 souris par groupe. **p < 0,01, ***p < 0,001.C-/La quantité

d’IL-33 diminue dans le BALF en présence A.Alternata et AEBSF (inhibiteur protéase à sérine).

(Snelgrove.RJ et al., 2014) Histogramme représentant la concentration d’IL-33 dans le BALF chez

des souris traitées soit par A.Alternata, soit par A.Alternata et AEBSF, soit par A.Alternata et KO

ST2, soit chez des souris traitées par HDM. *p < 0,05 par rapport aux souris traitées au PBS. †p <

0,05 par rapport aux souris traitées par A.Alternata. D-/Hausse de Ca2+ uniquement dû au récepteur

PAR2 (Boitano et al, Am J Physiol, 2011) Histogramme représentant le % de cellules épithéliales des

voies respiratoires humaines qui ont une augmentation de [Ca2+]i dans différentes conditions. Soit en

présence d’A.Alternata, soit en présence d’A.Alternata et d’inhibiteurs de protéase non spécifiques (PI

Alt), soit avec A.Alternata et AEBSF (inhibiteur de protéase à sérine) (AEBSF Alt), soit avec

A.Alternata et E64 (inhibiteur de la protéase à cystéine) (E64 Alt), ou avec A.Alternata et Peps

(inhibiteur de l'aspartyl protéase pepstatine) (Peps Alt). Les colonnes sont représentées graphiquement

± SEM pour chaque point dans le temps ; n ≥ 4 pour chaque traitement.

5

II. Récepteurs impliqués dans la détection des protéases des allergènes

Plusieurs récepteurs sont aujourd’hui décrits dans la littérature comme acteurs de la

réaction inflammatoire allergique et de la libération d’IL-33. Le récepteur TLR4 a été

identifié comme un de ces acteurs (Hammad.H et al., 2009), mais ici nous nous intéressons à

la détection des protéases d’allergènes par les cellules, TLR4 étant activé par le LPS.

Un des premiers acteurs de la reconnaissance des protéases d’allergènes par la cellule est le

récepteur PAR2 (protease-activated receptor 2). Les protéases d’A.Alternata reconnaissent et

clivent le récepteur PAR2 in vivo (Jairaman.A et al., 2016)(Figure 2A). De plus, il a été vu

que le blocage de l’activation du récepteur PAR2 par les protéases d’allergènes (A.Alternata)

inhibe la libération d’IL-33 dans le fluide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) de modèles

murins (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Figure 2B).

PAR2 fait partie d’une famille de 4 récepteurs, senseurs de protéases extracellulaires. Il s’agit

d’un récepteur transmembranaire, couplé à une protéine G (RCPG). Les protéases

extracellulaires clivent PAR2 sur son extrémité N-terminale. Ce clivage permet

l’internalisation du récepteur ce qui va activer une voie de signalisation intracellulaire menant

à l’induction de la réaction inflammatoire allergique. En effet, chez des souris KO (PAR2 -/-),

il a été observé une diminution de la concentration d’éosinophiles dans le fluide de lavage

broncho-alvéolaire, ainsi qu’une production de mucus et une réaction allergique diminuées en

présence d’allergènes. (Boer.JDD et al., 2012). De même, Snelgrove.RJ et al., 2014

démontrent que la quantité d’IL-33 relarguée dans les lavages broncho-alvéolaires de souris

WT est diminuée lorsque A.Alternata est incubé avec de l’AEBSF, un inhibiteur irréversible

des protéases à sérine (Figure 2C).

Il est démontré que la hausse intracellulaire de Ca2+ est dépendante du récepteur PAR2. En

effet lorsque PAR2 est bloqué avec un siRNA et que la réaction allergique est induite, on

n’observe pas de hausse intracellulaire de Ca2+. Ce résultat indique également que cette

hausse est uniquement due au récepteur PAR2 (Jairaman.A et al., 2016) (Figure 2D).

Figure 3: A-/ Le blocage de P2Y2 et P2X7 en présence A.Alternata, inhibe l’augmentation de Ca2+ et

la sortie d’ATP dans la cellule. (Kouzaki et al, 2011).

Des cellules NHBE ont été transfectées avec des siRNA contre P2X7 ou P2Y2 ou un siARN contrôle

et cultivées pendant 48 h. Les cellules transfectées ont été chargées de fura 2-AM et exposées à

A.Alternata (voir flèches). La [Ca2+]i dans des cellules individuelles a été analysée. Panel de gauche :

Graphique représentant les changements cinétiques de [Ca2+]i avec soit les siRNA contre P2X7 ou

P2Y2 soit avec le siRNA contrôle. (Résultats représentatifs de 3 expériences). Panel de droite :

Histogramme représentant la [Ca2+]i avant (basal) et 400’’ après l'exposition à A.Alternata. Les barres

représentent la moyenne ± SEM (3 expériences indépendantes de 50 cellules chacune). **p < 0,01 par

rapport à [Ca2+]i après exposition à A.Alternata dans les cellules traitées avec le siRNA contrôle par

ANOVA.B-/ L’activation de P2Y2 et P2X7 induit une production d’espèces réactives de l’oxygène

(ROS). (Wang.B et al., Purinergic Signal. 2013) (Müller et al,2010). Panel de gauche: Les cellules

MEL dans un milieu NaCl (contenant 2 mM Ca2+ et 1 mM Mg2+) ont été incubées à 37 °C en

l'absence (basal) ou en présence d'ATP (1 mM) pendant 30 min au plus. Les incubations ont été

arrêtées par addition de milieu MgCl2 et centrifugation, et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI)

(formation de ROS) a été déterminée par cytométrie de flux. La formation de ROS est exprimée en

MFI. Les résultats sont en moyenne ± SD (n = 3). Panel de droite : Histogramme représentant la

production de ROS dans les éosinophiles de patients asthmatiques ou sains, en réponse à l’ATP ou au

C5a (peptide de 74 aa qui induit la production de ROS), dans un milieu exempt de Ca2+ pour exclure

la participation des sous-types P2X et avoir seulement l’effet de P2Y2 . Moyenne ± SEM n = 8. *P <

0,05 (test de Mann-Whitney).

7

Un deuxième type de récepteurs impliqués dans la détection de l’allergène par la

cellule sont les récepteurs purinergiques. Les récepteurs purinergiques sont des RCPG, et leur

implication dans la réaction inflammatoire allergique intervient après le relargage d’ATP

dans le milieu extracellulaire. En effet, l’ATP extracellulaire est reconnu par les récepteurs

P2Y2 et P2X7, qui sont activés et internalisés. Le récepteur purinergique P2Y2 est impliqué

dans l’entrée du calcium dans les cellules. Son blocage en présence d’A.Alternata inhibe

l’augmentation de Ca2+ dans le cytoplasme, tout comme la sortie d’ATP de la cellule

(Kouzaki.H et al., 2011) (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Figure 3A).

P2Y2 et P2X7 vont également induire une production d’espèces réactives de l’oxygène

(ROS). Cette augmentation de la quantité de ROS est reconnue comme un signal d’alarme

pour la cellule (Qu et al., 2017) (Müller et al., 2010) (Figure 3B). Cette production de ROS a

déjà été reliée dans la littérature à l’activation d’un complexe multiprotéique ayant une

activité pro-inflammatoire: l’inflammasome NLRP3 (Martinon.F, 2010) (Zhou.R et al.,

2009).

Figure 4: L’augmentation de la concentration d’ATP induit une production de ROS et donc

une activation de l’inflammasome NLRP3. L’assemblage de l’inflammasome NLRP3 conduit

à l’activation de la caspase-1, qui va clivée la pro-IL-1β en IL-1β mature. (Cruz.M et al., J

Biol Chem. 2007). Histogramme représentant la concentration d’IL-1β dans des macrophages

incubés avec 1 µg/ml de LPS pendant 2 h à 37 °C, avant d'être traités soit avec de l’ATP seul,

soit avec de l’ATP et les inhibiteurs suivants : Z-YVAD-fmk (inhibiteur de la caspase-1),

DPI (inhibiteur redox) ou LY294002 (inhibiteur PI3K), soit avec les inhibiteurs seuls. La

sécrétion de IL-1β a été mesurée par ELISA. p < 0,001 pour les cellules traitées par ATP et

Z-YVAD-fmk, DPI ou LY294002, comparativement aux cellules traitées par ATP seul.

L'expérience a été réalisée deux fois en double, et les résultats représentent la moyenne et

l’écart-type.

9

III. Les partenaires protéiques impliqués dans la signalisation du danger

Dans un contexte pro-inflammatoire, l’activation des récepteurs PAR2 et

purinergiques semblent mener à une activation de l’inflammasome NLRP3.

L’inflammasome NLRP3 est un complexe protéique intracellulaire, lié à l'immunité innée. Il

aurait un rôle dans le développement et l’exacerbation de l’asthme (Simpson.JL et al.,

2014)(Im.H & Ammit, 2014). Ce complexe est constitué d'un récepteur, d'une protéine

adaptatrice et d'une protéase à cystéine. Une fois activé par une molécule associée aux dégâts

cellulaires (DAMP), ces constituants vont s’assembler. Concernant l’inflammasome le plus

connu, NLRP3, son assemblage conduit à l’activation de la caspase-1. Cette dernière, une

fois activée, clive la proforme pro-IL-1β en IL-1β mature, et la proforme pro-IL-18 en IL-18

mature (des cytokines pro-inflammatoires). Il a été démontré que l’inflammasome NLRP3 est

impliqué dans la réponse inflammatoire allergique en présence d’allergènes d’acariens, sur

des modèles murins. (Madouri.F et al., 2015)

Par ailleurs, il a été montré que l’augmentation de la concentration extra-cellulaire en ATP, la

hausse de la concentration intracellulaire en Ca2+, l’important efflux de K+ induisent

l’activation de l’inflammasome. (Murakami.T et al., 2012), (Pétrilli.V et al., 2007). C’est tout

ces facteurs qui permettent l’augmentation de concentration intracellulaire des ROS, puis

l’activation de l’inflammasome NLRP3.(Figure 4) (Zhou.R et al., 2010)

L’inflammasome est responsable de l’induction d’un phénomène de mort cellulaire

programmée : la pyroptose.

La pyroptose est caractérisée comme une « mort cellulaire inflammatoire programmée ».

L’implication principale de l’inflammasome NLRP3 dans la pyroptose est le clivage et

l’activation de la Gasdermine D par la caspase-1. La Gasdermine D, une fois clivée et

activée, va induire une génération de pores dans la membrane. (Liu.X et al., 2016). Ces pores

membranaires pourraient être à l’origine de la libération des alarmines.

Figure 5: IL-1β augmente l’expression de XPO1 (CRM1) via la voie des MAPK, ce qui

induit un relargage plus important de HMGB1. (Kazuhide Hayakawa et al, 2010).

Panel de gauche : Western Blot représentant le taux d’expression de HMGB1 dans les

astrocytes en présence d’IL-1β seul, ou en présence d’IL-1β et une concentration croissante

de U0126 (0.1 à 10 µM) (Inhibiteur de la voie de signalisation ERK). La normalisation est

réalisée avec la β-actine. Panel de droite : L’expression protéique de XPO1 est mesurée dans

des astrocytes sans IL-1β (control) et dans des astrocytes en présence IL-1β (100pg/mL) avec

ou sans U0126 (10µM) (Inhibiteur de la voie de signalisation ERK).

11

IV. Décrochage d’IL-33 de la chromatine et sortie de la cellule

Le mécanisme par lequel IL-33 se détache de la chromatine est aujourd’hui inconnu.

En comparaison, l’alarmine HMGB1 (une cytokine pro-inflammatoire), est elle aussi

complexée à la chromatine. Son export du noyau est précédée de différentes modifications

post traductionnelles (MPT) (Tang.Y et al., 2016). Aucune MPT n’a à ce jour été identifiée

sur IL-33 mais c’est une possibilité à ne pas exclure.

IL-33 est relarguée dans le milieu extracellulaire par au moins 2 mécanismes :

- Un relargage passif, pendant la nécrose. Les pores formés dans la cellule nécrotique

permettent la sortie de l’alarmine.

- La littérature indique qu’il existe également un mécanisme actif de sécrétion non-

canonique, qui n’implique pas de passage par l’appareil de Golgi (pas de séquence

signal sur IL-33). La sécrétion non-canonique semble être dépendante de la

concentration calcique intracellulaire et de la concentration en ATP extracellulaire.

(Lefrançais & Cayrol, 2012)

Dans leur étude en 2010 (Hayakawa.K et al., 2010), Hayakawa et ses collaborateurs

démontrent l’implication de la cytokine IL-1β dans le relargage de l’alarmine HMGB1. Cette

étude est réalisée dans des astrocytes, un parallèle avec les cellules épithéliales des voies

respiratoires dans le relargage d’IL-33 peut être imaginé mais ne peut cependant pas être

considéré comme vrai sans vérifications.

Dans cet article, ils démontrent que la présence d’IL-1β augmente le taux d’expression de la

protéine XPO1 (CRM1), une exportine responsable du décrochage de HMGB1 de la

chromatine et de son export vers le cytoplasme (Figure 5). Dans un contexte pyroptotique, la

sortie de HGMB1 du cytoplasme pourrait être médiée par la formation de vésicules de

Gasdermine D. Un mécanisme similaire pourrait donc être envisagé pour le relargage d’IL-33

avec l’aide d’une protéine de type XPO1.

Figure 6 : Voie de signalisation hypothétique de la détection de l’allergène par une cellule

jusqu’au relargage d’IL-33. La reconnaissance des protéases de l’allergène A.Alternata par le

récepteur PAR2 entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ et un

efflux de K+ et d’ATP. L’ATP est reconnu par les récepteurs purinergiques P2Y2 et P2X7 qui

induisent une production de ROS. Ces ROS induisent l’activation de l’inflammasome

NLRP3. La caspase-1 clive et active la Gasdermine D qui génère des pores dans la membrane

plasmique. De plus, la caspase-1 clive et active IL-1β. Dans les astrocytes, l’augmentation

d’IL-1β dans la cellule active la voie des MAPK (ERK), ce qui augmente le taux

d’expression de la protéine XPO1 et favorise le relargage de l’alarmine HMGB1. Nous

formulons les hypothèses qu’un mécanisme similaire pourrait exister pour IL-33, et que cette

dernière pourrait sortir ensuite de la cellule par des vésicules formées par la Gasdermine D.

(?) : hypothèses à confirmer dans un contexte de réaction inflammatoire allergique.

Contours verts (IL-1β / ERK1/2 / XPO1) : études réalisées dans des astrocytes murins.

Les “?” représentent les informations qui n’ont jamais été vérifiées dans un contexte de

réaction inflammatoire allergique induite par les protéases d’allergène.

13

D’autres résultats semblent confirmer l’hypothèse d’une protéine responsable du décrochage

d’IL-33 de la chromatine. En effet, XPO1 reconnaît sur HMGB1 une séquence d’export

nucléaire (NES), riche en leucine (Bonaldi.T, 2003). Lorsque l’on observe la séquence

primaire d’IL-33, on remarque dans son domaine N-terminal, sur l’exon 3 une région

hydrophobe riche en leucine pouvant représenter un site de reconnaissance d’une protéine

responsable de l’export du noyau.

De plus, il est possible que la sortie d’IL-33 de la cellule se fasse par un système de vésicules

lysosomales, comme cela a été démontré concernant IL-1β, notamment en réponse à

l’internalisation des récepteurs purinergiques P2Y2 après reconnaissance de l’ATP

extracellulaire. (Lefrançais.E & Cayrol.C, 2012), (Qu.Y et al., 2007)

D’après les informations recueillies dans la littérature, nous avons mis au point une voie de

signalisation hypothétique de la détection de l’allergène au relargage d’IL-33 (Figure 6).

Notre projet de recherche vise à valider cette voie de signalisation hypothétique par

différentes approches. Premièrement, une approche globale utilisant une technique innovante.

Ensuite, nous réaliserons différentes expériences de la quantification d’IL-33 relarguée en

inhibant différent points clés de cette voie hypothétique. Enfin, nous souhaitons rechercher

d’éventuelles modifications post-traductionnelles sur l’IL-33 relarguée, et identifier les

protéines responsables de ces potentielles modifications in vitro.

15

I. Lignées cellulaires

HMEC-1 : cellules endothéliales microvasculaires immortalisées. 10ng/mL Epidermal

Growth Factor (EGF), 1 µg/mL hydrocortisone, 10 mM glutamine, fetal bovine serum (FBS)

concentration finale : 10%

HBEC3-KT : cellules épithéliales pulmonaires immortalisées. Airway epithelial cell basal

medium (ATCC PCS-300-030) supplémenté avec le bronchial epithelial cell growth kit

(ATCC PCS-300-040)

Conditions de culture : air 95%, CO2 5%, température 37°C

Pour notre étude, nous souhaitons vérifier cette voie de signalisation hypothétique basée sur

nos découvertes dans la littérature, sur ces deux lignées cellulaires, des cellules endothéliales

microvasculaires HMEC-1 et des cellules épithéliales pulmonaires HBEC3-KT. Nous avons

choisi ces deux lignées puisque ces deux types cellulaires expriment IL-33 constitutivement.

De plus, nous avons sélectionné ces deux lignées puisqu’elles proviennent des tissus en

contact direct avec les allergènes lors d’une réaction inflammatoire allergique : les cellules

épithéliales pulmonaires et les cellules endothéliales des microvaisseaux pulmonaires.

L’objectif est d’observer les mécanismes de détection et de signalisation de la réaction

inflammatoire allergique dans un environnement correspondant le plus possibles aux

conditions physiologiques dans le poumon d’un individu exposé aux allergènes, bien que

nous nous plaçons in vitro.

L’utilisation des faibles concentrations d’allergènes A.alternata (<20µg/mL) suffit à induire

une réponse cellulaire médiée par les récepteurs PAR2. Une forte concentration d’A.Alternata

sur les cellules (20-120 µg/mL) provoque la mort des cellules par nécrose. La nécrose va

nécessairement relarguer de l’IL-33 dans le milieu. Nous allons donc utiliser des

concentrations faibles en allergène, afin de ne pas se placer en conditions nécrotiques et

empêcher un relargage passif de l’IL-33 qui “masquerait” le relargage actif que nous

cherchons à étudier.

De plus, dans toutes nos expériences, nous réaliserons nos mesures aux alentours de 5

minutes après induction de la réaction inflammatoire allergique. De cette manière, nous

pouvons une fois de plus limiter au maximum le signal IL-33 provenant des cellules

nécrotiques. Nous nous basons sur un temps de réaction de 5 minutes, puisque c’est 5

minutes après exposition de cellules aux allergènes que Cayrol.C et al. 2018 observent les

premières protéines IL-33 relarguées dans le milieu.

17

II. Approche globale, validation du modèle

Cette première étape de notre projet est une approche globale visant à confirmer les résultats

observés dans la littérature et possiblement identifier de nouveaux partenaires jusqu’alors

jamais détectés.

Nous souhaitons ici utiliser une technique brevetée par la société « INOVIEM Scientific », le

NPOT (Nematic Protein Organisation Technique). Basée sur la théorie de l’encombrement et

de l’agrégation moléculaire de Kirkwood-Buff (Gee.MB & Smith.PE, 2009), la technique

NPOT permet la formation et l’identification de complexes macromoléculaires impliqués

dans des processus physiologiques ou pathologiques. Le NPOT permet donc l’analyse

d’interactions ligand-protéines et protéines-protéines dans des cellules, sans modifier la

conformation moléculaire native du complexe macromoléculaire étudié. Nous allons exposer

nos 2 lignées cellulaires à l’allergène A.alternata et les équipes d’INOVIEM Scientific vont

par la suite être en mesure de complexer toutes les protéines impliquées dans le relargage

d’IL-33, et de les fixer en hétéro-assemblages. Ces hétéro-assemblages sont ensuite séparés et

analysés un par un, par spectrométrie de masse.

L’utilisation de cette technique permettrait de valider l’implications des récepteurs PAR2 et

purinergiques observée dans la littérature. Snelgrove.RJ et al. démontrent en 2014 que

l’inhibition des récepteurs PAR2 et purinergiques entraînent une diminution de la quantité

d’IL-33 relarguée dans les lavages de fluides broncho-alvéolaires de souris exposées à

l’allergène A.alternata. De nombreux autres articles indiquent que l’activation de ces

récepteurs s'accompagnent d’une augmentation de la concentration extra-cellulaire d’ATP et

la production d’espèces réactives à l’oxygène. C’est ces ROS qui seraient responsables de

l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Harijith.A & Ebenezer DL, 2014). Nous espérons

donc observer l’inflammasome NLRP3 dans les hétéro-assemblages formés par la technique

NPOT. Nous espérons également observer dans les hétéro-assemblages les partenaires

impliqués dans la signalisation en aval de l’inflammasome : les cytokines IL-1β et IL-18,

ainsi que la suite de la voie : les protéines ERK1/2, la protéine responsable du décrochage

d’IL-33 et IL-33.

Figure 7 : La technique NPOT permet l’analyse de l’interactome, par formation d’un hétéro-

assemblage. (Figure tirée de Wang.L et al., 2018).

a-/ Le NPOT (Nematic Protein Organisation Technique) a été réalisé dans des conditions

stériles à 4°C. Les extraits de THP-1 (le type cellulaire de l’étude) ont étés sujets au système

NPOT de formation des hétéro-assemblages. Après l’isolation des hétéro-assemblages, ces

derniers sont placés sur des plaques 96 puits, sous la forme de gouttes d’huile minérale. Les

hétéro-assemblages sont ensuite directement analysés par spectrométrie de masse dans le

liquide formé par la goutte.

b-/ Capture d’un hétéro-assemblage dans une goutte sur une plaque 96 puits. Les hétéro-

assemblages sont entourés en pointillés (flèche rouge) sur les 3 expériences (experiment

1,2,3). Les protéines qui n'interagissent pas précipitent et se retrouvent au fond du puits, dans

les expériences 1 et 2. Le “latter” (flèche noire), dû aux vibration induites par la ventilation

de l’incubateur, apparaît sur le contour du puits dans l’expérience 3. Le contrôle (DMSO)

sans le ligand evodiamine (ligand utilisé dans cette étude) ne montre pas d’hétéro-

assemblages.

19

L’objectif principal de l’utilisation de la technique NPOT est de valider les informations

obtenues dans la littérature, cependant nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces

résultats de NPOT identifient de nouveaux partenaires impliqués dans la réaction

inflammatoire allergique et le relargage d’IL-33. On peut imaginer la découverte de

nouveaux récepteurs impliqués dans la détection de l’allergène (nous savons déjà que le

récepteur TLR4 joue un rôle dans la détection de l’allergène mais nous nous sommes

focalisés sur l’effet des protéases d’allergènes et non l’allergène dans son entièreté) et/ou de

nouveaux partenaires protéiques dans la voies de signalisation menant au relargage d’IL-33

dans le milieu extracellulaire.

Brièvement, des lysats cellulaires de HMEC-1 et HBEC3-KT seront préparés par des cycles

de congélation puis décongélation, en l’absence de détergents, d’agents réducteurs et

d’inhibiteurs de phosphatases et protéases. Ces lysats cellulaires seront ensuite incubés avec

l’allergène A.alternata (5 minutes). Un système de microdialyse avec gradient de pH

permettra la formation des hétéro-assemblages. Les hétéro-assemblages seront isolés dans

l’huile minérale, séparés par microdissection sous microscope, lavés à l’acétone avant d’être

solubilisés dans une solution HBSS (hepes buffer saline solution). Les hétéro-assemblages

solubilisés seront ensuite analysés par spectrométrie de masse (ESI-QTOF-MS/MS). La

société INOVIEM possède ses propres logiciels et bases de données pour l’identification des

différentes protéines présentes dans les hétéro-assemblages. Leur technologie leur permet

donc de déterminer avec fiabilité les probabilités d’interactions protéine-protéine et protéine-

ligand pour un tissu ou une lignée cellulaire spécifique et comparer ces données bio-

informatiques avec les résultats récoltés en spectrométrie de masse (Figure 7).

Nous sommes confiants concernant l’efficacité de cette technique et pensons qu’elle

représente un bon point de départ pour notre projet.

21

III. Etude du rôle des récepteurs PAR2 et purinergiques

Notre objectif ici est de vérifier l’implication des récepteurs dans la réaction inflammatoire

allergique observée dans la littérature et de suivre les résultats obtenus par la technique

NPOT.

L’implication du récepteur PAR2 et purinergiques dans la reconnaissance des allergènes est

avérée dans la littérature. (Snelgrove.RJ et al., 2014) (Müller.T et al., 2010) L’étude de

l’inhibition des deux familles de récepteurs (PAR et purinergiques) en même temps n’a

jamais été étudiée cependant.

Nous pensons observer une diminution de la quantité d’IL-33 dans le milieu extracellulaire

de cellules stimulées par A.alternata après inhibition de PAR2, idem après inhibition de P2Y2

et P2X7, ainsi qu’une diminution encore plus importante lorsque les récepteurs sont tous

inhibés.

Nous utiliserons ici un inhibiteur de l’activité de PAR2 : AEBSF, (fluorure de 4-(2-

aminoéthyl)benzènesulfonyle) qui est un inhibiteur hydrosoluble irréversible des protéases à

sérine. L’efficacité de l’AEBSF a déjà été démontrée sur des modèles murins wild type et

ST2-/- (récepteur spécifique d’IL-33). Une pré-incubation d’A.alternata avec AEBSF avant

d’induire la réaction inflammatoire allergique sur des souris diminuait la quantité d’IL-33

relarguée dans les fluides broncho-alvéolaires des souris (Snelgrove.RJ et al. 2014). Nous

souhaitons ici examiner l’effet de cet inhibiteur sur des cellules humaines.

Nous comptons également utiliser un inhibiteur des récepteurs purinergiques P2Y et P2X : la

suramine. Utilisée premièrement pour traiter la maladie du sommeil, puis comme un

anticancéreux et un antiviral pour ses propriétés inhibitrices de la transcriptase inverse, la

suramine est également un antagoniste des récepteurs purinergiques. Elle bloque la

signalisation entrainée par les récepteurs P2X et P2Y (Hoyle CH. et al., 1990) . Nous nous

attendons donc à :

- une inhibition de la hausse de concentration d’ATP extracellulaire

- une inhibition de la production de ROS

- une diminution de la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants des cellules

lorsque nous traitons les cellules avec la suramine avant d’induire la réaction inflammatoire

allergique par A.alternata.

23

La quantité d’IL-33 dans les surnageants de HMEC-1 et HBEC3-KT sera mesurée par test

ELISA (anticorps anti IL-33, anticorps secondaire AlexaFluor 488) après stimulation par

A.Alternata (5 minutes)(contrôle), par A.alternata incubé avec AEBSF, par A.alternata

incubé avec la suramine,puis par A.alternata incubé avec AEBSF et la suramine. Nous

pouvons également quantifier l’ATP extracellulaire, la quantité de Ca2+ et K+ extracellulaire

et la quantité de ROS.

25

IV. Etude du rôle de l’inflammasome dans le relargage d’IL-33

Dans leur article, Gicquel et al., montrent le mécanisme d’activation de l'inflammasome

NLRP3, acteur du relargage actif de l’alarmine HMGB1 et qui de ce fait représente un acteur

potentiel du relargage d’IL-33. L’'inflammasome NLRP3 a été décrit comme pouvant être

activé par différentes voies, il a en effet été montré que l’inflammasome pouvait être activé

par un efflux de potassium K+ et une production de ROS en réponse à l’augmentation de

l’ATP dans le milieux extracellulaire après induction d’un stress. (Harijith.A et al., 2014)

L’inflammasome est potentiellement le centre de notre mécanisme car il peut répondre aux

signaux induit par les récepteurs membranaires PAR2, P2Y2 et P2X7 et permettre d’induire le

relargage d’IL-33 par l’activation de la caspase-1 et de la Gasdermine D dans un contexte

d’inflammation allergique.

Lors de nos manipulations, nous nous attendons à observer plusieurs choses :

- qu’en présence d’un inhibiteur de l’inflammasome et de l'allergène A.Alternata, nos

cellules ne relarguent pas d’IL-33.

- qu’en absence d'inhibiteur de l’inflammasome et en présence de l’allergène

A.Alternata, nos cellules relarguent IL-33.

Au vu de ses résultats nous pourrions avancer que l’inflammasome NLRP3 joue un rôle dans

le relargage d’IL-33.

Pour montrer que l’inflammasome NLRP3 est impliqué dans ce mécanisme de relargage,

nous allons utiliser les deux lignées cellulaires décrites précédemment : HMEC-1 et HBEC3-

KT. Pour inhiber l’activation de l’inflammasome, nous utiliserons MCC950. Le MCC950

(InvivoGen), est un inhibiteur puissant et sélectif de l’inflammasome NLRP3. Il va bloquer

l’activation d’IL-1β induite par les activateurs de l’inflammasome, tel que l’ATP, en

empêchant l’oligomérisation de la protéine adaptatrice de l’inflammasome : ASC. Nous

avons aussi choisi cet anticorps car il n’inhibe pas les autres inflammasomes (AIM2, NLRC4

et NLRP1) ce qui permettrai d’éviter les faux positifs ou négatifs.

27

Pour les manipulations nous réaliserons plusieurs conditions. Tout d’abord il nous faudra un

contrôle négatif, c’est à dire sans relargage d’IL-33. Pour cela, il faut cultiver nos cellules

HMEC-1 et HBEC3-KT dans des conditions de cultures normales et récupérer le milieu

extracellulaire de la même manière que pour nos tests précédents. Comme contrôle positif,

nous montrerons qu’il y a un relargage d’IL-33 lorsque les cellules sont exposées à

A.alternata.

Pour notre test, nous mettrons en présence nos cellules avec l’allergène ainsi qu’avec notre

inhibiteur de l’inflammasome NLRP3. Les cellules seront cultivées normalement et mise en

présence de l’inhibiteur et de l’allergène pendant 5 min, puis nous récupérerons le milieu

extracellulaire.

Les quantités d’IL-33 dans les surnageants des cellules seront évaluées par test ELISA. Nous

évaluerons également la quantité d’IL-1β présente dans les surnageants, également par test

ELISA.

29

V. Etude du rôle d’IL-1β et de la voie des MAPK dans le relargage d’IL-33

Nous souhaitons ici vérifier l’implication de la cytokine IL-1β et de la voie des MAPK dans

le relargage d’IL-33.

Dans leur article, Hayakawa.K et al., 2010 démontrent que l’activation d’IL-1β par

l’inflammasome NLRP3 induit une augmentation du nombre de protéines ERK1/2

phosphorylées par rapport au nombre de ERK1/2 total. Cette stimulation de la voie des

MAPK induit par la suite une augmentation du taux d’expression de la protéine XPO1, une

exportine jouant un rôle dans le relargage actif de l’alarmine HMGB1. Cette étude est

réalisée dans des astrocytes primaires de rats.

Du fait des similitudes entre HMGB1 et IL-33, notre objectif est de vérifier si cette

signalisation inflammasome NLRP3/IL-1β/MAPK intervient dans les cellules épithéliales et

endothéliales (ce qui constitue un modèle cellulaire différent de cellules d’astrocytes

primaires) lors de la reconnaissance d’un allergène, et participe au relargage actif d’IL-33.

Nous disposons ici d’une solution de protéines IL-1β recombinantes, d’un inhibiteur des

protéines ERK1/2 : U0126, et d’anticorps spécifiques des protéines ERK1/2 phosphorylées et

ERK1/2. Nous souhaitons ici traiter nos deux lignées cellulaires avec une solution de

protéines IL-1β recombinantes, et observer si la quantité de protéines ERK1/2 phosphorylées

augmente avec l’augmentation de la quantité d’IL-1β dans le milieu. Nous évaluerons

également la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants de cellules traitées par

l’inhibiteur U0126 (inhibiteur des protéines ERK1/2).

Brièvement, nos expériences pour cette partie du projet seront :

- Un dosage de la quantité de protéines ERK1/2 phosphorylées par rapport à la quantité

de ERK1/2 totales par western blot sur des lysats de cellules non traitées, et un dosage

de la quantité d’IL-33 par ELISA sur les surnageants de cellules non traitées comme

contrôle négatif.

- Les mêmes expériences sur des cellules après 24h d’incubation avec une solution

d’IL-1β recombinante. Différentes concentrations d’IL-1β seront testées.

- Les mêmes expériences sur des cellules après 24h d’incubation avec une solution

d’IL-1β et d’inhibiteur U0126. Différentes concentrations d’IL-1β et U0126 seront

testées.

31

Nous disposerons d’anticorps Anti-Phospho-p44/42 MAPK (ERK 1/2) pour ERK

phosphorylée (Cell Signaling technology), Anti-MAPK (ERK 1/2) pour ERK1/2 non

phosphorylée (Cell Signaling technology)

En présence d’IL-1β, nous nous attendons à une augmentation de la quantité d’IL-33

relarguée dans le milieu et une augmentation de la quantité de protéines ERK1/2

phosphorylées par rapport à la quantité d’ERK 1/2 totale. L’inhibition de la voie des MAPK

devrait diminuer le relargage d’IL-33 dans les surnageants de nos cellules.

33

VI. Recherche de modifications post-traductionnelles sur l’IL-33 relarguée

L’alarmine HMGB1 peut subir plusieurs modifications post-traductionnelles (MPT). Ces

modifications semblent avoir un rôle important sur la localisation de HMGB1 et de ce fait

pour son déplacement du noyau vers le cytoplasme (Kang.R et al., 2014). Dans notre étude,

une des hypothèses possibles serait que ces modifications post-traductionnelles interviennent

dans le décrochage d’IL-33 de la chromatine et donc par la suite, à son relargage du noyau au

cytoplasme.

HMGB1 peut subir plusieurs MPT :

- une hyper-acétylation, en réponse à divers stimuli tels que l’exposition à IL-1β ou le

LPS, nécessaire à son export du noyau.

- une ADP-ribosylation nécessaire à son export nucléaire dans la nécrose

- une méthylation nécessaire à sa sortie du noyau dans les neutrophiles

- une phosphorylation de ses résidus sérine dans ses séquences NLS (nuclear

localization sequence) qui affecte son affinité de liaison à l’ADN.

Enfin un des acteurs du transport d’HMGB1 pourrait être son état redox. L’HMGB1 humaine

contient trois cystéines (positions 23, 45 et 106), la cystéine 106 est nécessaire pour la

localisation dans le noyau, car la mutation de C106, mais pas les mutations C23 et C45,

favorise la translocation de HMGB1 du noyau au cytosol. (Bonaldi.T, 2003) (Janko.C et al.,

2014)

Au vu de ces résultats et des similitudes existant entre HMGB1 et IL-33, notre objectif est

d’identifier si IL-33 possède des MPT qui interviendrait dans sa relocalisation vers le

cytoplasme. Nous nous attendons à identifier des MPT du même type que celles trouvées

pour HMGB1 dans la littérature.

Pour étudier la possibilité de MPT, nous souhaitons réaliser des analyses de spectrométrie de

masse. Nous exposerons nos cellules à A.Alternata et récupéreront le surnageant. Nous

purifierons l’IL-33, puis l’analyserons par HPLC-ESI-TQMS. Nous allons pouvoir comparer

la masse d’IL-33 connue dans les banques de données à celle obtenue par MS. Un incrément

de masse nous donnera une indication sur la présence et sur le type de MPT. Par la suite, nous

pouvons effectuer des expériences de MS/MS ce qui va nous permettre de confirmer le type

de MPT et surtout d’identifier sur quel résidu à lieu la MPT.

35

Une fois la MPT identifiée, nous pouvons réaliser une analyse bio-informatique. L’objectif

est ici d’identifier quelles protéines nucléaires sont susceptibles de réaliser la MPT identifiée

sur notre alarmine. De plus, si nous parvenons à identifier le site de la MPT, nous pourrons

augmenter la spécificité de notre crible en ne sélectionnant que les protéines pouvant réaliser

la MPT sur ce site précis.

37

VII. Recherche d’une protéine impliquée directement dans l’export d’IL-

33 du noyau

Notre objectif suivant est d'identifier la protéine responsable du transport d’IL-33 du noyau

vers le cytoplasme. Le candidat le plus probable pour la translocation d’IL-33 du noyau vers

le cytoplasme est la protéine XPO1. Cette protéine fait partie de la famille des exportines. Ce

sont des protéines nucléaires impliquées dans le transport protéique actif de macromolécules

de taille supérieure à environ 50 kDa. (Aggarwal.A & Agrawal.DK, 2014).

Les partenaires impliqués dans la translocation d’IL-33 sont à ce jour inconnus. XPO1 est

responsable de l’export de l’alarmine HMGB1 du noyau vers le cytoplasme. L’exportine

XPO1 reconnaît une séquence d’export nucléaire (NES) riche en Leucine, présente sur

certaines protéines nucléaires. XPO1 va permettre leur passage à travers la membrane

nucléaire jusqu’au cytoplasme. Il nous semble donc possible que XPO1 puisse également être

responsable de la translocation d’IL-33, du fait des nombreuses similarités trouvées entre les

deux alarmines.

XPO1 étant responsable du transport de nombreuses protéines pro-tumorales (ex : p53)

(Gandhi.UH et al., 2018), de nombreux inhibiteurs de cette protéine ont été synthétisés dans

l’optique de créer un nouveau médicament anti-cancéreux. Parmi eux, on retrouve la

leptomycine B (Kudo.N et al., 1999) ou encore le selinexor (KPT-330), actuellement en tests

de phase II pour une autorisation de mise sur le marché pour traiter la leucémie aiguë

myéloïde.

Nous souhaitons observer l’effet de la leptomycine B et du selinexor sur le relargage d’IL-33

dans nos deux modèles cellulaires. Si XPO1 joue un rôle dans le relargage d’IL-33, nous

nous attendons à une diminution de la quantité d’IL-33 relarguée dans les surnageants de nos

cellules HMEC-1 et HBEC3-KT.

Brièvement :

- notre contrôle négatif sera un dosage d’IL-33 sur les surnageants de cellules non

traitées

- notre contrôle positif sera un dosage d’IL-33 sur des cellules exposées à A.Alternata

- notre test sera effectué sur des cellules traitées par la leptomycine B ou le selinexor et

A.Alternata

La quantité d’IL-33 dans les surnageants des cellules sera déterminée par test ELISA, avec un

anticorps anti-IL-33 comme anticorps primaire, et un anticorps AlexaFluor 488 (conjugué à

un fluorophore) comme anticorps secondaire.

39

Cependant, nous ne pouvons pas exclure que d’autre protéines soient impliquées dans la

translocation d’IL-33. Les candidats les plus probables autres que XPO1 sont les autres

protéines appartenant à la famille des exportines, soit XPO2, XPOT, XPO4, XPO5, XPO6 et

XPO7. Nous pouvons exclure XPO5, XPO6 et XPOt qui ne transfèrent pas des protéines et

XPO2 qui sert à l’export de l’importine-α, une fois que celle-ci a relarguée sa protéine cargo

dans le noyau. (Kutay et al, 1997). Les candidats les plus probables pour l’export d’IL-33

sont XPO4 et XPO7. Ces deux protéines sont également responsables du transport de

protéines hors du noyau (Aksu.M et al., 2016) (Mingot.JM et al., 2004) mais leur spécificité

n’est à ce jour pas définie.

Nous souhaitons observer si ces deux protéines ont un rôle dans le relargage d’IL-33. Il

n’existe aucun inhibiteur de XPO4 et XPO7 sur le marché, nous souhaitons donc réaliser des

expériences de Knockdown sur ces deux protéines. Les gènes xpo4 et xpo7 sont connus, nous

souhaitons donc diminuer l’expression de ces deux protéines en utilisant des siRNA dirigés

contre les ARNm de ces deux protéines.

Brièvement, nous réaliserons deux jeux de siRNA, un pour chaque protéine. Chaque jeu sera

composé de 3 siRNA : deux qui ciblent la protéine, et un siRNA “untargeted”. L’efficacité de

nos siRNA sera déterminée par RT-qPCR. Enfin, pour tester le rôle de XPO4 et XPO7 sur le

relargage d’IL-33, nous réaliserons les mêmes expériences que celles réalisées précédemment

pour XPO1, à savoir :

- un contrôle négatif : dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules

non traitées

- un contrôle positif : dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules

traitées par A.Alternata

- dosage de la quantité d’IL-33 dans les surnageants de cellules transfectées par un jeu

de siRNA puis traitées par A.Alternata

Nous pouvons également doser la quantité d’IL-33 relarguée lorsque nous faisons agir les

deux jeux de siRNA en même temps. Si nous observons une diminution encore plus

importante qu’avec un seul jeu de siRNA, cela signifiera que les deux exportines jouent un

rôle dans le relargage d’IL-33.

41

Conclusion / perspectives

La réaction inflammatoire allergique joue un rôle dominant dans les pathologies allergiques

telles que l’asthme. Cette dernière est une maladie inflammatoire chronique qui touche plus

de 235 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent pour atténuer

les symptômes de la maladie ou pour calmer une crise mais il n’existe à ce jour aucun

traitement permettant d’éliminer complètement la pathologie.

L’identification de tout l’interactome dans la réaction inflammatoire allergique pourrait

mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des maladies

inflammatoires, et à terme permettre l’élaboration de traitements efficaces contre ces

pathologies.

Nous espérons déterminer tous les intervenants dans la réaction inflammatoire allergique

médiée par les protéases d’allergènes. Notre projet s’articule sur 4 grands axes : une première

approche globale nous permettant de vérifier nos hypothèses et potentiellement identifier de

nouveaux intervenants dans la voie ; la validation de l’implication des récepteurs PAR2 et

purinergiques dans la reconnaissance des protéases d’allergène et l’activation de

l’inflammasome ; l’effet de l’inflammasome sur la voie des MAPK et le relargage d’IL-33 ;

l’identification de la protéine responsable du décrochage d’IL-33 de la chromatine et de son

export du noyau vers le cytoplasme.

Si nos résultats s’avèrent être en conformité avec nos observations préliminaires, il restera

cependant à déterminer les modalités de sortie d’IL-33 du cytoplasme. D’après notre voie de

signalisation hypothétique, l’IL-33 libérée du noyau sort de la cellule par des pores

membranaires formés par la Gasdermine D. Pour visualiser ce phénomène, nous pouvons

imaginer réaliser des expériences d’imagerie de fluorescence, en utilisant la technique de

microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF)(ou microscopie à onde

évanescente). Cette technique permet d’examiner très précisément une tranche très fine d’un

échantillon (200nm). Nous pensons que cette technique peut être utilisée dans une expérience

de double marquage, la Gasdermine D marquée et l’IL-33. Il serait alors techniquement

possible de déclencher la réaction inflammatoire allergique et d’observer en microscopie

TIRF l’internalisation d’IL-33 dans les vésicules tapissées de Gasdermine D et l’exocytose de

ces vésicules. Ces observations valideraient une fois de plus notre modèle, en indiquant que

l’inflammasome NLRP3 est à la fois impliqué dans le décrochage d’IL-33 par la stimulation

43

de la voie des MAPK et à la fois impliqué dans son relargage par le clivage et l’activation de

la Gasdermine D.

D’un autre côté, si nous parvenons à identifier les partenaires protéiques pouvant être

impliqués dans le décrochage de la chromatine et la sortie du noyau d’IL-33, il conviendra de

confirmer ces résultats. Nous pouvons imaginer réaliser des expériences de co-

immunoprécipitation d’IL-33 et de ces protéines. Toutes les expériences de notre projet de

recherche sont réalisées in vitro, aussi si nos résultats s’avèrent prometteurs, nous pouvons

également imaginer une reproduction des manipulations effectuées ici sur des modèles

murins, pour valider notre modèle in vivo.

Ce projet s’oriente donc principalement sur l’élucidation du mécanisme de relargage de l’IL-

33 et sur l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, avec à terme l’objectif de

développer de nouveaux médicaments pour traiter l’asthme et les réactions inflammatoires

allergiques.

45

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