Les Avantages des RabMAbsdocs.abcam.com/pdf/rabmab/les-avantages-des-rabmabs.pdf · 2013. 9. 10. · En plus des nombreux avantages que présente la technologie des monoclonaux de

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Les Avantages des RabMAbs®

RabMAbs® (Rabbit Monoclonal Antibodies) Anticorps monoclonaux de lapin Anticorps de qualité supérieure

RabMAbs ®

Les anticorps de haute qua

lité

Lesan

ticorps de haute qualité

Haute affinité

Epitopes nouveaux

Haute spécificitéHaute spécificité

#4

#6

#5#5

Avantages des RabMAbs2

Table des matières

1. Réduction du bruit de fond 6

2. Détection des modifications post-traductionnelles 7

3. Excellents produits pour l’immunohistochimie (IHC) 8

4. Haute affinité 9

5. Haute spécificité 10

6. Reconnaissance d’épitopes nouveaux et variés 11

7. Nombreuses applications validées 12

8. Compatibilité avec les échantillons de souris 13

Les avantages des RabMAbs

A propos de la technologie RabMAb 3

Intérêts des RabMAbs 4

Avantages pour les utilisateurs 4

Exemples de RabMAbs 14

Comparaison entre RabMAbs et anticorps de souris 5

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Les RabMAbs (Rabbit Monoclonal Antibodies) sont issusd’une technologie unique et exclusive permettant dedévelopper des anticorps monoclonaux chez le lapin, au lieude la méthode conventionelle utilisant la souris. Cette technique, similaire à celle développée pour les anti-corps monoclonaux de souris, utilise un partenaire de fusion breveté (lignée cellulaire immortelle) pouvant fusionner avec les cellules B, formant ainsi des hybridomes de lapin. Ces hybridomes sont alors criblés pour sélectionner des clones reconnaissant, de manière spécifique et avec une grande sensibilité, l’antigène de choix. Les anticorps sont ensuite caractérisés pour déterminer leur efficacité dans plusieurs applications (Fig. 1).

Les anticorps produits par la technologie RabMAb per-mettent une meilleure reconnaissance antigénique en com-paraison avec des anticorps traditionnels de souris. En effet, le système immunitaire du lapin génère une grande diversité d’anticorps et optimise l’affinité par des mécanismes plus ef-ficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs, améliorant ainsi la probabilité d’isoler des anticorps fonction-nels pour une plus grande gamme d’applications (1, 2).

Contrairement à la souris, la réponse immunitaire du lapin induite par des molécules organiques ou des peptides est supérieure. C’est souvent pour cette raison que les anticorps polyclonaux sont développés chez le lapin pour la recherche et les applications de diagnostics, allant du dépistage de drogues au diagnostic clinique.

Lapins immunisés

Cellules B isolées

Hybridomes

Hybridomes criblés par ELISA pour une reconnaissance spécifique de l’antigène

RabMAbs

Caractérisation de l’anticorps (Western, IHC, ICC, Flow, IP, test de neutralisation, etc.)

Partenaires de fusion(240E-W2, US patent 742987)

Fig. 1 - Protocole de production des RabMAbs

A propos de la technologie RabMAb

1. Rabbit monoclonal antibodies: a comparative study between a novel category of

immunoreagents and the corresponding mouse monoclonal antibodies.

Rossi S, [Am J Clin Pathol. 2005 Aug;124(2):295-302]

2. Rabbit monoclonal antibodies show higher sensitivity than mouse monoclonals for estrogen and progesterone receptor evaluation in breast cancer by immunohistochemistry. Rocha R,

[Pathol Res Pract, 2008;204(9):655-62. Epub 2008 Jun 18]


Intérêts des RabMAbsLes anticorps monoclonaux de lapin RabMAbs associent les avantages d’une meilleure reconnaissance antigénique due au système immunitaire du lapin avec la spécificité et la consistance d’un monoclonal, générant ainsi des anticorps d’une qualité exceptionnelle.

Les résultats publiés par des laboratoires indépendants comparant les anticorps mono-clonaux de lapin aux monoclonaux de souris ont démontré que les RabMAbs permettent d’augmenter la sensibilité avec une spécificité similaire sinon meilleure.

Principaux avantages des RabMAbs:

• Reconnaissance diversifiée des épitopes • Meilleure réponse immunitaire aux épitopes de petites tailles • Haute spécificité et affinité • Meilleure réponse aux antigènes de souris

Avantages pour les utilisateurs Anticorps de haute qualité pour une large gamme d’applications.Le système immunitaire du lapin génère une diversité d’anticorps et optimise l’affinité par des mécanismes plus efficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs. La probabilité de récupérer des anticorps fonctionnant dans une large gamme d’applications est donc accrue. Les anticorps RabMAbs sont souvent les outils idéaux pour des applica-tions exigeantes telles que l’immunohistochimie (IHC) sur tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine.

De nouveaux anticorps pour les cibles dites « difficiles ».Grâce à la reconnaissance d’un large éventail d’épitopes et une meilleure réponse immu-nitaire pour les cibles peu immunogènes (telles que les antigènes de souris, ou les épitopes de petites tailles comme les peptides ou molécules organiques), le développe-ment d’anticorps hautement fonctionnels pour ces cibles particulières devient donc possible grâce à la technique RabMAb. Par exemple, des anticorps de qualité ont été développés pour la reconnaissance de sites présentant une double phosphorylation.

Des anticorps hautement caractérisés.En plus des nombreux avantages que présente la technologie des monoclonaux de lapin, chaque RabMAb est testé dans de nombreuses applications (ELISA, WB, IHC, ICC/IF, IP et FACS) et espèces (Humain, Souris et Rat). Ces étapes de validation sont indis-pensables et permettent de sélectionner des anticorps de haute qualité.


RECONNAISSANCE DE L’ANTIGÉNE

• Bonne réponse immunitaire contre les peptides, petites molécules et protéines de rongeurs

• Reconnaissance diversifi ée des épitopes

• Réponse immunitaire limitée pour les protéines de rongeurs

• Peptides et molécules organiques sont souvent de faibles immunogènes

• Reconnaissance épitopique limitée (immunodominance)

AFFINITÉ de l’ordre du picomolaire (KD =10-12 M)

de l’ordre du nanomolaire (KD =10-9M)

SPÉCIFICITÉ Elevée Moyenne

APPLICATIONSWB, ELISA, Cytométrie en Flux, IP, ICC, excellents résultats en IHC

WB, ELISA, Cytométrie en Flux, IP, pas toujours adapté en IHC ou ICC.

CDX2Coupe en paraffi ne d’un carcinome de colon humain avec le RabMAb anti-CDX2 (ab76541) en comparaison avec un monoclonal de souris (dilution 1/1000)

E-CADHÉRINE Coupe en paraffi ne d’un carcinome de sein (humain) avec le RabMAb anti-E-Cadhérine (ab40772) en comparai-son avec un monoclonal de souris (dilution 1/50)

HER2 / ErbB2Coupe en paraffi ne d’un carcinome de sein (humain) avec le RabMAb anti Her2 / ErbB2 (ab134182) en comparaison avec un monoclonal de souris (dilution 1/500)

Comparaison entre RabMAbs (Monoclonaux de Lapin) et Monoclonaux de Souris

Comparaison RabMAbs Monoclonal de Souris

RabMAb

RabMAb

RabMAb

Monoclonal de souris




1. Réduction du bruit de fond Les RabMAbs en tant que monoclonaux, détectent un épitope unique limitant ainsi les réactions croisées avec les autres protéines présentes dans l’échantillon. Il a été également observé que les RabMAbs se lient à leur cible avec une plus grande affinité, permettant d’obtenir un meilleur rapport réponse/bruit de fond qu’avec les anticorps monoclonaux de souris à concentrations égales. Par conséquent, les RabMAbs peuvent détecter une protéine d’intérêt avec plus de spécificité et présentent une plus grande sensibilité tout en maintenant un bruit de fond minimal.

IHC sur coupe en paraffine d’un adéno-carcinome de côlon humain utilisant un RabMAb anti-c-Myc (ab32072).

WB sur lysats cellulaires MCF-7 (1), Ramos (2), SW480 (3), Molt-4 (4), Jurkat (5), HeLa (6) utilisant un RabMAb anti-MCM2 (ab108935).

IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-Phospho-AMPK alpha 1 (pS496) (ab92701).

c-Myc AMPK alpha 1 (phospho S496)

IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-Histone H3 (pS10) (ab32107)

IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-Ki67 (ab154201).

FACS sur cellules HuT-78 utilisant un RabMAb anti-CD38 (ab108403) (rouge) et une IgG de lapin (négatif) (vert).

Histone H3 (pS10) CD38 Ki67 (Alexa Fluor® 488)


Acétylation Méthylation Phosphorylation

WB sur lysat de cellules C6 utilisant un RabMAb anti-Histone H3 (Acetyl K56) (ab76307). Colonne 1: non traité, Colonne 2: traité avec TSA

WB utilisant un RabMAb anti-Histone H3 (diméthyl K4) (ab32356). Colonne 1: Lysat de cellules Hela, Colonne 2: Histone H3 recombinant (non-méthylé)

1 21 21 2

2. Détection des modifications post- traductionnelles Le système immunitaire du lapin peut fabriquer des anticorps qui reconnaissent des épitopes de petites tailles. La détection de modifications post-traductionnelles est également rendue possible (phosphorylation, méthylation, acétylation, sumoylation). Chez la souris, les molécules organiques ou les peptides génèrent une réaction immunitaire beaucoup plus faible que chez le lapin.

Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sur l’Histone H3:

Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sites phosphorylés:

WB sur lysat de cellules NIH 3T3 utilisant un RabMAb anti-c-Jun (pS63) (ab32385). Colonne 1 et 3: non traité, Colonne 2 et 4: traité avec UV ou Anisomycine

WB sur lysat cellulaire Jurkat utilisant RabMAb anti-eIF4EBP1 (pT37) (ab75767). Colonne 1: non traité, Col-onne 2: traité à l’insuline

WB sur lysat de cellules 293T utilisant un RabMAb anti-S6K (pT421/pS424) (ab32525). Colonne 1: non traité, col-onne 2: traité avec EGF

1 2 1 2

Phosphotyrosine (pY) Phosphoserine (pS) Phosphothréonine (pT) Double Phospho (pT/pS)

1 21 2 3 4


3. Excellents produits pour l’immunohistochimie (IHC) La haute spécificité et sensibilité des RabMAbs font de ces produits de parfaits outils biologiques pour l’immunomarquage, en particulier pour I’IHC sur tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine. Les RabMAbs permettent également de travailler à des dilutions plus élevées (5 à 10 fois environ) et peuvent être utilisés dans différentes méthodes de fixation de tissus avec un minimum de prétraitements. De plus, il est possible d’utiliser en parallèle un anticorps monoclonal de souris avec un anticorps RabMAb pour effectuer un double marquage sur une même coupe de tissu.

Comparaison du RabMAb anti-Her2/ErbB2 avec un anticorps polyclonal de lapin et un anticorps monoclonal de souris sur coupe en paraffine d’un carcinome de sein.

RabMAb HER2 / ErbB2Anticorps Polyclonal

de lapin Anticorps Monoclonal

de souris

3 ng / mL 20 ng / mL 30 ng / mL

IHC sur tissus humain cancéreux de vessie utilisant un RabMAb anti-CK8 (ab53280) avec Fast Red et un monoclo-nal de souris anti-Ki-67 avec du DAB

CK8 et Ki-67 Her2/ErbB2 et ER Alfa AIF et Ki-67

IHC sur coupe d’un carcinome humain du col de l’utérus utilisant un RabMAb anti-AIF (ab32516) avec Fast Red et un monoclonal de souris anti- Ki-67 avec du DAB.

Double marquage utilisant les RabMAbs:


Comparaison de l’affinité par les valeurs KD des RabMAbs et anticorps monoclonaux de souris traditionnels.Mesures de KD effectuées sur 850 RabMAbs.

Echelle d’affinité

Comparaison des valeurs KD des RabMAbs avec les anticorps thérapeutiques couramment utilisés:

1. Applications And Engineering Of Monoclonal Antibodies. David J. King, 2007.

2. Anti-peptide antibody screening: Selection of high affinity monoclonal reagents by a refined surface plasmon resonance technique. Pope ME, [J Immunol Methods. 2009 Feb 28;341(1-2):86-96. doi: 10.1016/j.jim.2008.11.004. Epub 2008 Nov 28]

ER 1.28 x 10-12

ID1 2.82 x 10-12

C29 9.57 x 10-11

TNF-α 1.25 x 10-11

IL-1-β 1.99 x 10-10

Anticorps monoclonaux thérapeutiques

KD (M)

Herceptine 5.0 x 10-9

Rituxan 8.0 x 10-9

Synagis 1.0 x 10-9

Remicade 2.0 x 10-10

Avastine 5.0 x 10-10

4. Haute affinitéL’affinité d’un anticorps est caractérisée par la constante de dissociation à l’équilibre KD déterminée par le rapport des constantes de vitesse cinétique (koff/kon) ou le rapport des concentrations des constituants à l’équilibre. Un faible KD se traduit par une plus grande affinité de l’anticorps pour son ligand et une meilleure sensibilité de détection. Alors que la plupart des anticorps monoclonaux thérapeutiques ont un KD à l’échelle du nanomolaire (10-9 M), les RabMAbs ont des KD pouvant souvent atteindre le picomolaire (10-12 M) démontrant de façon consistante leur plus grande affinité. Les étapes de sélection peuvent ainsi être évitées. (2)


5. Haute Spécificité

Comparaison de plusieurs RabMAbs anti-PARP-1

Chaque RabMAb anti-PARP-1 reconnait spécifiquement différents sites de clivage sans réaction croisée avec les sites de clivages non spécifiques.

La haute spécificité des RabMAbs permet de générer des anticorps d’une grande qualité,reconnaissant des changements épitopiques subtiles induits par le clivage protéique oudes épitopes très similaires.

Identité % Réactivité

Progestérone 100

17-aHydroxyprogestérone 0.901

Cortisol 0.035

Desoxycorticostérone 1.59

20a Dihydroprogestérone 0.016

20b Dihydroprogestérone 0.02

Pregnenolone 0.764

Pregnenolone-3-SO4 0.426

PARP-1 entière

Site de clivage


La majorité des protéines humaines sont très conservées entre la souris et l’humain. Parconséquent, ces protéines ont tendance à être moins immunogènes lorsque que la souris est utilisée en tant qu’animal hôte.

En utilisant le lapin comme animal hôte, avec son mécanisme unique de diversifi cation immu-nitaire et de maturation de l’affi nité, les RabMAbs peuvent être produits pour une large gamme d’épitopes permettant la découverte de nouvelles cibles antigéniques.

Comparaison en Western Blot des réponses immunitaires de lapin et de souris montrant ainsi que le sérum de lapin reconnait plus d’épitopes que celui de souris.

Comparaison de la réponse immunitaire: RabMAb & Monoclonal de Souris

1

2

3

SOURIS LAPIN1

2

3

Le lapin reconnait plus d’épitopes1. Marqueur de poids moléculaire2. Fibronectine3. Fibronectine traitée par une protéase

5 souris et 3 lapins

Immunisation par la � bronectine humaine

Sérum polyclonal

Analyse Western Blot

6. Reconnaissance d’épitopes nouveaux et variés Le système immunitaire du lapin est différent de celui de la souris. Ces différences sont large-ment attribuées à la faible immunodominance du lapin et un large répertoire de cellules B. Lors du développement des anticorps, la reconnaissance épitopique sera élevée chez le lapin. L’étude ci-dessous compare, par Western Blot, les réponses immunitaires entre le lapin et la souris. Notre expérience dans le développement d’anticorps monoclonaux suggère que le système immunitaire de lapin peut développer une plus grande diversité d’anticorps contre gamme plus large d’épitopes.


Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro) A) WB sur lysat de cellules HeLa, B) IHC sur coupe en paraffine de carcinome de col de l’utérus, C) FACS sur cellules Jurkat et D) ICC sur cellules HeLa

Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro)

7. Nombreuses applications validéesNos anticorps RabMAbs sont tous validés dans plusieurs applications (Western Blot, IHC, ICC/IF et FACS) ainsi qu’avec des échantillons provenant de différentes espèces (humain, souris et rat). En IHC, les RabMAbs ont été testés sur coupes en paraffine (FFPE) de tissus humains afin de valider leur sensibilité et leur spécificité de localisation.


IHC sur coupe en paraffi ne d’intestin de souris utilisant un RabMAb anti-MCM2 (ab108935)

IHC sur coupe en paraffi ne d’intestin de souris utilisant un RabMAb anti-EGFR (pY1068) (ab40815)

IHC sur coupe en paraffi ne de rate de souris utilisant un RabMAb anti-CD3 gamma (ab134096)

IHC sur coupe en paraffi ne du gros intestin de souris utilisant un RabMAb anti-Caténine (p120) (ab92514)

IHC sur coupe en paraffi ne de cerveaux de souris utilisant un RabMAb anti-GFAP (ab68428)

EGFR (pY1092) Cytokeratine 8 MCM2

GFAP CD3 γ p120 Caténine

RabMAbs validés en IHC sur tissus de souris

8. Compatibilité avec les échantillons de sourisLes RabMAbs sont des outils idéaux pour nos clients travaillant sur des échantillons de souris. L’utilisation d’anticorps monoclonaux de souris sur des tissus de souris peut être probléma-tique et implique un protocole complexe. Les RabMAbs permettent d’éviter les problèmes de réactions croisées et le bruit de fond qui sont généralement observés lors de l’utilisation d’un anticorps secondaire de souris.

La technologie RabMAb, utilisant le lapin comme hôte, va produire avec plus de succès des anticorps monoclonaux contre des antigènes de souris. Avec les RabMAbs, il est ainsi possible d’utiliser un anticorps monoclonal avec des échantillons de souris en évitant les problèmes de signaux non-spécifi ques liés aux réactions croisées avec les immunoglobulines natives de souris.

Pour chaque RabMAb, les réactions croisées entre les espèces ont été testées en Western Blot sur des échantillons de souris et d’humain.


Exemples de RabMAbs

IHC sur coupe en paraffine d’un carci-nome humain du col de l’utérus

WB sur lysat entier de cellules U2OS

Réactivité: Humain, Souris, Rat, Hamster, Macaque

Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP

Anticorps anti-Caténine beta [E247] (ab32572)

IF sur des cellules HeLaWB sur cellules K562

Réactivité: Humain, Souris, Rat

Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP, Cytométrie en Flux

Anticorps anti-AIF [E20] (ab32516)

IHC sur coupe en paraffine d’un carci-nome humain d’endomètre

WB sur lysat de cellules HEK293. Colonne 1: non traité, colonne 2: traité au doxorubicine

Réactivité: Humain

Applications: WB, IHC-P, ICC/IF, IP

Anticorps anti-ATM (pS1981) [EP1890Y] (ab81292)


IF sur cellules embryoniques humaines de rein

WB sur lysat de cellules HeLa à 10 μg


Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP, Cytométrie en Flux

Anticorps anti-Tubuline Alpha [EP1332Y] (ab52866)

IHC sur coupe en paraffine d’un adéno-carcinome de côlon humain

IF sur cellules HeLa


Applications: WB, IHC-P, ICC/IF, IP

Anticorps anti-c-Myc [Y69] (ab32072)

IHC sur coupe en paraffine d’un carcinome humain du col de l’utérus

WB sur lysat de cellules A431. Colonne 1: EGF non traité, Colonne 2: EGF traité

Réactivité: Humain, Souris

Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF

Anticorps anti-EGFR (pY1092) [EP774Y] (ab40815)

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