This article was downloaded by: [University of Massachusetts]On: 21 August 2014, At: 17:15Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

Acta Botanica Gallica: BotanyLettersPublication details, including instructions for authorsand subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/tabg20

Stratégie d'améliorationde la qualité des plantsforestiers et des reboisementsméditerranéens par utilisationde la mycorhization contrôléeen pépinièreDaniel Mousain a , Claude Plassard a , ChristineArgillier c , Thierry Sardin c , Franck Leprince b ,Khalid El Karkouri a , Jean-Claude Arvieu b & Jean-Claude Cleyet-Marel aa Laboratoire de Recherches sur les Symbiotesdes Racines , INRA-ENSA , 2 place Viala, F-34060 ,Montpellier Cedex 1b Laboratoire de Science du Sol , INRA-ENSA , 2 placeViala, F-34060 , Montpellier Cedex 1c Division Forêt Méditerranéenne , CEMAGREF , LeTholonet, BP 31, F-13612 , Aix-en-Provence CedexPublished online: 27 Apr 2013.

To cite this article: Daniel Mousain , Claude Plassard , Christine Argillier , ThierrySardin , Franck Leprince , Khalid El Karkouri , Jean-Claude Arvieu & Jean-ClaudeCleyet-Marel (1994) Stratégie d'amélioration de la qualité des plants forestiers etdes reboisements méditerranéens par utilisation de la mycorhization contrôléeen pépinière, Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 141:4, 571-580, DOI:10.1080/12538078.1994.10515201

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Acta bot. GaUica, 1994,14-1 (4), .571-.580.

Strategie d'amelioration de Ia qualite des plants forestiers et des rehoisements mediterraneens par utilisation de Ia mycorhization controlee en pepiniere

par Daniel Mousain (1), Claude Plassard (1), Christine Argillier (l), Thierry Sardin (l), Franck Leprince e), Khalid El Karkouri C), Jean-Claude Arvieu (2) et Jean-Claude Cleyet-Marel (I)

(1) Laboratoire de Recherches sur les Symbiotes des Racines, (2) Laboratoire de Science du Sol, INRA-ENSA, 2 place Viala, F-34060 Montpellier Cedex I (l) Division Foret Mediterraneenne, CEMAGREF, Le Tholonet, BP 31, F-13612 Aix-en-Provence Cedex

Resume.- Dans Ia region mediterraneenne, les fortes contraintes edaphi­ques, climatiques et economiques contribuent a !'aggravation de Ia crise de transplantation des arb res juveniles. L'utilisation de Ia mycorhization contrOiee represente un des moyens susceptibles d'attenuer les etfets de cette crise en ameliorant Ia qualite des plants forestiers produits en pepiniere et celle des reboisements. Pour realiser eel object~. un programme de recherche/develop­pement a ete mis en ceuvre doni les premiers resu~ats sont presentes : criblage d'isolats mycorhizogenes suivant des criteres physiologiques ; myco· rhization contrOiee d'especes forestieres medrterraneennes incluant !'etude du polymorphisme enzymatique des mycorhizes comme outil de caracterisation ; mesure des effets de Ia mycorhization sur Ia nutrition des arbres en pepi­niere ; etude ecophysiologique de boisements experimentaux.

Summary.- In the mediterranean region, the strong edaphic, climatic and economic constraints lead to the increase of the transplantation crisis of young trees. The use of controlled mycorrhizal infection is one of the means open to reduce the effects of this crisis by improving the quality of the forest trees grown in nursery, and the reforestation. To achieve this objective, a research/ development programme was started and preliminary resu~s are presented : screening of mycorrhizal isolates using physiological criteria ; controlled my­corrhizal infection including the study of enzymic polymorphism in mycorrhi­zae as a tool for characterization of these organs ; measurement of the effects of mycorrhizal infection on the nutrition of trees in nursery ; ecophysiological study of experimental wood lots.

Key words : mycorrhizal infection - screening of isolates - nursery - experi­mental wood lots - mediterranean region.

©Societe botanique de France 1994. ISSN 1253-8078.

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INTRODUCTION

La foret mediterraneenne a un role es­sentiel dans Ia protection des sols, Ia conservation des nappes, Ia restaura­tion des paysages, Ia production de bois (Pin laricio de Corse, Cedre de l'Atlas ... ) et de produits derives (liege), et Ia reconversion des terres delaissees par !'agriculture. La crise de transplan­tation, qui se manifeste lors de l'instal­lation de plants forestiers produits en pepiniere sur les sites de reboisement, est aggrave dans Ia region mediterra­neenne qui est soumise a de fortes con­traintes d'origine edaphique, climatique et economique. 11 en resulte que les taux de reprise a Ia plantation sont insuffi­sants et les couts des reboisements trop eleves. Cette capacite de reprise des jeu­nes arbres peut etre accrue par Ia ra­tionalisation du choix des especes a planter, !'adequation de ces especes aux conditions de milieu, Ia production de plants forestiers de qualite en pepiniere, !'optimisation des techniques de prepa­ration du sol ... La mycorhization con­trolee (ensemble de techniques visant a associer artificiellement une plante-hote et un champignon selectionne pour son efficacite et sa competitivite, des le stade de Ia pepiniere) represente un des moyens susceptibles d'ameliorer Ia qua­lite physiologique et sanitaire des plants forestiers et celle des reboisements dans Ia region mediterraneenne. Pour reali­ser cet objectif, un programme de re­cherches a ete mis en reuvre qui fait appel a plusieurs collaborations et com­prend les etapes suivantes :

• Obtention d'isolats mycorhizogenes d'especes forestieres mediterraneennes, apres isolement et culture de mycelium in vitro a partir de carpophores de Ba­sidiomycetes ectomycorhiziens releves dans des peuplements forestiers ou de mycorhizes prelevees sur des plants cul­tives en pepiniere.

• Crihlage d'isolats suivant des crite­res physiologiques. Le choix de ces cri­teres doit tenir compte des conditions ecologiques des milieux de transplanta­tion. Dans cette perspective, !'aptitude a !'utilisation des phosphates organiques et mineraux du sol est etudiee. Le phos­phore organique represente, en effet, une part importante du phosphore to­tal des litieres et des horizons superfi­ciels des sols. La liberation d'orthophos­phate a partir des phosphates organi­ques est due a des phosphatases dont la mesure de l'activite sur des mycelia per­met d'estimer !'aptitude potentielle des champignons a hydrolyser ces phospha­tes organiques. Toutefois, Ia plupart des reserves phosphatees du sol sont immo­bilisees dans des mineraux. L'aptitude des champignons mycorhiziens a solu­biliser ces mineraux en sol calcaire de­pend notamment de la presence et de Ia concentration des ions Ca2

• et HC03-.

Parmi les differents mecanismes mis en reuvre par les champignons pour acidi­fier le milieu de culture sature en CaC03 (excretion de protons et d'acides orga­niques, respiration), le criblage porte­ra sur Ia capacite des isolats a excreter de l'acide oxalique. L'utilisation ration­neUe de Ia symbiose implique aussi de cribler les isolats mycorhizogenes sui­vant leur capacite a assimiler le nitrate, forme d'azote mineral predominante en sol calcaire. La mesure d'activite nitrate reductase (ARN) realisee in vitro dans des conditions optimales de pH, tempe­rature et disponibilite en substrat, est Ia seule methode qui permette d'evaluer correctement Ia capacite de reduction du nitrate par les especes fongiques. Ceci necessitc d'adapter a des mycelia plus ou moins colores Ia methode mise au point sur Hebeloma cylindrosporum Romagn. (Plassard et al., 1984). La capacite a tolcrcr une contrainte osmo­tique est un autre critcre de choix des isolats.

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• Essais de mycorhization controlec de plants forestiers en pepinierc. Ces essais comprennent !'utilisation d'unc suspension sporale (pour !'inoculation du Cedre de l'Atlas par Tuber albidum Pico) ou d'un inoculum mycelien, !'ino­culation mycorhizienne d'arbres juve­niles cultives sur un substrat artificiel de pepiniere et le controle de Ia myco­rhization qui implique Ia caracterisa­tion des mycorhizes obtenues.

• Mesure des effets de l'ectomycorhi­zation sur Ia physiologic (croissance et nutrition minerale, echanges gazeux) des plants en pepiniere.

• Installation de boisements experi­mentaux et etude ecophysiologique de ces plantations. Lors de leur transplantation in situ, les mycorhizes etablies sur les racines des plants de pepiniere entrent en competition avec les especes mycorhiziennes natives et sont soumises aux conditions physiques et chimiques du sol. Le choix des iso­lats efficaces doit done etre verifie par !'etude ecophysiologique des boiscments. Cette etude doit etre completee par celle de Ia dynamique des especes mycorhi­zicnnes dans le but de s'assurer de Ia survie des mycorhizes introduites dans le milieu de transplantation.

MATERIEL ET METHODES

Mesure des actlvHes phosphatases des mycelia Des mycelia de 8 isolats d'Homobasidiomycetes

ectomycorhizogenes de pins [Sui/Ius collinitus (Fr.) Kuntze (n° 2, 6, 8 et 9), S. bovinus (L. ex Fr.) Roussel (n° 10), S. granulatus (L. ex Fr.) Roussel (n° 5), Pisoli· thus tinctorius (Pers.) Desv. (n° 9) et Rhizopogon ro· sea/us Corda Th. Fr. (n° 1)) ont ate studies pendant 16 jours sur un milieu faiblement concentre en ortho· phosphate (0,02 mM). puis transferes pendant 12 jours sur un milieu totalennent carence en phosphore. Apres lyophilisati~n. les mycelia sont broyes et homogenei­ses dans un tampon acetate de Na 25 mM (pH 6,0) additionne de Triton X·1 00 (0,02 %) et de 2-mercaptoethanol 5 mM. Le dosage des activ~es phos­phatases totales est realise sur une partie aliquote de l'homogenat en presence de para-nitropMnyl phosphate (PNPP) suivant Mousain et Salsac (1986). Une autre fraction aliquote de l'extrait enzymatique est centrifu-

gee a 48000 g pendant 30 min. : dans le surnageant, on mesure les activ~es solubles.

Mesure de !'excretion d'oxalate par las mycelia Des mycelia de 7 isolats ectomycorhizogenes [He­

beloma cylindrosporum (n° 9 et 11 ), Paxi/lus involutus (Baisch. ex Fr.) Fr. (no 11), Sui/Ius collinitus (no 2 et 22), Rhizopogon roseolus (no 1) et R. rubescens var. ochraceous A.H. Sm~h (n° 1)] ont eta cuHives pendant 24 jours sur une solution nutritive saturee en carbonate de calcium et comprenant de !'azote exclusivennent sous forme n~rique. Apres filtration et mise a sec de Ia solu­tion puis solubilisation de l'extrait par HCI 0,1 M, les concentrations en oxalate sont mesurees par chroma­tographie ionique (HPIC).

Mesure d'actlvite nitrate reductase (ANA) in vitro sur des mycelia

Dans le but d'adapter a d'autres especes mycorhi­ziennes Ia methode de mesure mise au point sur le mycelium non colore d'Hebeloma cylindrosporum(Plas­sard eta/., 1984), l'effet du tampon d'extraction a ate etudie en melangeant des sections de thalles apparte­nant a H. cylindrosporum (no 9) d'une part, eta Sui/Ius collinitus (no 2), Pisolithus tinctorius (n° 16) et Ceno­coccum geophilum Fr. (SIV) d'autre part. Le mycelium d'H. cylindrosporum representant Ia reference, si le tampon est valable pour extraire Ia n~rate reductase d'autres especes fongiques, l'activM mesuree dans le melange des mycelia de deux especes A et B do~ etre egale a Ia somme des ANA de chaque espece, mesu­rees separement. Pratique men!, chaque mycelium des deux especes est sectionne en deux parties (a et a' pour A, b et b' pour B) dont les masses de matiere fraiche (MF) sont voisines. L'ANA est ensu~e mesuree sur les sections a et b broyees separement (ANA de A, ANA de B), et sur l'homoglmat du melange des sec­tions a' et b' (ANA de A+ B). La valeur de I'ANA obte­nue sur ce melange est comparee a une valeur theori­que calculee a partir des ANA nnesurees sur chacune des fractions a et b des thalles A et B : ANA theorique = (ANAa x MFa') + (ANAb x MFb')/ (MFa' + MFb')

Inoculum fonglque et inoculations mycorhlzlennes des plants en peplnlere

• inoculum sporal - II est represents par une sus­pension de spores de Tuber albidum (provenance : Ita­lie) melangee a de Ia vermiculite (Mousain eta/., 1988). Cet inoculum est reserve a !'inoculation de semis de Cedrus atlantica (Endl.) Carriere.

• Inoculum mycelien- Cet inoculum est produit en laboratoire par culture de mycelium sur melange de vermiculite (ou de perlite) et de tourbe (4: 1, vN) satu­re par des solutions nutritives (Mousain eta/., 1988). La production en unites de 0,5 I est realisee en 10 semaines au maximum.

• Inoculations mycorhiziennes · Ces inoculations son! realisees a Ia Pepiniere Administrative des Milles-Aix­en·Provence (Direction departementale de I'AgricuHure des Bouches-du-AhOne). L'inoculum est applique au

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contact de plants ages de 2-3 mois qui sont cuHives en conteneurs de type WM (450 ml) sur un melange com­prenant, a volumes egaux, de Ia tourbe et soit du com­post d'ecorces de pins, soil de Ia vermiculite ou de Ia perlite. Chaque plant de Cadre est inocula par 100 ml d'inocutum sporal ce qui correspond a 1 g d'ascocarpe frais. L'inoculum mycelien est applique a raison de 80 mt d'inoculum par plant de Pin.

Apres leur inoculation, tes plants cuHives en pepi­niere son! irrigues par des solutions nutritives 12.8.30 (0,025 %) ou 8.6,5.13 (0, 1 % ou 0,5 %) respectivement appliquees a Ia dose de 5 I m' semaine·• (Mousain et a/., 1988) ou 10 I m·' semaine·•.

Caracterisation lsoenzymatlque des lsolats Le mycelium de 8 isotats d'Homobasidiomycetes

ectomycorhiziens [Sui/Ius collinitus (n° 2 et 24), S. mediterraneensis (Jacquetant & Blum) Redeuilh (no 1 ), Hebeloma cylindrosporum (n° 12), H. edurum (no 7), Pisolithus tinctorius (no 23), Paxillus involutus (n° 12), Rhizopogon rubescens (no 1)] a ate cuHive sur milieu de Melin-Norkrans modifie par Marx (1969). L'extra­ction des proteines solubles est realisee seton Sen (1990). La revelation de 5 systemes enzymatiques (es­terases, phosphatase acide, alanine-aminopeptidase, leucine-aminopeptidase, malate deshydrogenase) est effectuee sur gel de polyacrylamide-agarose.

Dosage de phosphore et d'azote et mesure des echanges gazeux sur le Pin pignon

Les dosages de phosphore total et d'azote total dans Ia plants son! realises suivant Mousain (1989). Les mesures d'assimilation du C0

2 et de transpiration

sont executees suivant Guehl eta/. (1990).

Installation de boisements experimentaux Des boisements experimentaux comprenant des

pins pignons ou des cadres de !'Atlas ont eta installes dans divers sites du Languedoc et de Petite-Camar­gue. Cette installation est realises par te CEMAGREF et le suivi des boisements est assure par cet orga­nisms en collaboration avec I'INRA.

• Dispositif experimental de Petite-Camargue - Ce dispositif, etabli en janvier 1990 sur un arenosol cal­caire, comprend 3 blocs constitues de 2-3 !ignes espa­cees de 3 m. tes plants etant distants de 1,5 m sur Ia ligna. Six traitements son! representes par des pins pignons mycorhizes par Sui/Jus col/initus (no 2 et 9) ou non mycorhizes, et fertilises ou non en pepiniere par une solution 8.6,5.13 a 0,5% ou 0,1 %.

• Dispositif de Montaren-Saint-Mediers (Gard)- Ces dispositifs son! etablis dans une rendzine sur calcaire du Barremian superieur a facies urgonien, a 265 m d'allitude. Le premier boisement, realise en fevrier 1991, comprend 3 blocs avec 2 repetitions de 2 !ignes de 25 plants par modalite, so it 300 cadres de !'Atlas non mycorhizes en pepiniere et 300 cadres mycorhizes par des spores de Tuber albidum. Les blocs sont espaces de 12 m. les !ignes de 4 met Jes plants de 1 ,5 m sur Ia ligna. Le deuxieme boisement, realise a Ia fin de J'au­tomne 1992, est un dispositif en blocs aleatoires com-

plats a 4 repetitions de 30 plants par modalite : cadres de I' Atlas mycorhizes par T. albidum ou non mycorhi­zes et fertitises par une solution 11.6.12 (0,5 %) appli­quee soil a Ia dose de 1 o I m-2 semaine·' (F), so it a Ia dose de 5 I m·' semaine·• (F/2).

RESULTATS ET DISCUSSION

Criblage d'isolats mycorhizogenes de pins suivant des criteres physiologi­ques

• Aptitude a l'utilisation de phospha­tes organiques et mineraux du sol

Parmi les isolats etudies, les activites phosphatases les plus elevees sont ob­servees dans 3 isolats de Suillus collinitus, et les plus faibles dans Piso­lithus tinctorius n° 9 et Rhizopogon ro­seolus n° 1. Le rapport des activites so­lubles aux activites totales est compris entre 17 % pour S. collinitus n° 9 et 48% pour P. tinctorius n° 9 (Ta­bleau 1). Ce resultat traduit que, dans les milieux carences en phosphate, les activites phosphatases des mycelia sont localisees majoritairemcnt dans les ter­ritoires cellulaires externes. II reste a verifier que l'aptitude du mycelium de Suillus collinitus a hydrolyser le PNPP s'exerce aussi vis-a-vis d'un phosphate naturel tel que le phytate, comme elle a ete demontree pour plusieurs isolats d'autres especes mycorhiziennes, en particulier Suillus granulatus n° 5, Laccaria laccata S 238 et Pisolithus tinctorius n° 9 et 12 (Mousain et al., 1988).

Apres 24 jours sur milieu carbonate et nitrique, Rhizopogon rubescens n° 1, R. roseolus n° 2 et Suillus collinitus n° 22 excretent en moyenne plus de l J.Imole d'oxalate par mg de matiere mycelienne seche, alors que pour les deux isolats d'1Iebeloma cylindrospo­rum etudics cette moyenne est tres infe­rieure a 0,5 J.Imole mg· 1 MS (Fig. 1). L'oxalate a une fonction d'immobilisa­tion du calcium (Malajczuk et Cromack, 1982 ; Lapeyrie et al., 1987). Associe a

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Tableau 1 .- Activites phosphatases d'isolats d'Homobasidiomycetes ectomycorhiziens. Les activites totales (AD sont exprimees en microkatals par gramme de matiere seche (~kat g·' MS). Les intervalles de confiance des moyennes sont indiques a p = 0,05. Les activites solubles sont representees en pourcentage des activites totales (AS/AT en%). S.c.2, S.c.6, S.c.8, S.c.9 : Sui/Ius collinitus n" 2, 6, 8 et 9 ; S.b. 10 : Sui/Ius bovinus no 10 ; S.g.5 : Sui/Ius granulatus no 5 ; P.t.9 : Pisolithus tinctorius no 9 ; R.r.1 : Rhizopogon roseotus no 1.

Table 1.- Phosphatase activities of ectomycorrhizal Homobasidiomycetes isolates. The activrties in the homogenates (AT) are expressed in microkatals per gram of dry matter (~kat g·' DM). Confidence limits are given for p = 0.05. The soluble activities are given in percentage of the total activities (AS/AT in %). S.c.2, S.c.6, S.c.8, S.c.9 : Sui/Ius collinitus n" 2, 6, 8 et 9 ; S.b.1 0 : Sui/Ius bovinus no 10 ; S.g.5 : Sui/Ius granulatus no 5 ; P.t.9 : Pisolithus tinctorius n° 9 ; R.r.1 : Rhizopogon roseotus no 1.

Fig. 1.- Excretion d'oxalate par des isolats de Ba­sidiomycetes mycorhizogenes en culture sur milieu carbonate (CaCO,) et nitrique. L'excre­tion d'oxalate est exprimee en ~mol par mg de matiere seche de mycelium. Les barres verti­cales representant l'ecart-type de Ia distri­bution des moyennes. H.c.9, H.c.11 : He­beloma cylindrosporum n" 9 et 11 ; P.i. :

AT AS/AT Paxillus involutus no 11 ; S.c.2, S.c.22 : Sui/Ius collinitus n" 2 et 22 ; R.r.2 . Rhizopogon roseolus n° 2 ; R.ru.1 : Rhizopogon rubescens n° 1.

(flkat g· 1 MS)

S.c. 2 6,11 ± 2,74

S.c. 6 7,05 ± 3,50

S.c. 8 5,0 ± 1,4

S.c. 9 3,54 ± 0,73

S.b. 10 1,51 ± 1,44

S.g. 5 2,65 ± 0,77

P.t. 9 0,36 ± 0,23

R.r. I 0,21 ± 0,12

des protons, c'est un acidc et aussi un complexant. Sa liberation dans lc sol doit vraiscmblablcmcnt contribucr a Ia solubilisation des phosphates de cal­cium.

• Capacite d'assimilation du nitrate Le tampon utilise pour )'extraction de

Ia nitrate reductase du mycelium d'He­beloma cylindrosporum convient pour !'extraction de cettc enzyme dans les mycelia de Cenococcum geophilum ct Suillus collinitus (Tableau 2). Les acti­vites nitrate reductascs mcsurees sur des melanges comprenant des mycelia de Pisolithus tinctorius ( P. tinctoriusl H. cylindrosporum ct P. tinctorius!Ce-

(%)

23 25

25

Fig. 1.- Excretion of oxalate from mycorrhizal iso­lates of Basidiomycetes cultured on a carbona­ted and nitric medium. Oxalate excretion is expressed in ~mol per mg of mycelia\ dry mat­ter. Standard deviations are represented with vertical bars. H.c.9, H.c.11 Hebe/o­ma cy/indrosporum no• 9 et 11 ; P.i. : Paxil/us involutus no 11 ; S.c.2, S.c.22 Sui/Ius collinitus n" 2 et 22 , R.r.2 : Rhizopogon roseolus no 2 ; R.ru.1 : Rhizopogon rubescens no 1.

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21 37

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nococcum geophilum) sont trcs infericu­res aux valcurs theoriqucs de ces ANR (Tableau 2). Toutcfois, l'ANR mesuree sur le mycelium de P. tinctorius est trcs faible (0,31 J.Imol N0

3- h- 1 g· 1 MF). Des

estimations de I' ANR in situ, cffectuees pour cette cspcce, ont fourni des va­Ieurs comprises entre 4 et 5 ~Imol N0

3-

h-1 g·1 MF (Plassard, 1989). Ccs resul­tats suggcrcnt que lc broyage du myce­lium de P. tinctorius a libere des inhi­bitcurs de l'ANH (par cxcmplc, des com­poses phenoliqucs) dans lc milieu d'ex­traction. L'addition ace milieu d'un ad­sorbant spccifique des composes phe­noliques, lc polyvinylpyrrolidone (PVP) indiquc que I' ANR maxi male est obte-

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Tableau 2.- Mesures d'activite nitrate reductase (ANA) in vitro a partir de plusieurs especes mycorhizogenes. L'ANR est mesuree sur des mycelia d'une seule espece ou sur un melange de mycelia de deux especes. Les moyennes sont exprimees en J.lmol de NO; apparu par heure et par gramme de matiere fraiche (!Jmol h·' g·' MF). EfT : rapport des valeurs experimen­tales aux valeurs tMoriques de I' ANA de melanges d'es­peces fongiques. H.c.9: Hebeloma cylindrosporum (no 9) ; S.c.2 : Sui/Ius co/linitus (n° 2) ; P.t.16 : Pisolithus tinctorius (no 16) ; C.g. : Cenococcum geophilum (SIV).

Table 2.- In vitro measurements of nitrate reductase activity (NRA) from several mycorrhizal species. The NRA is measured on the mycelium from one species alone or on the mixture from two species. The resu~s are ex­pressed in iJ.mol of NO; appeared per hour and gram of fresh matter (!Jmol h·' g·' FM). EfT: experimental data/ theoretical data of NRA of the mixture. H.c.9 : Hebelo­ma cylindrosporum (no 9) ; S.c.2 : Sui/Ius co/linitus (no 2) ; P.t.16 : Pisolithus tinctorius (no 16) ; C.g. : Cenococcum geophilum (SIV).

lsolat fongique ANR Flf A B A B (%)

H.c. 9 I C.g. 4,72 10,97 114

H.c. 9 I S.c. 2 3,83 1,14 138 H.c. 9 I P.t. 16 5,12 0,31 28

C.g./ S.c. 2 6,75 1,16 84 C.g./ P.t. 16 9,67 0,18 38

nue avec une concentration de 1,5 g de PVP par g de matiere fraiche de mycelium de P. tinctorius. Dans ces conditions, Ia valeur de l'ANR mesuree in vitro (5 pmol N0

3- h-1 g· 1 MF) est voisine de celle de l'ANR

in situ estimee auparavant pour cette es­pece fongique. La methode de mesure de l'ANR in vitro ainsi modifiee est utilisable pour eomparer les capacites d'assimilation du nitrate par les divers isolats mycorhizo­genes employes dans des essais de myco­rhization controlee des pins.

• Tolerance a Ia contrainte osmotique Le criblage d'une dizaine d'isolats d'es­

peces mycorhizogenes suivant leur capaci­te a tolercr une contrainte osmotiquc a etc realise en utilisant le glucose comme osmo­ticum. Les milieux de culture comprennent des concentrations croissantes en glucose,

a partir d'une concentration non li­mitante de 55 ml\1. Ces concentra­tions correspondent a des pressions osmotiques externes de - 0,14 MPa (milieu temoin), - 0,27, - 0,68 et - 1,36 MPa, respectivement. Sur le milieu le plus concentre en glucose, les mycelia de 4 especes mycorhizo­genes [ Rhizopogon roseolus, Suillus bellinii (lnz.) Watling, Pisolithus tinctorius et Suillus collinitus] ont une croissance significative et ajus­tent convenablement leur pression osmotique interne a celle du milieu ('l'n =- 1,2 a - 1,4 MPa). Au con­traire, aucune croissance des myce­lia d'Hebeloma edurum Metrod ex Bon et de Laccaria laccata (Scop. ex Fr.) Bk. & Br. n'est observee dans ces conditions (Mousain et al., 1992). Ce type de crihlage doit permettre d'orienter le choix d'isolats de cham­pignons utilisables en association my­corhizienne avec des pins mediter­raneens dans des conditions de forte contrainte hydrique.

Essais de mycorhization controlee de plants forestiers en pepiniere

L'optimisation de Ia production de biomasse mycclienne sur milieu so­tide sera recherchee par l'etude phy­siologique de Ia croissance du myce­lium de plusieurs especes mediter­raneennes (en collaboration avec l'Unite Fonctionnelle de Biotechno­logie de l'ORSTOM, Montpellicr). Le procede d'inclusion dans un gel d'al­ginate de calcium, eprouve pour quelques especes mycorhiziennes (Le Tacon et al., 1985 ; Mauperin et al., 1987; Kuek et al., 1992), necessite d'etre adaptc a des especes qui sont !'objet de nos recherches, en parti­culier Suillus collinitus et Rhizopo­gon rubescens. L'amelioration de Ia qualite technologique de !'inoculum mycclien devrait permettre d'allon-

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ger Ia periode de survie de !'inoculum dans le substrat de culture des arbres en conteneurs de maniere que le recou­vrement de Ia phase de receptivite des racines a !'infection par le champignon inocule soit accru.

La fertilisation minerale des plants forestiers cultives sur les substrats de pepiniere peut representer un facteur majeur de l'etablissement des mycorhi­zes. Ainsi, !'irrigation de pins pignons, par une solution nutritive 8.6,5.13 a 0,5% a Ia dose de 10 I m·2 semaine·', n'a permis Ia mycorhization que de 9 % des pins inocules par Suillus collinitus n° 9, contre 31 % pour des plants irri­gues par Ia meme solution a 0,1 % (Mousain et al., 1992).

Le controle de Ia mycorhization pose le probleme de Ia caracterisation des ec­tomycorhizes. La convergence morpho­logique et anatomique des mycorhizes est Ia regie pour de tres nombreuses es­peces fongiques, ce qui necessite Ia mise au point de methodes objectives, repro­ductibles et pratiques d'identification de ces organes. Les mycorhizes des genres Suillus (Boletacees), Gomphidius et Chroogomphus (Gomphidiacees) se ca­racterisent par Ia presence d'une cetone isoprenolde, Ia farnesylacetone (Berchil et al., 1991). A !'inverse, d'autres mar­queurs chimiques (suilline, polyols), cette molecule a ete detectee a Ia fois dans les carpophores et dans le myce­lium de 10 especcs de Suillus en culture in vitro ainsi que dans les mycorhizes engendrees par quelques-ones de ces es­peces sur des pins (Berchil et al., 1991). Par ailleurs, on recherche des isoenzy­mes caracteristiques des isolats d'inte­ret. Chaque zymogramme, obtenu apres revelation de 5 systemes cnzymatiqucs sur gel polyacrylamide-agarose, montre un polymorphismc qui pcrmet de dis­criminer les isolats etudics. La plupart des isoformes, prcsentcs dans le myce­lium en culture isolcc, sont aussi obscr-

vees dans les mycorhizes obtenues en conditions controlee!. sur lcs racines de Pin maritime. Ce polymorphismc enzy­matique pourrait etre couple a l'immu­nochimie pour permcttre Ia mise au point d'une methode pratique de detec­tion des mycorhizes etudiees. Une ap­proche moleculaire de cette caracteri­sation est aussi envisagee suivant Gar­des et al. (1991). Quelles que soient les techniques employees, Ia caracterisation objective des mycorhizes doit faciliter l'etude de Ia dynamique des populations mycorhiziennes et Ia valorisation des procedes de mycorhization controlee des arb res.

Effets des ectomycorhizes sur Ia crois­sance, Ia nutrition mim!rale et les echanges gazeux du Pin pignon en pepiniere

Trois des quatre isolats utilises pour inoculer des pins pignons en culture sur tourbe/perlite ont stimule Ia croissance de ces pins : apres 5 mois d'experience, Ia hauteur des pins pignons mycorhizes par Suillus collinitus n° 1 et 2 et par Rhizopogon roseolus n° 1 s'est accrue respectivement de 16 % et 8 % par rap­port aux temoins sans mycorhizes (Mou­sain et al., 1988). La mycorhization du Pin pignon par R. roseolus stimule a Ia fois Ia capacite d'assimilation du C0

2 par Ia plante-hote et l'efficience d'utili­sation de l'eau (assimilation de CO/ transpiration) a l'echelle instantanee, les echanges gazeux de C0

2 et H

20 ayant

ete mesures en periode hivernale. De plus, !'assimilation de C0

2 et Ia transpi­

ration sont couplees au niveau indivi­duel dans les pins pignons mycorhizes par les 3 isolats precedemment cites, ce qui se traduit par Ia constance du rap­port de ces deux parametres. Ce cou­plagc rcfli~tc une etroitc regulation de l'efficicncc de l'cau dans les pins myco­rhizes qui n'a pas etc obscrvec dans les pins non mycorhizcs (Guchl et al.,

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1990). Les mecanismes de !'augmenta­tion de Ia capacite photosynthetique des pins consecutivement a !'infection my­corhizienne sont en cours d'etude.

Dans unc autre experience, Ia fertili­sation minerale, Ia mycorhization par Pisolithus tinctorius n° 19 et l'interac­tion fertilisation x mycorhization ont un effet significatif (p < 0,05) sur Ia bio­masse des pins pignons : cette biomasse est plus Clevee dans les pins fertilises par une solution 8.6,5.13 employee a 0,5 o/o et dans les pins mycorhizes mais fertilises par Ia meme solution a 0,1 o/o que dans les pins non mycorhizes et non fertilises ou fertilises par Ia solution a 0,1 %. La mycorhization par P. tinctorius n° 19 associee a une fertilisa­tion tres moderee a done le meme effet sur Ia biomasse du pin pignon que }'ap­port aux temoins non mycorhizes d'une solution 5 fois plus concentree. Dans ces conditions, !'accumulation d'azote dans Ia plante n'est pas modifiee par Ia my­corhization, contrairement a l'accumu­lation de phosphore qui est favorisee par l'infection.

Etude ecophysiologique de boisements experimentaux

Les premiers resultats relatifs a des dispositifs incluant des plants mycorhi­zes, soit par des suspensions sporales

(Cedrus atlantica/Tuber albidum), soit par du mycelium d'isolats fongiques (Pi­nus pinea/Suillus collinitus), sont pre­sentcs dans le texte suivant.

• Dispositifs de Montaren-Saint-Me­diers (Gard)

Le taux de reprise de cedres de !'Atlas est augmente par Ia mycorhization avec T. albidum, apres 2 ans de plantation sur rendzine. Ce traitement stimule aus­si Ia croissance des arbres (Tableau 3). Les effets combines du niveau de ferti­lisation minerale et de Ia mycorhization par 1'. albidum en pepiniere sur le com­portement du Cedre sont etudies dans un deuxieme boisement etabli sur le site precedent, a Ia fm de l'automne 1992 : apres 1 an de plantation, seule Ia my­corhization par T. albidum a un effet positif sur Ia stimulation de croissance du Gdrc (Tableau 4).

• Dispositif de Petite-Camargue (Brasinvers)

Apres 3 ans de plantation sur areno­sol calcaire, les pins pignons mycorhi­zcs parS. collinitus (n° 2 et 9) et fertili­ses en pepiniere par Ia solution 8.6,5.13 a 0' 1 o/o ainsi que les pins temoins ferti­lises par Ia meme solution a 0,5 o/o ont une hauteur significativement supe­rieure (p < 0,05) a celle des pins temoins

Tableau 3.- Eifel de Ia mycorhization par Tuber albidum sur le taux de survie et Ia croissance du Cadre de I' Atlas en plantation sur rendzine (Montaren-Saint-Mediers). Les cadres ant ate inocules en pepiniare a l'aide d'une suspension de spores de Tuber albidum. Les taux de survie et les hauteurs moyennes des cadres mycorhizes ou non mycorhizes en pepiniare son! significativement differents a p = 0,05 (test de Scheffe).

Table 3.- Effect of the mycorrhizal infection with Tuber albidum on the survival rate and the growth of Atlas Cedar transplanted on rendzina (Montaren-Saint-Mediers). The cedars were inoculated in nursery using a suspen­sion of Tuber albidum spores. The survival rate and heights of the mycorrhizal or non mycorrhizal cedars were sign~icantly d~ferent at p = 0.05 (Scheffe's test).

Taux de reprise (%) Hauteur (em plante· 1)

Traitement

Apres I an Apr~s 2 ans Ap~s 2 ans A~s 3 ans

Ttmoins 70a 62 a 24,6 a 34,2 a

Mycorhizts 79b 70b 28,5 b 39,7 b

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Tableau 4.- Effets de Ia mycorhization par Tuber albidum at de Ia fertilisation sur Ia croissance du Cedre de I'Atlas apres 1 an de plantation sur rendzine (Montaren-Saint-Mediers). L'inoculation mycorhizienne est realisee en pepiniere par una suspension de spores de Tuber a/bidum. Traitements : cadres non mycorhizes, fertilises par una solution 11.6.12 (0,5 %) appliquee a Ia dose de 1 0 I m2 sa maine·' (TF) ou de 5 I m2 semaine·' (TF/2) ; cadres mycorhizes et fertilises en pepiniere (MF, MF/2). Las moyennes d'une meme colonne affectees d'une meme lettre ne sont pas significativement differentes (p < 0,05) (d'apres le test de comparaison multiple de Scheff e).

Table 4.- Effects of the mycorrhizal infection with Tuber a/bidum and the fertilization on the groW1h of Atlas Cedar alter one year on rendzina (Montaren-Saint-M9diers). The mycorrhizal inoculation was performed in nursery using a suspension of Tuber a/bidum spores. Treatments : non mycorrhizal cedars, fertilized with a 11.6.12 solution (0,5 %) applied at 10 I m 2 week·' (TF) ou de 5 I m 2 week·' (TF/2) ; mycorrhizal cedars fertilized in nursery (MF, MF/2). Means within a column not sharing a common letter differ sign~icantly (p < 0.05) (by Scheffe's mu~iple comparison test).

Traitement Hauteur Accroissement (em p1ante-1) (em p1ante-1)

TF/2 25,2 a

TF 26,2 ab

MF/2 28,2 b

MF 28,2 b

non fertilises ou fertilises par la solu­tion 8.6,5.13 a 0,1 o/o (environ 50 em plante-1 contre 40 em plante·' ). De plus, l'accroissement de taille depuis la sortie de la pepiniere est plus grand pour les pins mycorhizes par S. collinitus que pour les pins non mycorhizes a regime de fertilisation identique (30 em plante·' contre 26 em plante·') (Mousain et al., 1993).

Cet essai suggere que la mycorhiza­tion controlee du Pin Pignon par des isolats fongiques efficaces, associee a une fertilisation tres moderee, peut etre aussi henefique pour la croissance initiale des arhres dans des sols sahleux deficitaires en eau et en elements nutritifs qu'une fertilisation en pepiniere avec une solution 5 fois plus con­centree.

L'etude ecophysiologique des boise­ments experimentaux devra etre com­pletee par celle de Ia dynamique des especes mycorhiziennes dans le but de s'assurer de Ia survie des mycorhizes introduites dans les milieux de trans­plantation. L'approche moleculaire de

12,2 a

11,4 a

15,5 b

15,3 b

cette etude ecologique a etc entreprise sur des echantillons de mycorhizes pre­levees sur les pins pignons du dispositif de Brasinvers (en collaboration avec M. Gardes, Universite de Californie, Berkeley).

CONCLUSION

Les effets henefiques de l'ectomycorhi­zation sur la croissance et la nutrition des arhres forestiers dependent des con­ditions de milieux et de l'identite des partenaires, au niveau specifique et in­fraspecifique. L'utilisation de la myco­rhization controlee des arhres en pepi­niere pour le rehoisement en region mediterraneenne necessite, par conse­quent, de cribler des isolats mycorhizo­genes efficaces, competitifs et adaptes aux sites de reboisement, de produire massivement de l'inoculum mycorhizo­gene, de determiner les conditions opti­males de l'infcction mycorhizienne et de mettre au point des methodes objecti­ves et reproductihles de caracterisation des mycorhizes obtenues en pepiniere.

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J usqu'a present, seulc Ia variabilitc na­turelle des isolats sauvagcs a cte utilisce comme base de selection. Dans l'avenir, cctte base pourra etre elargie par !'uti­lisation de Ia reproduction scxuee des champignons mycorhiziens (Lamhame­di et al., 1991 ; Meyssellc et al., 1991 ... ), voire des manipulations gene­tiques.

Remerciements · Les recherches cleveloppees dans le texte precedent ant beneficia de !'aide de I'ANVAR Languedoc-Roussillon (1988-1991) et de celle de Ia Communaute europeenne et des Chambres regionales d'Agriculture de Languedoc-Roussillon et de Provence­Alpes-COte d'Azur, dans le cadre des Programmes ln­tegres Mediterraneens ( 1988-1992). Elles se poursui­vent depuis 1990 avec le soutien du Ministere de !'Agri­culture et de Ia Peche dans le cadre de Ia Convention INRAJOERF relative au Conservatoire de Ia Foret Me­drterraneenne.

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