Aspects cellulaires et moléculaires du développement précoce chez l'amphibien.Cours 2

Rappels :Les cellules de l'embryon en segmentation sont déterminées → stade blastula et expérience de Nieuwkoop (1980).

Conclusion : les cellules qui paraissent identiques ont déjà des destinées différentes au stade blastula, il y a eu une induction vers des voies de différenciation.

Description de la voie permettant la différenciation des cellules :

Exemple : les blastomères végétatifs envoient une information (facteurs d'induction) vers des micromères de la zone marginale, ce qui induit le mésoderme. (expérience de Dale et Slack)

→ les cultures de blastomères isolés mettent en évidence un processus d'induction.Sur une blastula complète, les blastomères dorso-végétatifs forment un centre inducteur, le centre de Nieuwkoop. Les cellules de la zone marginale dorsale (ZMD) répondent à des facteurs diffusibles et constituent le centre de Spemann, centre de la dorsalisation de l'embryon, grâce auquel celui-ci possèdera une latéralité et un axe dorso-ventral. Le centre de Spemann donnera du mésoderme dorsal.Le centre de Nieuwkoop est en fait le centre inducteur de la dorsalisation des cellules composant le

centre de Spemann, lequel sera le centre inducteur des phénomènes de dorsalisation proprement dits.

Identification et quantification des molécules impliquées :

On va alors rechercher quelles sont les molécules qui participent à l'induction du mésoderme.

Par différentes techniques :

DETECTION : # des ARN par hybridation in situ ( repérage des ARN d'intérêt grâce à des sondes d'ARN spécifiques des ARN d'intérêt, radiomarquées ou fluorescentes).

# des protéines par immunolocalisation ( repérage dans l'embryon par fixation d'anticorps spécifiques de la protéine d'intérêt, radiomarqués ou couplés à un fluorochrome).

QUANTIFICATION : # des ARN par Northern Blot.

# des protéines par Western Blot.

Identification de l'action des molécules repérées par les techniques précédentes :

Dissection d'une portion de l'embryon (ici le toit de la blastula), puis incubation avec la molécule à tester.On observe ensuite le devenir des cellules au contact de la molécule inductrice que l'on teste, par analyse histologique des cellules :

– Nature des structures induites : mésoderme/ectoderme, ventral/dorsal...– Recherche des marqueurs dorsaux ou ventraux qui sont apparus dans ces cellules.

Injection dans un blastomère végétatif de la région ventrale d'un ARNm codant pour une protéine à tester.On cherche à connaître l'action ventralisante ou dorsalisante de la protéine que l'on teste.Si celle-ci a une action dorsalisante, on aura l'apparition d'un axe embryonnaire « dorsal » surnuméraire au niveau du blastomère végétatif modifié, avec formation de deux tube neuraux, de deux têtes,...

Autre test possible in vivo : 1. Irradiation du pôle végétatif par des rayons UV, entrainant la destruction des capacités

d'induction des macromères. Résultat : absence de centre de Spemann et donc de structures dorsales → embryon ventralisé.

2. Injection de l'ARNm d'un inducteur potentiel dans la blastula (protéine à tester).Est ce qu'il y a restauration des structures dorsales? Une restauration partielle, totale?

(Dans le test in vivo 1, il faut que les cellules ventrales soient en plus compétentes, c'est à dire qu'elles soient capables de répondre aux signaux de la molécules inductrice. Dans la deuxième expérience on sait déjà que les cellules sont compétente pour répondre aux signaux dorsalisants, puisque c'est leur devenir normal.)

Identification de facteurs de croissance :

On va surtout s'intéresser aux familles des FGF (Fibroblast Growth Factor) et des TGFβ (Transforming Growth Factor).Les facteurs de croissance sont des peptides de masse moléculaire comprise en tre 15 et 35kDa.Chez l'adulte, ils influencent la prolifération cellulaire (action majoritaire) et la différenciation, en fonction de l'équilibre entre les différents facteurs de croissance qui agissent sur la cellule.Chez l'embryon, ils ont un rôle important dans l'induction embryonnaire, mais aussi dans la prolifération et la différenciation.

Les FGF :

Chez l'amphibien, on a identifié au moins 4 FGF différents, localisés dans les blastomères végétatifs.

Les TGFβ :

Les TGFβ sont-ils des inducteurs du mésoderme? Quels membres de la famille sont impliqués?

L'activine A active les smad 1et 2L'activine d'après cette expérience serait un bon candidat, mais, in vivo, ce messager s'exprime après la transition blastuléenne, et l'effet dorsalisant est dépendant de la dose ( à petite dose, ce facteur a un effet ventralisant!).

Conclusion : il existe d'autres facteurs plus précoces. Il faut une molécule inductrice et présente au moment de la transition blastuléenne.

Vg1 est présent dans l'ovocyte II sous forme inactive (propeptide inactif) et concentré au pôle végétatif.Il y a une activation de cette molécule suite à la réaction corticale et à l'activation d'une protéase.

Vg1 est détectée dans la future région dorsale après la fécondation.

Ensuite au cours de la segmentation, il y a une répartition différentielle des constituants dans les blastomères en fonction de leur localisation. L'ARNm de Vg1 est enrichi dans les blastomères végétatifs dorsaux. Il y a donc toujours ma même localisation de Vg1 au cours du développement.

On observe de plus la formation d'un axe embryonnaire (structures dorsales) surnuméraire si l'ARNm est injecté dans un blastomère végétatif ventra au stade morula.Il y a cependant un effet de la molécule dépendant de la dose.

Conclusion : Vg1 est un composant du centre inducteur de Nieuwkoop.

Autre membre de la famille TGFβ.Pour ce composant, il existe un gradient spatio-temporel d'expression chez la blastula. Sa concentration augment au cours du temps, et les cellules végétatives dorsales sont bien plus riches en Nodal que les cellules ventrales.

Cette expérience montre indirectement le rôle de Nodal, en prouvant qu'en l'inhibant par Cerberus

(molécule ventralisante inhibiteur de Nodal), on inhibait la formation de structures dorsales, notamment de mésoderme dorsal.Nodal est donc aussi impliqué dans la formation du mésoderme. Si on injecte Nodal au niveau ventral, on a la formation d'un axe surnuméraire.

Conclusion : Plusieurs facteurs de croissance sont impliqués dans la formation du mésoderme : FGF, Vg1, Nodal.

Dans les sous-familles Wnt et BMP de la famille TGFβ, quels sont les facteurs impliqués?

Wnt est la contraction de Wingless (wg) et int- (integration site).C 'est une famille de protéines de signalisation. Il existe 16 membres de Wnt chez le xénope.Le récepteur est un hétérodimère formé de Frizzled et LRP. Il y a ensuite une cascade intracellulaire.

Les facteurs de croissance impliqués dans la formation du mésoderme dorsal provoquent un changement d'expression du génome grâce à des facteurs de transcription spécifiques.

On va donc rechercher des facteurs de transcription spécifiques et de protéines régulatrices cytoplasmiques et/ou sécrétées.

Parmi ces protéines de signalisation, on a détecté :

Revenons à l'ovocyte fécondé :

La protéine Dsh (dishevelled) est concentrée au pôle végétatif de l'ovocyte II, elle est ancrée au microtubules. Les microtubules et les microfilaments permettent d'accumuler certaines protéines dans des régions particulières du cytoplasme. Au moment de la rotation corticale, la protéine Dsh suit les microtubules et se retrouve concentrée au niveau dorso-végétatif de l'œuf fécondé. La distribution de Dsh n'est plus uniforme après la rotation corticale, il y a un enrichissement de la

future région dorsale.

Dsh, sous l'action du récepteur activé de Wnt, inhibe GSK3 qui est un des co-répresseurs de la βcaténine ; la βcaténine, qui est un facteur de transcription, peut alors aller agir dans le noyau sur l'ADN. C'est la cascade de la protéine Wnt.

Conclusion : En absence de Wnt, GSK3 est active, et une fraction importante de la βcaténine est dégradée.En présence de Wnt, GSK3 est inhibée, la βcaténine est libérée du complexe, et peut agir comme facteur de transcription.

La βcaténine répond-elle aux critères d'inducteur de dorsalisation définis plus haut?

On obtient par cette expérience un embryon double, avec deux axes dorsaux, comme lors de la greffe ventrale de la lèvre dorsale du blastopore dans l'expérience de Spemann et Mangold.La βcaténine peut donc créer un axe surnuméraire.

On recherche alors le facteur Wnt qui provoque la synthèse de βcaténine :

Conclusion : X-Wnt8 est un bon candidat pour induire la synthèse de βcaténine.

Expérience in vivo : Les embryons sont incubés avec et sans X-Wnt8 et on observe ensuite où est localisée la βcaténine par immunohistochimie.

Quelles sont les étapes entre la βcaténine et la dorsalisation?La cascade que l'on connait jusqu'ici :

→ Comment la βcaténine agit-elle pour dorsaliser?→ Quelles cibles pour l'organisateur de Spemann?

On reprend la même méthode : recherche d'un gène qui ne s'exprime que dans l'organisateur de Spemann :

L'important ici est de montrer que Siamois agit bien comme un acteur majeur de la dorsalisation, et qu'il est en aval de la βcaténine, sinon l'injection d'ARNm de βcaténine restaurerait l'axe.

Par ailleurs, Siamois peut créer un axe surnuméraire.

D'autres expériences montrent que l'expression du gène siamois est sous la dépendance du facteur de transcription βcaténine.

Maintenant qu'on a montré que Siamois appartenait à la voie de la βcaténine, on va rechercher quel est le rôle de Siamois.

Expérience : effet de siamois sur l'expression d'autres gènes (gènes cibles?) par Northern blot.

Localisation et rôle de Chordin et Noggin :

Autre approche : marquage d'une région par transplantation et suivi des cellules descendantes.Exemple : suivi de l'expression de Chordin.

Lors de la gastrulation, les cellules qui expriment Chordin se trouvent dans la future région dorsale.

Noggin et Chordin sont des protéines sécrétées. Elles induisent un axe secondaire et des structures dorsales plus généralement.Elles répondent par conséquent aux critères expérimentaux.

Comment Chordin contribue-elle à la dorsalisation?En empêchant BMP4 d'agir (BMP : bone morphogenetic Protein) → famille TGFβ.BMP4 est une protéine sécrétée qui induit du mésoderme ventral et latéral. Les ARNm de BMP4 sont présents dans les cellules de la blastula.

Expérience : injection de l'ARNm de BMP4 dans un blastomère dorsal → embryon ventralisé, pas de structures dorsales.

Conclusion : BMP4 a un effet antagoniste par rapport aux facteurs de transcription dorsalisants.

Chordin et Noggin inhibent la fixation de BMP4 sur son récepteur.

Schéma récapitulatif de toute la voie de signalisation :

Voie X-Wnt : voie de la dorsalisation.Voie BMP4 : voie de la ventralisation.