INT. J. RADIAT. BIOL ., 1971, VOL . 20, NO. 2, 137-144

Modifications des effets du rayonnement sur les amibesII. Effet restaurateur d'une basse temperature apres lesrayons ultraviolets

YVETTE SKREB et MAGDA EGERLaboratoire de Biologie Cellulaire, Institut de Recherches Medicales, MoePijade 158, Zagreb, Yougoslavie

(Received 11 January 1971 ; accepted 10 May 1971)

Un traitement par les rayons u .v. reduit la survie des fragments nuclees etanuclees d'amibes. Le taux de RNA et de proteines des fragments irradiesdiminue au cours des premieres 24 heures .

Une incubation de duree limitee, a basse temperature, favorise les processusde restauration chez les amibes entieres et les fragments nuclees irradies : lecontraire se produit pour les fragments anuclees .

Le DNA cytoplasmique ne semble pas participer aux processus de restauration .

1 . IntroductionDans le precedent travail, nous avons montre (Skreb et Horvat 1970)

comment par un traitement preliminaire a l'actinomycine D, on pouvait augmen-ter la radiosensibilite des fragments nuclees et anuclees d'amibes et memesupprimer la restauration .

Ensuite, nous avons centre notre interet sur les conditions d'incubationpost-irradiation auxquelles les cellules sont extremement sensibles . Leur etudea permis d'elucider certains mecanismes concernant aussi bien le developpementdes radiolesions (Berry et Oliver 1964) que les phenomenes de restauration(Belli et Shelton 1969) .

Si nous nous limitons a la restauration des effets des rayons ultraviolets, acote de la photorestauration, on connalt deux etapes qui sont coordonnees :]'excision des dimeres de pyrimidines et la replication reparatrice qui restituentcorrectement la sequence originale du DNA (Setlow et Carrier 1967, Boyce etHoward-Flanders 1964) . Un troisieme mecanisme, la reparation par recom-binaison constitue un systeme independant mais complementaire du precedent(Radman, Cordone, Krsmanovic-Simic et Errera 1970) .

Skreb et Bevilacqua (1962 a) apres une evaluation indirecte de 1'effetinhibiteur des rayons u .v. au niveau de la synthese du RNA et des proteines ontmontre que la photorestauration agissait positivement a cc niveau par unereprise marquee du taux des syntheses (Skreb et Bevilacqua 1962 b) .

Un facteur physique important, egalement susceptible de modifier le coursdes effets de ]'irradiation est la temperature a laquelle est soumis le materiel aucours de ]'experimentation . D'une part, un abaissement de temperature deplusieurs degres relentit le metabolisme cellulaire, en particulier les processusenzymatiques (Scholtissek 1968), d'autre part un sejour limite a basse tempera-ture peut favoriser la reparation des radiolesions (Kovaleva 1964, Schreck etElrod 1965, Elkind, Sutton-Gilbert, Moses, Alescio et Swain 1965, Manasek,Adelstein et Lyman 1966, Whitmore et Gulyas 1967) .

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Nous avons pu constater qu'une incubation de 2 heures a 6 ° consecutive al'irradiation u.v . favorisait la reprise des syntheses macromoleculaires dans lesamibes entieres (Skreb et Eger 1967) . Par suite nous avons voulu voir si, dansles memes conditions experimentales, on obtenait des resultats identiques surles fragments nuclees et anuclees d'amibes et si les donnees recentes concernantla reparation du DNA irradie permettaient d'interpreter les resultats obtenus .

Nos conditions experimentales ne nous ayant pas permis une analyse precisede la composition en bases du DNA non plus que de son metabolisme chezl'amibe, nous avons du utiliser des parametres indirects c'est a dire le taux desurvie ainsi que la teneur en RNA et en proteines des fragments d'amibes traites .

2. Materiel et methodes2.1 . Cultures

Les conditions d'entretien des cultures d'amibes ainsi que d'obtention desfragments nuclees et anuclees ont deja ete decrites (Skreb et Horvat 1970) .

2.2 . IrradiationL'irradiation u .v. est pratiquee a l'aide d'une lampe germicide de 15 watts,

emettant autour de 2537 A et debitant 25 ergs/mm2/sec quand elle est placee a40 cm de l'objet .

2.3 . Traitement a basse temperatureLe traitement par le froid se fait en immergeant les petits tubes contenant

les cellules dans un ultrathermostat regle a 6°, a l'obscurite .Les doses d'irradiation, la temperature de refroidissement ainsi que la duree

du traitement dans toutes les experiences qui suivent, ont ete choisies apresdifferents tests permettant d'etablir pour chaque facteur la dose qui dans leminimum de temps donne le maximum de resultats nets.

2.4 . Survie des fragments d'amibesDes lots homogenes de 50 fragments traites et de temoins ont ete comptes

regulierement pendant 12 a 15 jours afin d'etablir les courbes de survie .

2.5 . MicrodosagesLes techniques biochimiques sont adaptees de Brachet (1955) . Pour le

RNA on mesure au spectrophotometre dans l'ultraviolet l'absorption d'extraitsperchloriques faits d'apres Ogur et Rosen (1950) . Une microadaptation de lamethode de Lowry, Rosebrough ; Farr et Randall (1951) pour 1'indiceen tyrosine et en liaisons peptidiques s'est montree suffisamment precise car its'agissait d'un melange de tres faibles quantites de proteines . Pour chaqueextrait on a utilise de 300 a 500 fragments d'amibes.

3. Resultats experimentauxLes groupes experimentaux sont les suivants :(1) les temoins non traites ;(2) les fragments nuclees et anuclees soumis a une dose d'u .v. de 2400

ergs/MM 2 ;(3) les fragments seulement refroidis pendant 2 heures servant de second

groupe temoin ;(4) les fragments irradies puis refroidis a 6° pendant 2 heures .

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3 .1 . Courbe de survie des fragments nuclees et anuclees traitesL'allure des courbes sur les figures 1 et 2 indique que le refroidissement

temporaire prolonge la survie des fragments nuclees . Sur les fragmentsanuclees cet'effet benefique est ephemere et le nombre des fragments survivantsdiminue tres vite .

'd 100U7LO

N80

cCd

rn 60aL

d40

LL

E 20Z

C

80dEv 60L

d-° 40L

E 20Z

6

8

10

12Temps (,Tours)

Figure 2. Effets des rayons u .v . et d'un refroidissement a 6 ° sur la survie des fragmentsnuclees et anuclees d'amibes . A Temoins ; A refroidis a 6 ° pendant 2 heures ;O irradies u .v. 2400 ergs/mm2 ; • irradies puis refroidis .

3 .2. Evaluation du taux d'acide ribonucleique dans les fragments traites3.2.1 . Fragments nuclees

Sur le tableau 1 on peut comparer la teneur en RNA de 100 fragmentsd'amibes apres les differents traitements cites et a differents intervalles de tempsapres traitement . Entre temoins' et irradies 2 , toutes les differences sont sig-nificatives, P<0,01 . Entre irradies 2 et doublement traites4 les differences sont

2 4

6

8

10Temps (-Tours)

Figure 1 . Effets des rayons u .v. et d'un refroidissement a 6° sur la survie des fragmentsnuclees et anuclees d'amibes . A Temoins ; A refroidis a 6 ° pendant 2 heures ;0 irradies u.v. 2400 ergs/mm2 ; • irradies puis refroidis .

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1 40 Yvette Skreb et Magda Eger

Tableau 1 . Teneur en RNA exprimee en µg pour 100 fragments d'amibes . Chaquechiffre de la premiere colonne represente la moyenne de 8 experiences suivie de ladeviation standard . La second colonne de chiffres represente a pourcentage deRNA subsistant dans les fragments traites par rapport aux temoins .

egalement significatives ; P < 0,01 . Entre 3 et 4 les differences sont significativespendant 10 heures, ensuite elles ne le sont plus, ce qui signifie que le taux deRNA des cellules doublement traitees est redevenu normal .

Ce tableau montre 1effet inhibiteur immediat et durable de 1'irradiationpuisque au bout de 24 heures it n'y a que 60 pour cent de RNA . Le refroidisse-ment au contraire n'a pratiquement pas d'effet sur le taux de ce dernier . Maisapplique apres irradiation it provoque une reparation quasi-totale . On pent enconclure que la reparation a ce niveau est excellente .

3.2.2. Fragments anucleesEn ce qui concerne les fragments anuclees leur RNA semble moins touche

par les rayons u.v. que celui des fragments nuclees au cours des premieres 24heures . Entre temoins' et irradies 2 les differences ne sont pas significatives .Au contraire le refroidissement seul provoque une diminution du RNA mesurabledont le taux baisse de 40 pour cent . Applique apres irradiation it ne provoqueaucune reparation . A partir de 16 heures les differences entre irradies 2 etirradies et refroidis4 ne sont plus significatives .

Dans les fragments anuclees le froid seul diminue le taux du RNA etaugmente sa degradation partielle produite par les u .v.

Fragments nuclees

Heures Temoins'100 pour cent Irradies2 Refroidis 3

100 pour cent Irr . et refroidis4

pour pourcent cent

2 0,360 ± 0,007 0,260 ± 0,011

72 0,314 ± 0,007 0,300 ± 0,006 956 0,330 ± 0,007 0,254 ± 0,010 77 0,304 ± 0,006 0,284 ± 0,003 93

10 0,325 ± 0,008 0,250 ± 0,003 77 0,320 ± 0,003 0,305 ± 0,008 9516 0,308 ± 0,002 0,229 ± 0,030 74 0,309 ± 0,004 0,300 ± 0,033 9724 0,304 ± 0,005 0,184 ± 0,008 60 0,302 ± 0,006 0,288 ± 0,006 95

Fragments anuclees

Heurs Temoinsl Irradies2 Refroidis 3 Irr . et refroidis 4100 pour cent 100 pour cent

pour pourcent cent

2 0,252 ± 0,004 0,200 ± 0,004 79 0,245 ± 0,005 0,225 ± 0,008 926 0,229 ± 0,003 0,207 ± 0,006 90 0,217 ± 0,003 0,200 ± 0,009 9210 0,197 ± 0,003 0,181 ± 0,009 92 0,194 ± 0,006 0,179 ± 0,004 9216 0,162 ± 0,003 0,160 ± 0,006 99 0,181 ± 0,002 0,132 ± 0,004 7324 0,153 ± 0,004 0,137 ± 0,005 89 0,146 ± 0,005 0,110 ± 0,002 75

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3 .3 . Evaluation du taux des proteines3.3.1 . Fragments nuclees

Les conditions experimentales sont les memes que pour le RNA . Le tauxde proteines est exprime en µg pour 100 fragments d'amibes . Sur le tableau 2it y a tres peu de differences entre les quatre groupes . Les differences entretemoins et irradies ne deviennent significatives qu'au bout de 10 heures . Entretemoins' et irradies et refroidis 3 elles ne sont que faiblement significatives . Letaux de proteines au bout de 24 heures atteint 80 pour cent chez les doublementtraites alors qu'il tombe a 60 pour cent chez les irradies . Les fragmentsdoublement traites se situent toujours a mi-chemin entre les temoins et lesirradies . Le taux de restauration n'est pas aussi important que pour 1'acideribonucleique .

Tableau 2 . Indice en proteines exprime en µg pour 100 fragments d'amibes . La legendeest la meme que pour le tableau precedent.

3.3.2 . Fragments anucleesLes effets de ''irradiation sur les proteines ne deviennent mesurables qu'au

bout de 6 heures et ils s'accentuent avec le temps . Il n'y a aucune ameliorationsi l'on fait suivre ce traitement d'un refroidissement de 15 ° .

4. DiscussionIl semble utile de rappeler qu'au cours de travaux precedents, Skreb et

Bevilacqua (1962 a), Benzinger (1966) ont obtenu par amibe les donneesquantitatives suivantes : DNA nucleaire-3,7 x 10-12 g ; DNA cytoplasmique-70 x 10 -12 g ; RNA total-7370 x 10- 12 g

Fragments nuclees

Heures Temoinsl100 pour cent Irradies2 Refroidis 3

100 pour cent Irradies et refr . 4

26

101624

1,328±0,0501,264±0,0200,990 ± 0,0500,790 ± 0,0400,673 ± 0,030

1,168±0,0301,045±0,0300,650 ± 0,0600,590 ± 0,0400,420 ± 0,020

pourcent8883667562

1,330±0,0301,293±0,0500,950 ± 0,0450,726 ± 0,0400,575 ± 0,030

pourcent

1,250±0,040 941,106±0,040 850,800 ± 0,060 840,635 ± 0,020 870,547 ± 0,020 95

Fragments anuclees

Heures Temoinsl100 pour cent Irradies2 Refroidis 3

100 pour cent Irradies et refr . 4

pourcent

pourcent

2 1,036 ± 0,030 0,912 ± 0,030 88 0,967 ± 0,620 0,906 ± 0,040 946 0,852 ± 0,040 0,550 ± 0,030 67 0,945 ± 0,050 0,585 ± 0,020 6210 0,887 ± 0,030 0,365 ± 0,040 41 0,883 ± 0,030 0,398 ± 0,060 4516 0,789 ± 0,091 0,291 ± 0,040 37 0,658 ± 0,030 0,322 ± 0,030 4924 0,614 ± 0,030 0,271 ± 0,040 44 0,565 ± 0,030 0,270 ± 0,020 48

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Comme nous n'avons pu, par nos methodes, evaluer directement 1'effet desrayons u.v . sur le DNA, la discussion sera limitee aux preuves indirectes de laformation des photolesions, a leur reparation et a 1'eventuelle action modificatriced'une basse temperature . On tentera ensuite une estimation indirecte du roledu DNA nucleaire par rapport au DNA cytoplasmique en comparant les deuxtypes de fragments d'amibes .

En cc qui concerne le developpment des photolesions alors que chez lesbacteries la formation des dimeres est immediate, les mecanismes de reparationnecessitent plusieurs etapes plus lentes et plus complexes (Howard-Flanders1968) . Plusieurs enzymes recemment caracterises par Kaplan, Kushner etGrossman 1969 ; Kelly, Atkinson, Huberman et Kornberg 1969, entre autresinterviennent alors a differents degres (Ebisuzaki 1970) . L'action connue de latemperature sur ces enzymes en particulier chez certains mutants sensibles(Pauling et Hamm 1968) permet de supposer qu'un abaissement de temperatureconsecutif a l'irradiation empecherait 1'expression totale des radio-lesions etralentirait aussi la synthese du DNA par son action sur l'activite des enzymesspecifiques .

Or Radman et al. (1970) viennent de demontrer que chez les bacteries apresde fortes doses d'u.v ., un arret de la synthese du DNA favorisait justement lareparation par excision .

Apres emploi de radiations ionisantes Schrek et Elrod (1965) et Elkind,Sutton, Gilbert, Moses et Kamper (1967) ont aussi montre que si l'on soumettaitles cellules animales irradiaes a une incubation a basse temperature, les effetstoxiques des radiations pouvaient titre attenues et les cellules capables de lesreparer sans toutefois se diviser .

Comment peut-on alors envisager le cas des amibes, par rapport aux bacterieset aux cellules animales? On a constate que les deux types de fragments reagis-saient de la meme facon aux rayons ultraviolets, l'inhibition des syntheses etantun peu plus marquee pour les fragments nuclees . Par contre le froid seul, neproduit d'inhibition que chez les fragments anuclees . Applique pendant deuxheures apres irradiation, it provoque une nette reprise des syntheses macro-moleculaires chez les fragments nuclees seulement .

Precedemment, la photorestauration s'etait montree tout a fait efficace pourtous les fragments (Skreb et Bevilacqua 1962 b) . Grace aux micro-irradiationsu.v ., Jagger, Prescott et Gaulden (1969) viennent de confirmer nos resultats enmontrant 1'existence de la photoreactivation cytoplasmique chez l'amibe entiere .Elle ne serait pas due a la seule protection du noyau par le cytoplasme mais lesauteurs ne peuvent decider si la cible serait le RNA ou le DNA .

Si nous l'on supposons que chez l'amibe la cible principale est aussi leDNA, it semble d'apres le taux d'inhibition des syntheses du RNA et desproteines, que les deux DNA nucleaire et cytoplasmique reagissent differem-ment tant aux radiations qu'au cours des processus de restauration .

L'action restauratrice de la lumiere visible prouve indirectement que desdimeres de pyrimidine ont ate formas puis excises . L'acceleration de lareparation a l'obscurite grace au froid tendrait a prouver aussi que le DNAnucleaire de l'amibe est capable d'exciser ses dimeres .

Mais nous ne pouvons voir le role du DNA cytoplasmique, beaucoup tropabondant pour titre seulement mitochondrila . On pense maintenant que le DNAmitochondrial des micro-organismes : levures (Moustacchi 1970) champignons

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(Holliday et Resnick 1969), est soumis a des mecanismes de reparationindependants du DNA nucleaire . Le DNA cytoplasmique des fragmentsd'amibes ferait plutot penser a un endosymbionte comme d'autres auteurs fontd'ailleurs suppose (Hawkins et Wolstenholme 1967) . 11 est peut-etre lui aussisensible a la photorestauration, mais on ne peut le prouver .

Il est aussi connu que le RNA se montre dans certains cas photoreactivablemais moins que le DNA (Jagger 1967) . Par suite est-ce que 1'elevation du tauxde RNA observee dans les fragments nuclees d'amibes photorestaures est duea 1'action directe de la lumiere sur ce RNA ou bien est-elle une consequence dela reparation du DNA? Et comment expliquer alors le cas des fragmentsanuclees tres photorestaurables?

Toutes ces preuves indirectes permettent de supposer que dans le cas de laphotorestauration le RNA cytoplasmique est photoreactivable dans les deuxtypes de fragments en plus du DNA nucleaire tandis que dans le cas de reparationa l'obscurite stimulee par le froid, seul le DNA nucleaire est capable de reparerses photolesions .

REMERCIEMENTS

Nous souhaitons remercier le Dr . M. Drakulic et le Professeur M . Errerad'avoir encourage et critique ce travail .

Ce travail a pu titre menti a bien grace a deux contrats negocies avec le Fondspour la Recherche Scientifique de la Republique Croate et le Fonds Federalde la Recherche Scientifique Yougoslave .

UV-irradiation reduces the rate of survival of nucleate and anucleate amoeba fragments .The percentage of RNA and proteins in irradiated fragments decreases in the course of thefirst 24 hours, but at a different rate for nucleate and anucleate fragments .

Incubation of limited duration at 6 °c enhances the process of repair in whole amoebaeand in irradiated nucleate fragt ents-in anucleate fragments the effect is the opposite .Cytoplasmic DNA does not seem to take part in the repair process .

Durch Behandlung mit ultravioletten Strahlen wird die Lebensdauer kernhaltiger andkernloser Amobenteilchen herabgesetzt . Der RNS- and Proteingehalt sinkt bei denbestrahlten Teilchen wahrend der ersten 24 Stunden, jedoch nicht gleichmaBig .

Eine zeitlich beschrankte Inkubation bei niedriger Temperatur von 6 °c begiinstigtdie Wiederherstellungsprozesse bei ganzen Amoben and bei den bestrahlten kernhaltigenTeilchen: bei den kernlosen Teilchen ist das Gegenteil festzustellen .

Zytoplasmatische DNS scheint am ReparaturprozeB nicht teilzunehmen .

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