Le transfert résonnant d’énergie par mesure des temps de vie

(FRET/FLIM) et ses applications pour l’étude des interactions

moléculaires.

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Marion-Anne BARRE L3 ENS biologie moléculaire et cellulaire

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Principe du FRET résolu en temps par FLIM

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En plus

En plus

Comparaison : déclins des différents fluorophores

En plus

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Applications

Etudes d’interactions intermoléculaires

Etudes d’interactions intramoléculaires

• Dimérisation de protéines

• Changements conformationnels de protéines et repliement

• Biosenseurs : applications à l’étude d’activités enzymatiques, à la détermination de concentration d’ions (Ca²+ ) ou de métabolites (AMPc)

• Protéine/Protéine

• Protéine/ADN

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• Choix de la statégie

• Etude de la colocalisation des protéines d’intérêt en microscopie confocale

• Choix de la place de l’étiquette fluorescente

• Tester l’effet de l’ajout de l’étiquette fluorescente

• Etude de leur interaction éventuelle par FRET

Démarche expérimentale et matériel

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Exemple de courbes de déclin de fluorescence

Attention! Échelle en 10-1 ns et non en ns!!

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Exemples d’images obtenues par mesure du temps de vie de fluorescence dans une cellule au confocal

référence

Donneur + accepteur

Mutant : contrôle négatif (perte d’interaction)

Photoblanchiment

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• Complexité de la mise en œuvre (appareillage, manipulations pour fusion…)• Les résultats négatifs ne permettent pas d’affirmer que les molécules d’intérêt

n’interagissent pas• Cette technique suppose un niveau d’expression élevé des molécules d’intérêt, ce qui

peut perturber leur fonction et/ou la réponse cellulaire

Discussion avantages inconvénients• La durée de vie de fluorescence est indépendante de la concentration• Les fluorophores ont des temps de vie différents (permet de discriminer deux

fluorophores qui ont des spectres très proches, chevauchants contraitement au FRET steady state)

• Dépendant de l’environnement du fluorophore ( intéressant pour ex biosenseurs in vivo)

• Permet de limiter les artéfacts dû à l’autofluorescence (FAUX)• Accès à différentes informations :

- Proportion des molécules en interaction- Efficacité de transfert- En mode image : cartographie des interactions

• Etude dynamique possible