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Intérêts du dosage des
métabolites de la Vitamine D
C. Le Goff, EuSpLM, Chimie Clinique, CHU de Liège, Belgique
21/09/2018
Corata 2018, Rouen
Plan
Métabolisme
25 OHD
La spectrométrie de masse
QCExt
Standardisation
24,25(OH)2D et 4β-25(OH)2D
Epimère C3
1-25 (OH)2D
Vit D Libre
Conclusion
Intérêts cliniques
Analytique
Cas cliniques
25 OH Vitamine D
Phase de préparation • Dû à sa lipophilicité, quelle que soit la méthode
de dosage adoptée, une étape de dissociation complète de la 25(OH)D des protéines porteuses est nécessaire pour pouvoir la quantifier avec exactitude
• Différentes concentrations selon les conditions : Physiologiques :
la grossesse l’ethnie
Pathologiques: IR Hépatique
La course
influencer la cinétique de dissociation de la molécule
Phase analytique
Suppléments vitaminiques D : D2 et D3
Dosages des 2 formes hydroxylées indistinctement sous peine de minimiser les résultats obtenus chez une personne supplémentée en vitamine D2 résolu
Pouvoir distinguer l’épimère C3 de la 25(OH)D et la 24,25(OH)2D, qui peuvent être présents dans le sérum des patients à différentes concentrations et amener une surestimation des résultats pas encore résolu
La spectrométrie de masse
• Eisman et al.puis Jones CLHP + spectrophotométrie UV =première méthode de dosage
• Watson et al. méthode de dosage de la 25(OH)D sérique par CLHP couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS)
La spectrométrie de masse • En 2004, Vogeser et al. méthode basée sur la CLHP
couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)
• Selon le relevé de juillet 2017 du programme de contrôle de qualité international DEQAS ((Vitamin D External Quality Assessment Scheme, www.deqas.org) (141/775)18% des participants l’utilisent.
• Avantage: – pouvoir mesurer précisément les différentes formes de
25(OH)D et potentiellement les autres métabolites de la vitamine D [en particulier la 24,25(OH)2D].
– théoriquement pas tributaire des conditions imposées par les producteurs de trousse, bien que des méthodes commerciales “clés en main” soient disponibles.
Les pièges de la LC-MS/MS
• Les étapes d’extraction, de pré-chromatographie et de chromatographie=négligées
• Idée préconçue de la grande sélectivité des détecteurs de spectromètres de masse compenser le manque de préparation
Avec notre méthode LC-MS/MS
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Time, min
0.0
1000.0
4000.0
7000.0
1.0e4
1.3e4
1.6e4
1.9e4
2.2e4
2.5e4 In
tensity,
cp
s
SI D3 SI EPI D3
D2 quant(gris) et qual(bleu)
D3 quant(vert) et qual(rouge)
Epi D3 quant(vert) et qual(rouge)
EPI D2
Standardisation • Office of Dietary
Supplements, du National Institutes of Health (NIH) Américain
• CDC (Center for Disease Control and Prevention) à Atlanta
• NIST (National Institute of Standards and Technology)
• Laboratoire de référence pour la Vitamine D de l’Université de Gand
ont unis leurs expertises
pour développer un programme de standardisation.
Standardisation
• NIST le matériau de référence standardisé SRM 972(CRM)
4 concentrations certifiées différentes de 25(OH)D3 et 25(OH)D2 et 1 concentration certifiée de C3-épi-25(OH)D3
Standardisation
• NIST le matériau de référence standardisé SRM 972
SRM 972a
4 concentrations certifiées différentes de 25(OH)D3 et 25(OH)D2 et 1 concentration certifiée de C3-épi-25(OH)D3
Standardisation
• NIST le matériau de référence standardisé SRM 972
SRM 972a
SRM 2973
4 concentrations certifiées différentes de 25(OH)D3 et 25(OH)D2 et 1 concentration certifiée de C3-épi-25(OH)D3 + 24,25(OH)2D
CDC Vitamin D Standardization-Certification Program(VDSCP)
• La calibration et la validation des concentrations des 25(OH)D3 et 25(OH)D2 dans 40 sera déterminées par LC-MS/MS à l’Université de Gand(VDSP).
• Les utilisateurs de LC-MS/MS et les fabricants d’immuno-dosages ont pu recalibrer, sur base volontaire, leurs méthodes par rapport à ces résultats.
• 4 enquêtes/an- 10 sera
24,25(OH)2D
Produit majeur du catabolisme de la 25(OH)D
Concentrations corrélées à la 25(OH)D chez les sujets en bonne santé
Dépend de la concentration en 25(OH)D et de l’expression de CYP24A1
Statut VitD via le VMR
24,25(OH)2D
Intérêt:
• Cas d’hypercalcémie PTH-indépendante due à une perte de fonction de la 24-hydroxylase (CYP24A1) (Schlingmann et al.2011)
Rapport 25-OH-D3 sur 24,25-(OH)2D3= VMR
24,25(OH)2D Intérêt du VMR
Clinical Utility of Simultaneous Quantitation of 25-Hydroxyvitamin D and 24,25-Dihydroxyvitamin D by LC-MS/MS Involving Derivatization With DMEQ-TAD M.Kaufmann, J. et al, JCEM,2014 p2571
25 years old pregnant female, asymptomatic.
Supplemented weekly by 25.000 IU VTD
Calcium 3.0 mmol/L (RR: 2.15-2.60 mmol/L)
PTH 6 pg/mL (RR: 15-65 pg/mL)
25(OH)D (IA) 39 ng/mL (RR: 30-60 ng/mL)
1,25(OH)2D (IA) 187 pg/mL (RR: 20-79 pg/mL)
Clinical Case
25 years old pregnant female, asymptomatic.
Supplemented weekly by 25.000 IU VTD
Calcium 3.0 mmol/L (RR: 2.15-2.60 mmol/L)
PTH 6 pg/mL (RR: 15-65 pg/mL)
25(OH)D (IA) 39 ng/mL (RR: 30-60 ng/mL)
1,25(OH)2D (IA) 187 pg/mL (RR: 20-79 pg/mL)
Clinical Case
Causes of this non parahtyroid-linked hypercalcemia? Cancer? Vitamin D intoxication? Sarcoidosis? Tuberculosis? Other?
Extra-investigations by LCMS/MS:
25(OH)D3 73 ng/mL
24,25(OH)2D 1.1 ng/mL
VMR 66 (normal <50)
Clinical Case
Screen positive for CYP24A1 deficiency, confirmed genetically
4β, 25(OH)2D • Métabolite de l’action du CYP3A4
• Dégradation de la 25(OH)D3 via rifampicine
in JCEM, 2017
4β, 25(OH)2D Clinical cases
in JCEM, 2017
C3 épimère Concentration élevée chez le nouveau né
absence maturation hépatique
Intérêt: Liaison au VDR- 2-3%- effet sur PTH et
ostéocalcine
1 α,25(OH)2D • Rôles physiologiques:
Homéostasie phosphocalcique en augmentant l’absorption intestinale de Ca, la résorption osseuse et la réabsorption tubulaire rénale de Ca
• Intérêts: pour expliquer une hypercalcémie non parathyroïdienne (sarcoïdose ou
granulomatose)
pour différentier les cas de rachitismes hériditaires dans lesquels la 25-OHD-1 α -hydroxylase et le VDR peuvent être inactifs
à des fins de recherche clinique
• Dosages:
LC-MS/MS
RIA-IA
25(OH)D dans la circulation
Free 25(OH)D
25(OH)D bound to Albumin
25(OH)D bound to VDBP
Bioavailable 25(OH)D
<1% of total 25(OH)D
10-15% of total 25(OH)D
85-90% of total 25(OH)D
Détermination
DiaSource ELISA
Calculation according to Vermeulen formula
CALCULATED FREE 25OH-D (pg/ml) total 25OH-D / (1+ (6 x 103 x albumin) + (7 x 108 x VDBP)) (Powe et al, JBMR 2011)
R&D Elisa Immunoassay or LCMS
Rene F. Chun , Bradford E. Peercy , Eric S. Orwoll , Carrie M. Nielson , John S. Adams , Martin Hewison
Vitamin D and DBP: The free hormone hypothesis revisited
The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2013
Rene F. Chun , Bradford E. Peercy , Eric S. Orwoll , Carrie M. Nielson , John S. Adams , Martin Hewison
Vitamin D and DBP: The free hormone hypothesis revisited
The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2013
Recommandations La concentration sérique de 25OHD représente les réserves en vitamine D.
-une concentration de 25OHD >20 ng/mL (<60 ng/mL) pour la population générale
-une concentration de 25OHD>30 ng/mL (<60 ng/mL) chez les ostéoporotiques, IRC, malabsorptions etc…
Pour ces patients, suivre les protocoles de supplémentation – après dosage de la 25OHD
– Privilégier les doses les moins fortes et les moins espacées possibles
– Espérer des formes pharmaceutiques de vitamine D adaptées à une supplémentation journalière
En population générale:
- Si pas de facteur de risque de déficit en vitamine D, favoriser l’exposition solaire (raisonnée) et l’alimentation (produits riches en vitamine D et aliments « fortifiés » .
- Si facteur(s) de risque de déficit en vitamine D ajouter une supplémentation médicamenteuse.
- Supplémenter tout le monde l’hiver?
Take Home Message 24-25(OH)2D= dans les cas d’hypercalcémie infantile,
hypercalcémie avec IR, néphrocalcinose, nephrolitiase… Comment? en LCMS/MS
C3 épimère = chez les nouveau-nés si D3 très élevée et pas de séparation Comment? en LCMS/MS
1 α,25(OH)2D =pour expliquer une hypercalcémie non parathyroïdienne (sarcoïdose ou granulomatoses),pour différentier les cas de rachitismes hériditaires dans lesquels la 25-OHD-1 α -hydroxylase et le VDR peuvent être inactifs ou à des fins de recherche clinique Comment? RIA, IA ou LCMSMS
25OHD= ….. Ce n’est pas parce que je travaille en LC-MS/MS que je
travaille bien!
Rev Endocr Metab Disord (2013) 14:159–184
![21-SESSION 4 P2 Microbiote [Mode de compatibilité] · Inventaire fonctionnel : Activités enzymatiques / motifs / métabolites peptides anti-microbiens / ATB-R … Susceptible de](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/5f09a4e27e708231d427d2d2/21-session-4-p2-microbiote-mode-de-compatibilit-inventaire-fonctionnel-activits.jpg)
