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m~A 23402

Sur la structure du polysaccharide des Cires D d'une souche humaine

virulente de Mycobacterium Tuberculosis*

Les inycobact6ries contiennent une fraction, soluble dans le chlorofornle, in- soluble dans l'ac6tone bouillante, appelde t i re D (bibl. I). Les Cires D de souches bovines, aviaires ou saprophytes sont essentiellement des glycolipides contenant des acides mycoliques est6rifids par un polysaccharide compos6 de l~-arabinose, de D- galactose et de r~-mannose 2-4. Les Cires D de Mycobacterium tuberculosis var. hominis contiennent, en plus, une partie mucopeptidique qui ]ibbre par hydrolyse, de la glucos- amine, de la galactosamine, de l'acide muramique, de l'acide m6so-e,~'-diamino- pim~lique, de l'acide glutamique et de l'alanine '~-7. La pr6sence de ce peptide semble indispensable /t l'activitd adjuvante, exerc6e par les Cires D (bibl. 8--lO). Seule la partie peptidique qui contient les trois acides aminds en proportions approximatives 2:2:3 a dt6 dtudi~.e de plus prb.s. L'hydrolyse alcaline scinde les Cires D des souches humaines en partie lipidique et en un peptidoglycosaminoglycane hydrosoluble, ce qui semble indiquer une liaison ester entre ces deux constituants. L'enchainement suivant des divers constituants des Cires D a dtd propos6 ~:

Acides m y c o l i q u e s l ia ison l ia ison - - --~ p o l y s a c c h a r i d e . . . . . ~ suc res a m i n d s - - ~ p e p t i d e s e s t e r g l y c o s i d i q u e

Nous avons entrepris l'6tude du polysaccharide des Cires D d'une souche humaine virallente (souche Pr6vois, Institut Pasteur, Paris) et rapportons quelques r6sultats indiquant qu'il s'agit d'un arabinogalaetane.

Les (;ires D sont extraites par ]e chloroforme 5. partir des bacilles pr6alablenmnt ddlipidds par le mdlange alcool-6ther (I: ~); elles sont purifi~.es par chromatographies successives sur silicate de Mg--cdlite (2:1) et par pr6cipitation de leur solution chloro- fomlique au moyen d'acdtone et de m6thanol 5& Les chromatographies en couche mince dans (I) chlorofomm--m6thanol-cau (I4:6: t), (2) dther de pdtrole--~.ther (9: 1), permettent de contr61er qu'elles ne sont pas contamin6es par des phospholipides, par le cord factor, ou par des acides mycoliques libres. Les hydrolyses acides totales du polysaccharide sont effectudes par HC1 2 M it IOO ° pendant 6--8 h e t les hydrolyses partielles par H.,SO 4 o.oo5 3'I pendant 1--2 h /1 Ioo °. Les sucres libres et mdthyl6s sont chromatographids sur papier Whatman No. I (chromatographic analytique) et Whatman No. 3 (chromatographie prdparative) dans les solvants: (a) butanol--acide ac6tique- H20 (4: 1:5) ; (b) butanol-pyridine - H20 (5:3: 2) ; (c) butanol--dthanol- H20 (5:1:4); (d) butanol-dthanol--NH4OH--H20 (4o: io: I:49), technique ascen- dante; (e) ac6tate d 'dthyle-pyridine-H,20, saturd ~ l'acidc borique (6o :25:2o ).

Les r6vdlations utilis~es sont: (I) le trichloroacdtate de dimdthylaniline ~l, r~v61ation sp6citique des sucres partiellement mdthylds; (2) le phtalate d'anilineV'; (3) AgNO:~ alcalin. Les pentoses et hexoses m6thylds donnent des colorations diff6- rentes, pourpre et brun, respectiw.~ment, l.es osamines sont dos~es selon la m6thode Elson--Morgan, modifide par RIMI-XGTON la et calcul6es en glucosamine. Les sucres

" r o 8 6 m e c o m m u n i c a t i o n s u r les c o n s t i t u a n t s des .Mycobac tdr ies ; IoTe c o m m . , vo i r M. GUI~.RZN, R. AZERAI~ ET I';. L~;D~;R~:~¢, Bull. 5oc. Chim. ]lelge, sous presse .

Biochim. Biophys. Acia, 158 ( i968) 1 4 7 - i 5 o

14N sH(li,ffl" ('().',[7~[-t;N I ( I A I i ( } ) , ' S

m~utrc~ sont dc~d~ par In m d t h , d e an ph'~n~i-.H.,~(),, (!)ibL r4). L~'~ protsorti,'::~ d'arabin(~se ~t de gahu:tose !ibrt'~ ct n tdth\ lSs ~(mt d(' termin(. '~ ~q.)ff.s leur dlu:io~ du papier. ].'cfluti~ui des sucres lil;re.s (:st faitc par }'eau distil]dr, :'Hie des sucres mdthylds, par le mdlange acd tmlc -H~( ) . Les soluti(;ns sont ensube flltrc~es stir w~rre frittd et les (h.;sages efEvctueSs (,.n 1)rdsence des t(:moins; des dcba~Ailhu's at~thvntiquc.~ mdthvlds .-.out utilisds pour la courl)(: s t anda rd des sucres mdth\ ' lds. Ix~ glycdrol t't le thr~itol scrit &~sds d~a!emcnt apr~,s lt:ur sdparati~m sur p;,pier, su i \ i e d',~xx'd.:ditm periodiquc, scion ia mdthode ut i l i sant l ' ac ide chrom.~tr~pique:: ' .

25o mg de ( ' ires 1) ~ont mis ~'n snspensi(m dans ~o ml de 11(] o.I 1i ~t main(orals en contact , sou.~ agi ta t ion , pendan t 8 jours ,'~ 37:" (bibl. I7). I.. °. mdlangv rdactic~mwl cst cnsni te ex t ra i t par le chloroforn~e ; I;t phase organiquc,, apr(,s c()ncentrath)n, f~)n',nit I8o mg de produi t . I.a d u o m a t o g r a p h i c sur S g (l 'acide siliciquc~ -~:d!ite ('): r) tx:ru,,ct d ' ob tcn i r environ 45 mg de substance dlude par h~ chh~rt~fc~rm(- con tenan t 5 et r(~"i) de mdthanol . {;ette substance vst purifi(.'c par chromatograt)hiv cn ",roche. mince p r@ara t ivc , clans le S~lvant (~), RF o.65. Nous obt¢~nons [:>. mg de m\ 'c~latcs d ' iwabinose.

Ioo :ng de ( ' ires D scmt dissous clans 4 m! de. benzbne et addi t ionnds (le 3 nil dc potasse mdthanoliqu(.' ~ 5 <'.~,. "\P K~.s c.hauffage "t reihix pendan t ~ 1'.., :):l a!oute de l 'eau et neutral ise le mdlange r( 'actionne! par le I)m\,(~x-5o (tt~). [.a !)hase orgauiquv (:ontient 5 ° mg d 'ac ides mycoliques. I/hvdros(~lublv. est conce:ltrd s(.ms e.o 5 ',nm {- 3 °` et fmirnit environ 45 mg de ~t:bstance, ~ ~) - 2() ~ (1[,.,(), c = o.q~, (:, 3q-~fi It , (~-~5;

N, ~.56 "i,*. ~oo mg de t>olysac(:haride sont c.liss(>us dans [ m[ d ' eau (~t addith)nnds (i(~ 3 'n:!

de solution aqucuse de sou(le a 3o %. Puis, ,)n a]outc, goutte. 5 g(~utte, s~ms agi ta t ion 8 ml dc sulfate de. m d t h \ l e ct i5 ml dc s~ude "5 3 ° %. Aprils 2 h, on aj,~utc encore 3 g, de sou(te en past i l les et 6 ',nl de sulfate, de i'..~dthvh:. On laisse cn c()ntact ")(} h i~ !a t empdra tu rc ambian te et ~m @uise. i',~ mdlange r~actionnel au chlorof(~rme. I .a t)]~asc (:hloroformiqu~' cst ensuite, i/prAs dvap(xati()n du ~olvant, rcmdthvld~ par !e ~CH:; erl prdsence d':Xg.,O l)endant 7 z h (4 ml (!e ICtt:t et 1.6 g (l ' . \g~() sont aj(mtds c r 2 lois) ct fonrnit 75 lllg dc polysacchar id( ' permdthyld (le spectre, il?frarou~v i1(" t)rdsente plus de ban(Iv ()H).

~o m,, du l )oh 'saccharidc sont (~xvdds par ro ml (lc l)eri(xtale (iv sou(iv o.oa M pendan t [4o h /~ l 'obscuri td, i,'cxcb, s d(~ rdm'ti[ est d~trui t par l ' ; :ddi l ion d'dth'd&~( ...... glycol. EnsuRe, l ' ioda te de soudc est pr~(:ii)itd h o ° pa r l '&hano! et fihrd. I.(' p rodui t d%xvda t ion est chr(miatograt)hi~ sur t)al)ier, aprbs conccntrat i( ;n de llt phase aqueusc, dans Ie Solvant (a), te(:l,,ni(tm; desce:xlantv. Un i,(:hautillon analog~Ic est ~oun'ds "~ l ' oxyda t ion t)eri(xtique (-omme ci-(tessus ct ensuite ]a solut ion aqueusc (~st a(.h!itionn~ ( de 2o mg (te NaBIIa . Apr0s une mii t h ia t empdra tu re ami)iante, la solution cst trai t6e par le Dowex-5o (11') ct ddbarrass&~ du borate par rival)orations s~):ls vide ave( du indthanol, l.e produi t de r&iuc t i , n ('st hydrol>'sd par HC1 z .~.t t )cndant 4 h "i ~ o o e~t chr()matogmphi4 sur pat',ier clans I~s Solvants (a) et (c).

Les ('ire~ D de. la souche humaine vhullente, Prdvois, F. ~8~ . :84: , .:~ji) z - " (CHCIa, c - - , o.~), cont iennent e.nvir()tl 5o°.£, d 'ac ides mycoti(iues, 3o?6 de sucres neutres : arabino.se et galactose, uniqucment , 1.8 °i) d 'osamines e.t e1:viron # ?.b d'acide.s aminds. I . ' hydro lysc alcaline des Cites l) h'.s scinde en p a d iv.s ~thfiro- et hydr()s-flubles,

" ba pattie h)'drosolubh: contient mi rdalitd une faible fraction peptidiquc,, (ltm nous alh)~:s ndgliger darts l'dtude dn polysaccharide.

I ; i o c k i m . l:;iopk3's. A cta, 15 ?, ( I 9 6 8 ) l, t 7 t 5c;

SHORT COMMUNICATIONS 149

ce qui permet d ' a t t r i bue r une liaison ester entre ces deux fractions 1. L'hydrolyse acide rndnag~e permet d'isoler un mycola te d 'arabinose, F. 43-46°, dont le spectre infra rouge identique ~ celui publi~ par des auteurs japonais ~6, montre , entre autres, une bande ester & 1735 cin -1. Soumis aux hydrolyses alcaline ou acide, ce glycolipide fournit de l 'acide mycolique (identifi6 par chromatographie en couche mince) et ,ie l 'arabinose uniquement . Sa teneur en arabinose dtant de Io %,, il s 'agi t d 'un glvco- lipide dans lequel une moldcule d 'acide mycolique estdritie une moldcule d 'arabinose. Le myeola te d 'a rabinose a dtd ddj~ isold par Azr,x~A, KIMUI~:~ ET YA.~.IAMI:I~A l~ ~ par t i r des lipides lids et des (.;ires D de la souehe humaine Aoyama B e t sa s t ructure d4- montrde comme dtant un 5-mvcolate d 'arabinose. ACHARYA, SENN ET LI~.DEREI0 8 ont pu ot)tenir ,~ par t i r des rdsidus bacillaires du BCG et de Mycobacterium kansasii le mr}me glycolipide et Font caractfirisd par la spectrom4trie de masse. Ces rdsultats semblent i)rouver la g4ndralitd de la liaison ester entre les acides mycoliques et l ' a rabinose dans les parois et dans les Cires D des Mycobactfr ies .

l ) l iydrolyse acide mdnagde du polysaccharide, [c~ l) 4-. 26~, obtenu par saponi- tication des (;ires D, lib4~re uniquement de l 'arabinosc, ce qui indique sa position terminale et est en accord avee sa prdsence sous forme furanosique. L 'hvdrolvse totale du polysaecharide fournit de l 'arabinose et du galaetose en proport ions approx. 5:2. La permdthylat ion, suivie d 'hydrolyse acide, perme.t d 'obteni r : le 2,3,5-tri-O-mdthyl arabinose (Re o.So, Solvant (c)) o. 9 tool; le 2,3-di-0-m~thyl arabinose (Rl,, o.58, Solvant (c)) 2. 7 tool; un ddrivd monomfithvld d 'arabinose, non identifid (Rj,. o.4o, Solvant (c)) ~.I tool; le 2,3,6-tr i-0-m6thyl galactose (RF <).65, Solvant (c)} 1.8 ll'lo]. I.es sucres indthyl(!s ont ~.td identifids, soit par leur RF sur papier, en co-chromato- graphic avcc les &hant i l lons authentiques, soit par la rdvdlation sp~cifique. Ainsi, le t r ichloroacdtate d 'anil ine perlnet de distinguer entre le 2,3,4- et le 2,3,6-tri-O- mdthvl galactose: seul le dernier ddrivd se rdv~de par ee rdactif.

L ' examen des produits de mdthylat ion semble indiquer que le polysaccharide des (;ires I) est compos~, par un arabinogalaetane dans lequel les unitds d 'arabinose et de galactose sont lifies dans le mbme t)olym~re, l . 'ob tent ion du 2,3,5-tr i-0-m~thyl arabinose eonsti tue une preuve suppldmentaire quant ~t la position ternlinale d 'une inolficule d 'arabinose qui ferait part ie d 'une eha'~ne contenant environ 7 unitfis. Les unitds d 'a rabinose son< li~es par une liaison glycosidique I -+ 5, tandis que celles du galactose sont lides en I -> 4. L 'oxyda t ion periodique effeetude sur le polysaccharide permet de re t rouver uniquement une faible quanti td de l 'arabinose intact (environ 5 %). l.'oxydation periodique, suivie de rdduetion par le N a B H 4 permet d' identifier par la chromatographie sur papier, clans les Solvants (a) et (e), en plus de l 'arabinose, le glycdrol (R].. o.45 ) et le thrditol (RF o.3r). Leur dosage indique 2.8 mol de glycdrol pour 1.5 tool du thrditol. Le glycerol provicnt de l 'arabinose terminal et des r~sidus lids en t > 5, tandis que le galactose lid en I - - 4 donne du thrditol. Cette expdrienee permet de contirmer les rfisultats de la perm~.thylation.

Un arabinogalac tane prdsentant de grandes analogies de s t ructure avec eelui que nous ddcrivons a ~td isold, accompagnd d 'un glucane, par MIs;\Kt ET Yt;KAWA 1"~ h par t i r des parois du BCG. D ' au t r e part, HAWORTH, KENT ~;'I" STaCE¥ '0 on< ddcrit un polysaccharide "lid aux lipides" obtenu par l 'extraet ion de M. tuberculosis par l 'ur~e et l ' t lydrolyse alealine de ces extraits . Ce. polysaceharide contient, en plus de l ' a rabinofuranose et du galactot)yranose, environ x 5 % de mannopyranose et 8 %. de glucosamine.

Hiochi'~. l~iophys. Acta, 158 (1968) i47-.15o

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X o u s re .merci(ms t r~s vive.),:~ent M. le P r c f e s s e u r E. LI-;t)ERt-;b: t)o:~.r !'int~'K"t

t d m o i g n 6 5 ce t r a v a i l . Ce t r a v a i l a l%ndfici,! d'u..ne, ai<ic f inanc i6 re de [ 'Organ i sa t io i ; Mond ia l e d.e ia

S a n t d ( ( ; en6ve) .

I n s t i t u t de C h i m i e des Subs tances .Vaturd les , C . N . R . S . , Ei~.x~. \.:z.).i~=~s

Gi f - sur -Yve t t e , Essone (France) .]V.AX X~.-MARII ~. D~zr,xu.m.:-x¥ C . L A U r ) I N E ~'..X C . \ 5 C H

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R e ~ u le 8 d d c e m b r e , I967

B i o c h i m . t~ i<)phy .~ . : lda , [ 5 8 (19 ' )8) I 4 7 - 1 5 o

BI~A 234O3

The effect of serum hyaluronidase on acidic polysaccharides and its activity

in cancer

H y a l u r o n i c acid , wl!en i r i c u b a t e d w i t h h u m a n ~e rmn ill t h e p t t r ang( ' fr,,m~

3 to 5, u n d e r g o c ~ i r r e v e r s i b l e d(~gradati<m. P a s t w o r k f rom tb.is l a b o r a t o r y ha s sh(>wn

th i s r e a c t i o n to be o x y g e n ind- 'pe .nden t ~. : \ g r e a t n u m b ( ' r - f s r b s t a n ( ' e s o t h e r t h a n e n z y m e s , for e x a m p l e a sco rb i c acid: ( ;?stein; ' , i ron a n d c o p p e r ions, also i r r e v e r s i b i y

d e p o l y m e r i z e h y a l u r o n i c a(:id a, t h e s e n o n e n z y m i c degrada t i (~ns r e q u i r i n g m<;le(:uiar

oxygen: ' . Seve ra l (~ther ac id ic poly.~a(-(-harides (algilfic acid a n d l>cctin a re the mos~

sens i t ive ) were f o u n d to be d e g r a d e d b y s imi la r , b u t o x y g e n - d e p e n d e n t , m c c h a n i ~ m ~ ~.

T h e p r e s e n t work on t h e c o m p a r a t i v e effect <>f s e r u m on h y a l u r o n i c , a lginic , a n d

pe.ctic ac ids was u n d e r t a k e n in o r d e r to d e t e r m i n e w h e t h e r th i s degradati<r..} oi:

h v a l u r o n i c ac id is e l l z v l I ' , . i c o r o f S ( ) l i l e ( ) t i l e r l l a t l l Y C .

"I'iie h y a l u r o n i c ac id used in th i s s t u d y was -so la ted f rom b(~vine s y n o v i a l fluid

a c c o r d i n g to at p r e v i o u s l y d e s c r i b e d p r o c e d u r e a. T h e p r o t e i n conte~)t of t h e p r e p a r a l i o n

was less t h a n .3 %, a n d i ts l>) , m e a s u r e d in o.2 .M p h o s p h a t e buf fe r (pH 7.3?, was