Dr. Khadir Abdelmounaim,

TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella

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TD 1 : Les différents types de

milieux de culture.

Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier,

il doit donc satisfaire aux exigences nutritives (une source d’énergie, de carbone, d’azote les ions

essentiels : calcium, sulfate…. ) et physique ( ph , température , l’eau , l’isotonie ) du microorganisme

étudié.

On classe les milieux de culture :

1. Selon leur consistance :

Milieu liquide : ne contenant pas l’agar agar par ex : bouillon nutritif, la croissance se traduit

par un trouble ou des dépôts et des voiles superficiels.

Exemple : bouillon nutritif BN, Bouillon trypticase soja (TSB), Brain-Heart Infusion Broth

BHIB ect…

Milieu solide : On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide.

Le gélifiant le plus utilisé est l’agar-agar ou gélose : il s’agit d’un polygalactoside sulfaté

présentant la propriété de former avec l’eau un gel solide à une température inférieure à environ

60 °C tout en étant liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion (liquide) jusqu’aux

environs de 45°C. D’autre part, très peu de micro-organismes sont capables d’hydrolyser l’agar.

Les milieux solides contenant généralement 1.5-2% (15-20 g.L-1) d’agar agar ; ils peuvent

s’utiliser de plusieurs façons : gélose inclinée en tubes à essai, culot en tube droit ou couche

mince en boites de pétri. la croissance des microorganismes se traduit par la formation des

colonies exemple Gélose nutritive GN, Gélose trypticase soja (TSA), gélose Mac Conkey,

Gélose Muller-Hinton etc.

Milieu semi-solide : contenant 0.5-0.75 (5-7,5 g.L-1) % d’agar agar, exemple ; hugh et Leifson,

viande foie…

2. Selon leur composition :

On distingue 2 types de milieux :

Les milieux complexes ou empiriques : De composition complexe, mal définie, ils peuvent être

:

-d'origine animale : lait, sérum, bouillon et gélose nutritive, gélatine, etc.

-d’origine végétale : peptone de soja, pomme de terre, etc. exemple de milieux ; Gassner,

Tryptycase soja, gélose au Chocolat, gélose au sang, etc.

Les milieux synthétiques ou définis : dans lesquels tous les composants sont connus

qualitativement et quantitativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour l’étude des bactéries

autotrophes (non exigeantes) ou pour étudier les besoins nutritifs d’un germe. Ils sont rarement

utilisés en routine à l’exception de quelques-uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen,

Urée-Tryptophane.

3. Selon leur utilisation : On distingue en général 4 types principaux de milieux :

A- Milieux de-base ; appelés aussi milieux usuels non sélectifs, on regroupe sous ce vocable tous les

milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en général de préparation assez simple et

généralement peu coûteuse, ces milieux contiennent une base nutritive constituée de molécules azotées

(acides aminés, molécules organiques diverses…) provenant de l’hydrolyse de produit d’origine vivante

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(animale, végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits de viande ou de levure exemple gélose et

Bouillon nutritif, gélose et Bouillon Muller-Hinton .

B- Milieux d'isolement ; ils peuvent être, suivant les techniques envisagées et les bactéries en cause

soit ;

Des milieux non sélectifs enrichis ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des

liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide d’ascite,

de l’extrait globulaire, des suppléments polyvitaminiques… Les qualités nutritives peuvent être

améliorées par dénaturation thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la

pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais

ou au sang cuit, et la gélose chocolat. Exemple Les géloses au sang frais et chocolat, l’addition de sang

au milieu de base peut avoir plusieurs buts : apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-

organisme étudié.

Des milieux sélectifs, destinés à favoriser la croissance d'une ou plusieurs espèces bactériennes

particulières en empêchant la culture d’autres micro-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui

inhibent la croissance des micro-organismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte

concentration, le thiosulfate de sodium, le cristal violet ou certains antibiotiques, etc.Les éléments

ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-organisme recherché. Ces milieux sont

utilisés pour l'analyse d'un prélèvement polybactérien.

Exemples de milieux sélectifs :

milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles (Shigella s'y développe moins vite :

environ 48 à 72 heures avant d'obtenir une culture exploitable).

Milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes (Candida).

gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la pousse des

bactéries à Gram positif (action de la vancomycine) et de la plupart des entérobactéries (action de

la Kanamycine). Sur ce milieu, poussent préférentiellement des bactéries anaérobies strictes.

Milieux différentiels

Le milieu de culture dit différentiel ou milieu d'identification indicateur permet de distinguer deux types

de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu met en évidence certaines

caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l'aptitude à dégrader un substrat)

en présence d'indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs colorés de pH ou d'oxydo-réduction

(tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le bleu de méthylène).

Exemple Gélose Mac conkey : La gélose Mac Conkey est un milieu sélectif et différentiel au même

temps utilisé pour l'isolement des entérobactéries. En effet, elle contient des agents sélectifs qui

freinent le développement des bactéries à Gram positif: cristal violet et sels biliaires. Il est également

différentiel puisqu’il permet L'orientation de l'identification qui est basée sur l'utilisation du lactose,

repérable grâce à 1 indicateur de pH (rouge neutre) les colonies de E coli apparaissent en rouge, car ce

sont des lactoses + tandis que les autres colonies lac — apparaissent incolores.

La Gélose Chapman (MSA), milieu sélectif des staphylocoques qui différencie la fermentation du

mannitol permettant une orientation entre autres vers Staphylococcus aureus.

Le milieu hugh et Leifson est un milieu semi-solide qui permet de déterminer la voie métabolique

empruntée par les différentes espèces bactériennes oxydative ou fermentative, il permet aussi de

déterminer "la voie d'attaque du glucose".

Le milieu viande foie ; c’est un milieu semi-solide, ce milieu est principalement utilisé dans longs

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tubes fins « tube de prévôt » pour la détermination du type respiratoire des micro-organismes, mais aussi

pour la culture de germes anaérobies stricts telles que les Clostridium).

Le Mannitol-Mobilité-Nitrate est un milieu semi-solide de culture caractérisé par l'utilisation

de mannitol et de Nitrate et permet la mise en évidence (ou non) de la mobilité bactérienne.

Milieux chromogènes ou discriminants

Ce milieu peut être sélectif ou non. Son principe repose sur la présence d'un ou plusieurs substrats (s)

couplés (s) à une molécule chromogène. Lorsque ce substrat est métabolisé par une enzyme bactérienne

spécifique, le chromogène associé prend une couleur particulière (il devient un chromophore)

directement lisible sur la colonie. Si l'enzyme n'existe que chez une espèce bactérienne donnée,

l'identification est immédiate. Exemple gélose MRSA-ID qui permet de détecter directement les souches

de Staphylococccus aureus résistantes à la méticilline.

Principaux ingrédients des milieux de cultures

Constituants Caractéristiques Fonction

Extraits de viandes.

A partir de tissus animaux sélectionnés (à

froid : macération; à chaud: infusion, extraits

de viandes).

Source de protéines peu

dégradées, glucides, sels

minéraux, vitamines

hydrosoluble. (vitamine B).

Peptone

Résultats d’action d’enzymes protéolytiques

(pancréatine, pepsine, trypsine, papaïne) sur

des matières protéiques (viande, caséine,

soja, gélatine…)

Source d‘acides aminés et des

oligopeptides.

Hydrolysats Action d’acide

protéines.

chlorhydriques sur des Source d’acides aminés et des

ions minéraux.

Agar-agar ou gélose Extrait d’algue rouge. Mélange de 2 groupes

de polysaccharides (agarose 70% et

agaropectine 30%). A 90°C se dissout dans

l’eau, à 45°C reste en surfusion et à basse

température elle forme un gel transparent

+/- solide.

Solidifier

cultures.

les

milieux de

Produits biologiques Sang, sérum, lait, gélatine, pomme de terre,

etc.

molécules

diverses

organiques

Base minérale

Macroéléments ioniques (Na+, K+, Mg2+,

Ca2+, Cl-, PO4-2, SO4

-2, HCO3-…).

Microéléments ioniques ou oligoéléments

(Fe, Co, Ti, Zn, Cu, B, Se, Mo, V, W, Mn.)

Apportent l’équilibre

électrique, l’équilibre

osmotique, fonctionnement

enzymatique.

Eau distillée.

a) Exemple 1 : gélose nutritive

Constituant Quantité Fonction

Peptone 5g

Extrait de viande 1g

Extrait de levure 2g

Chlorure de sodium 5g

Agar-agar 15g

pH final à 25°C : pH 6,8± 7

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a) Exemple 2 : Hajna Et Kligler

Constituant Quantité Fonction

Peptone 15 g

Extrait de viande 3 g

Extrait de levure 3 g

Peptone pepsique de viande 5 g

Glucose 1 g

Lactose 10 g

Rouge de phénol 25 mg

Chlorure de sodium 5 g

Sulfate ferreux 0,2 g

Thiosulfate de sodium 0,3 g

Agar-agar 15 g

Exercice :

Un microbiologiste veut faire préparer une gélose dite de Müller-Hinton. Cependant, dans son

laboratoire il n’a que le bouillon de Müller-Hinton. Un de ses collègues lui proposa d’ajouter un

ingrédient qui lui permettra d’obtenir une gélose à partir de ce bouillon.

1) quel est cet ingrédient ?

2) Combien de grammes doit-il ajouter pour la préparation d’un litre de cette gélose ?

3) Parmi les constituants des milieux de culture, les extraits de levures et les peptones ;

a. Comment peut-on obtenir ces composés ?

b. de quoi sont-ils constitués ?

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TD N° 02 : Techniques d’ensemencement, de purification

des bactéries et croissance bactérienne

Les microorganismes coexistent en populations mélangées dans les différents environnements

(naturelles, hospitaliers, commensales, ect.) Exemples ; centaines d’espèces de bactéries différentes

colonisent le tractus intestinal de l’être humain. Dans le sol on peut trouver de 108 jusqu’à 109 bactéries

par grammes de terre constituée de plusieurs espèces de bactéries et de champignons. Les analyses de

prélèvements pathologiques du milieu hospitalier donnent généralement des cultures polymicrobiennes.

Ceci pose un problème pour les microbiologistes, car on ne peut jamais étudier plusieurs espèces

microbiennes à la fois d’où la nécessité de séparer chaque espèce microbienne des autres par des

techniques d’isolement et de purification, ces techniques sont basés aussi sur la maitrise des techniques

de base d’ensemencement.

Termes importants :

Ensemencement ou inoculation en microbiologie : introduire un inoculum bactérien dans un milieu de

culture stérile (bouillon ou gélose, ect.) À l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une anse de platine, ect.

Inoculum : Échantillon ou bien quantité de microorganismes prélevés à partir d’une culture

mère, destinée à ensemencer (inoculé) au sein d’un milieu de culture favorable à sa multiplication.

L’isolement : Consiste à des ensemencements sur des milieux de culture dans un but de séparation de

façon à obtenir des colonies bien distinctes.

Repiquage : réensemencement de culture pure dans un milieu de culture neuf.

La différence entre « Espèce » et « souche » : Une souche est une partie d'une espèce bactérienne, mais

elle est différente des autres bactéries de la même espèce par une différence mineure, mais identifiable.

1- Techniques d’ensemencement :

Ensemencement d’un bouillon de culture: Dissociation dans un milieu liquide une colonie bactérienne

prélevée avec l’anse de platine.

Ensemencement par stries des milieux gélosés : L’inoculum est déposé sur un milieu gélosé, ensuite on

essuie soigneusement le file de platine ou la boucle de la pipette pasteur sur la surface de la gélose cette

méthode se fait dans le cas des géloses coulées dans des boites de pétri ou bien les géloses inclinées en

tubes à essai.

Ensemencement par inondation (en nappe) : On inonde la surface du milieu gélosé en boite de pétri par

l’inoculum et on le réparti uniformément par étalement à l’aide d’un étaloir ou râteau stérile ensuite on

ré-aspire l’excès d’inoculum ; et on met à sécher à l’étuve pendant quelques minutes à 37°C. (Ex. test

antibiogramme CASFM).

Ensemencement dans la masse : Dans cette méthode l’inoculum est mélangé avec le milieu gélosé avant

solidification de ce dernier c’est-à-dire lorsqu’il est dans un état de surfusion (T° 48-45°), cette méthode

est utilisée pour le dénombrement bactérien.

Ensemencement par spots : l’inoculum concentré est déposé sur une petite surface de milieu (quelques

millimètres de diamètres) cette technique permet de faire plusieurs essais de cultures sur la même boite

(ex tester plusieurs souches).

Ensemencement par piqure centrale : elle se fait généralement sur des tubes contenant un milieu gélosé

en introduisant la pipette pasteur chargé de l’inoculum verticalement au fond de tube, exemple

ensemencement du milieu mannitol-mobilité.

Ensemencement par écouvillonnage : Tremper un écouvillon stérile dans une solution ou une suspension

bactrienne puis ensemencer la surface de la gélose. (Ex. test antibiogramme CLSI).

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2- Techniques d’isolement :

Technique d’isolement par épuisement en quatre secteurs ou cadrans:

Cette technique permet de séparer les divers micro-organismes contenus dans le prélèvement

initial.

Un isolement peut être envisagé pour: séparer des micro-organismes différents au sein d'un mélange,

purifier une souche contaminée ou contrôler sa pureté :

1- Tracer sur le fond extérieur de la boite de pétri gélosé deux diamètres perpendiculaires

divisant la boite en quatre secteurs.

2- Déposer l’inoculum près d’un bord de la moitié de la boîte correspondante aux cadrans 1 et 2

3- Étaler ce dépôt en réalisant des stries très serrées dans la moitié de la boite (cadrans 1et 2).

4- Stérilisation de l’instrument d’étalement.

5- Après avoir fait tourner la boîte d’environ 90°, étaler une partie des stries précédentes sur la

moitié correspondant aux quadrants 2 et 3.

6- Stérilisation de l’instrument d’étalement.

7- Après avoir fait tourner la boîte d’environ 90°, répéter une dernière fois l'étalement en stries

serrées dans la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4.

Technique d’isolement par épuisement par trois secteurs ou cadrans :

Cette technique s’effectue en trois étapes, la boite de pétri est divisé en trois cadrans, le premier tiers de

la boite est ensemencé en balayant avec l’anse la surface de la gélose de lignes non chevauchantes,

l’anse est stérilisée et refroidie, l’ensemencement du deuxième tiers est réaliser en empiétant

légèrement avec l’anse le premier cadran afin d’obtenir quelques cellules qui seront étalées dans le

second. La répétition de cette procédure sur le troisième secteur.

Technique de dilution successive :

L’isolement des bactéries à partir d’une culture gélosé semble parfois difficile à cause de la charge

microbienne importante il en résulte une surface de la boite de pétrie pleine de colonies collées les unes

avec les autres cela empêche l’apparition des colonies distinctes facile à réensemencer et donc nécessite

des dilutions du produit à analyser. Certaines analyses bactériologiques telles que le dénombrement

bactérien recommandent de faire un dénombrement lorsque la boite de pétrie et chargé avec un nombre

approximatif entre 30 et 300 colonies et donc dans le cas où on a un nombre plus important il est

recommandé de faire des dilutions successives :

Une solution du produit à analyser est préparée, ensuite des tubes contenant le diluant avec un volume

de 9 ml sont préparés également (dans le cas où on veut faire des dilutions de facteur 10) un volume de

1 ml est transféré à partir du produit a analysé vers un premier tube contenant 9 ml du diluant stérile, il

en résulte une première dilution de l’ordre 10-1. Après pour établir une autre dilution, on prend 1 ml à

partir du tube contenant la dilution 10-1 vers un autre tube contenant 9 ml du diluant stérile, la même

procédure ce fait pour obtenir une série de dilution de facteur 10 : 10-1 10-2 10-3 10-4 ect.

3- Croissance bactérienne

Définition :

Croissance : augmentation coordonnée des constituants cellulaires, se traduisant par

une augmentation de la taille. Chez les bactéries, la croissance aboutit l’accroissement

du nombre de cellules.

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3-1 Division bactérienne :

La bactérie se multiplie par fission binaire : la bactérie grandit puis se divise en deux cellules

filles séparées par un septum de division formé par la paroi cellulaire. Durant la division, l’ADN

se duplique ainsi que les autres constituants. Divers systèmes enzymatiques de synthèse et de

dégradation participent à la division cellulaire. Les bactéries sont des organismes asexués dont

la reproduction a lieu par division cellulaire ou reproduction binaire encore appelée

scissiparité.

La reproduction se fait selon trois phases :

Allongement de la bactérie,

Duplication des constituants,

Séparation

3-2 Courbe de croissance

Courbe de croissance : La croissance d'une bactérie s'étudie en milieu liquide. Il existe cinq

phases dont l'ensemble constitue la courbe de croissance.

Phase de latence : le taux de croissance nul (µ = 0). La durée de cette phase dépend de l'âge

des bactéries et de la composition du milieu. C'est le temps nécessaire à la bactérie pour

synthétiser les enzymes adaptées au nouveau substrat (pas de phase de latence si repiquage

sur milieu identique au précédent).

Phase de de croissance exponentielle : le taux de croissance atteint un maximum (µ=max).

Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est constante. Le temps de doublement des

bactéries est le plus court. La masse cellulaire est représentée par des cellules viables

(mortalité nulle).

Phase de ralentissement : la vitesse de croissance régresse. Il y a un épuisement du milieu de

culture et une accumulation des déchets. Il existe un début d'autolyse des bactéries.

. Phase maximale stationnaire : le taux de croissance devient nu (µ = 0). Les bactéries qui se

multiplient compensent celles qui meurent.

Phase de déclin : le taux de croissance est négatif (µ < 0). Toutes les ressources nutritives

sont épuisées. Il y a accumulation de métabolites toxiques. Il se produit une diminution

d'organismes viables et une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques

endogènes. Cependant, il persiste une croissance par libération de substances libérées lors de

la lyse (croissance cryptique).

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3-3 Temps de génération

Par définition, le temps de génération ou de doublement (G) est le temps requis pour le

doublement de tous les constituants bactériens. L'augmentation du nombre de cellules durant la

phase exponentielle représente une progression géométrique du nombre 2. Une cellule qui se

divise en deux est exprimée comme suit: 20 → 21. Deux cellules qui se divisent en quatre est

exprimé comme allant de 21 → 22 et ainsi de suite. Donc la relation mathématique entre les

cellules présentes initialement et après un temps donné en phase exponentielle est: N= N0

2n, Où N représente le nombre théorique final de cellules, N0 le nombre initial et n le nombre de

générations

Effet de la température

Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance.

- Bactéries mésophiles (Ex. : Escherichia coli) : température de croissance proche de celle du

corps humain (37°C)

- Bactéries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : températures de croissance comprises

entre 45°C et 70°C.

- Bactéries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : températures de croissance supérieures à

80°C .

- Bactéries psychrophiles (Ex. :) : Températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C).

- Bactéries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : températures de croissance proches de 0°C

avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles.

Exercice 01 :

On veut faire le dénombrement bactérien dans un aliment solide. Pour cela, on a préparé une

dilution initiale à partir de cet aliment.

3) Quel est la méthode d’ensemencement adéquate pour faire le dénombrement des bactéries

dans cette dilution initiale ? expliquez.

2) Après ensemencement et incubation, on a obtenu une culture très dense (trop chargée). Quelle

est la méthode à faire à la dilution initiale pour avoir une culture moins dense dans un deuxième

ensemencement ?

1 : phase de latence,

2 : phase de croissance exponentielle,

3 : phase de ralentissement,

4 : phase stationnaire,

5 : phase de déclin.

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3) Quel est le nombre de bactéries recommandé pour faire le dénombrement ?

Exercice 02 :

Selon la température optimale de la croissance (figure ci-dessous),

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TD N° 3 : Identification bactérienne

1. L’étude macroscopique :

Définition d’une colonie bactérienne : c’est l’amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de

descendances d’une seule cellule bactérienne vivante à la surf ace ou à l’intérieur d’un milieu de culture

solide.

Étude macroscopique (l’aspect) des colonies :

La première étape du diagnostic bactérien et du biotypage d’une souche est la description macroscopique

des colonies isolées ; parfois cette seule étude permet de connaître le germe qu’on a en présence car les

colonies sont typiques….

Cette description doit mentionner :

• La taille : diamètre des colonies. Vous pouvez mesurer cette taille à l'aide d'une règle

graduée. On distingue :

Colonies punctiformes : Colonies à peine visibles, dont la taille est inférieure au millimètre

petites colonies : Colonies dont le diamètre est compris entre 1 et 2 mm

Colonies moyennes : Colonies dont le diamètre est compris entre 3 et 5 mm

Grosses colonies : Colonies dont le diamètre est supérieur à 5 mm

La vue de profil (élévation) (bombée, plane, ombiliquée, a bords surélevés ou en œuf au plat) et avec

vue de dessus (bords ou contours) (bords : dentèles, en étoile, ovoïde, régulière, ondulée, lobée).

• L'aspect de la surface (lisse, rugueuse, brillante).

• L'opacité. Les colonies opaques ne laissent pas passer la lumière contrairement aux

translucides. Certaines sont très transparentes, car ils laissent passer la lumière.

• La consistance. Elle se juge au moment du prélèvement. On distingue les colonies crémeuses des

sèches et des muqueuses (gluantes).

• La couleur ou pigmentation. La plupart des colonies isolées sur gélose ordinaire sont couleur

crème (sans pigment) mais certaines sont blanc porcelaine, jaune, vert,...; Figure 1 : aspect macroscopique des colonies bactériennes

Taille et Punctiform

Filamenteu

Irrégulière

Fusiform

Elévation

Plane Elevé

Convex

Bombé

Bossue

Bord

Régulie

Ondul

Lob

Dentel

Filamenteu

Bords

surélevés

Rhizoïd Circulaire

18

18

2. L’étude microscopique :

L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d’une espèce

bactérienne. Elle comprend :

L’état frais :

Cet examen permet d’apprécier la forme et parfois la mobilité des germes étudiés.

Technique :

1. À partir d’une culture en milieu liquide :

Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une « anse de platine » soit « une petite goutte » à l’aide

d’une pipette Pasteur. Recouvrir la goutte d’une lamelle, éviter les bulles d'air. Et recommencer au

besoin.

2. À partir d’une culture sur milieu solide :

Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame. Prélever une trace de culture à

l’anse de platine et l’émulsionner dans le liquide.

2/ Après coloration :

Préparation du frottis :

Étalement. L'étalement doit se faire en couche mince, sur une

Lame dégraissée.

Séchage. Laisser sécher à l'air.

Fixation. Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à

l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement. On peut également fixer

en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool éthylique versées directement sur le prélèvement.

A ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.

2-1 / Coloration simple

Coloration au bleu de méthylène

Sur le frottis fixé et refroidi :

- Faire couler la solution de bleu de méthylène phéniqué jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.

- Laisser agir 1 minute.

- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée, ou à l'eau du robinet jusqu'à

élimination des colorants en excès.

- Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou encore sécher délicatement entre deux feuilles de

papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.

- Examiner au microscope, objectif à immersion.

Résultats

Les bactéries sont colorées en bleu sombre.

Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis, mais elle permet

seulement l'étude de la morphologie des bactéries.

Il est donc souvent nécessaire de la compléter par une coloration de Gram.

2/ Coloration différentielle

2-1. Coloration de Gram

C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne,

et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier en deux grands groupes:

Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes épaisse (ex : Bacillus cereus)

Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus une membrane externe

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Protocole :

1. Coloration par le violet de Gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute.

Rincer à l'eau déminéralisée.

2. Mordançage au Lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 30 secondes

; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus

de sécurité.

3. Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange

alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet

doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée ;

4. Recoloration à la Safranine ou à la Fuchsine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver

doucement à l'eau déminéralisée.

5. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes ou à l’air libre.

6. Examen. Observer avec une goutte d'huile à immersion objectif 100 (×1000).

Figure 2 : les différentes formes de cellules bactériennes

2-2. Coloration de Ziehl Neelsen : cette coloration est utilisée pour la recherche des bacilles tuberculeux,

elle est basée sur la capacité de ces bactéries à conserver , après coloration à chaud à la fushine , la teinte

rose malgré l’action d’un acide fort concentré et de l’éthanol à 0.95% .ces bactéries on les appelle les

Alcoolo-Acido-Résistants ou bacilles A.A.R .

Le protocole :

-Réaliser le frottis et le fixer

-Faire agir la fuschine concentrée à chaud.

-Laver soigneusement le frottis

-Placer dans un bain d’acide nitrique au 1/3 ou sulfurique au ¼ pendant 5min

-Laver

-Placer dans un bain d’éthanol à 0.95%pendant 5min

-Laver

-Sécher et observer à l’immersion.

Les A.A.R apparaissent roses tandis que les autres bactéries sont bleues.

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2-3. Coloration de spores :

Certaines espèces bactériennes ont la propriété de se transformer en spores ex : Bacillus ;c’est une forme

de résistance de ces bactéries en particulier vis-à-vis de la chaleur , capable de redonner la forme

végétative . La coloration de spore se fait par le vert de malachite. les spores apparaissent vertes dans

les corps bactériens roses.

2.4. Coloration de capsule :

Les capsules sont des couches denses et bien délimitées de molécules visqueuses accumulées à

l’extérieur de la paroi par certaines bactéries comme les pneumocoques.

Pour l’observation de la capsule des microorganismes on utilise l’encre de chine : le fond de la

préparation apparait noir et la capsule apparait transparente autour d’une bactérie plus foncée.

3. Identification bactérienne

L’identification bactérienne consiste à placer une souche particulière dans un taxon connu. La souche

inconnue est comparée à des espèces déjà décrites (souches types) et le nom de l’espèce la plus similaire

est proposé.

L’identification phénotypique utilise un faible nombre de caractères considérés comme importants tels

que la morphologie, la mise en évidence d’un caractère biochimique (enzymes), sérologique (anticorps)

ect. les identifications bactériennes par les caractères biochimiques et sérologiques sont les plus utilisés

en routine.

L’identification moléculaire : elle est basée sur les techniques de biologie moléculaire telle que la PCR

(Amplification en Chaîne par Polymérase), séquençage de l’ARN 16s, cependant ces techniques sont

chère est nécessite un matériel spécifique et un personnel qualifié.

L’identification moléculaire en se basant sur la protéomique en utilisant la spectrométrie de masse de

types MALDI-TOF MS est parmi les méthodes nouvelles les plus recommandées ces dernières années

à cause de ça rapidité et sensibilité et son cout moins cher.

Exercice :

En étudiant deux bactéries différentes par microscopie électronique, un chercheur a remarqué que

la première(A) à une forme sphérique et une paroi épaisse, alors que la deuxième (B) a une forme

allongée en bâtonnet et une paroi mince avec une membrane externe. 1) Après coloration de Gram, quelle est la bactérie à Gram positif et quelle est la bactérie à Gram négatif ?

2) Comment appelle-t-on la forme sphérique et la forme allongée ?

Après ensemencement, la bactérie (A) a donné des colonies bombées et jaunes dorées sur un

milieu de base tandis que la bactérie (B) a donné des colonies envahissantes pigmentées en vert

sur un milieu différentiel,

3) Comment appelle-t-on cette étude ?

4) Est-ce que les pigmentations sont vraies pour les deux bactéries ? Et pourquoi ?

21

18

TD 04: Identification biochimique des microorganismes et Antibiogramme

1- Définition de l’identification biochimique des microorganismes :

C’est un ensemble de techniques qui sont basés sur les connaissances du métabolisme microbien et de

la biochimie microbienne des microorganismes, ce qui permet d’identifié un microorganisme inconnu

et le placé dans un taxon connu « genre et espèce ». Les techniques d’identification biochimiques

utilisent plusieurs milieux de culture d’identification solides et liquides contenant des substrats

susceptibles à être dégradé par les bactéries et donc cela permet de connaitre si la bactérie possède ou

pas l’enzyme en question, et comme la plupart des bactéries sont connues actuellement de point de vue

métabolisme et potentiel enzymatique cela permet de les identifiées en fonction de leurs enzymes.

L’identification biochimique est parmi les premières méthodes utilisées pour l’identification en

bactériologie, pour cela elle est appelée galerie biochimique classique, les tests se font dans des tubes

à essai contenant les substrats à tester. Vers la fin du vingtième siècle ces tests ont été modernisés et

regroupé dans des plaques en plastiques chacune de ces plaques contient environ 20 tests miniaturisés

en microtubes, chaque plaque est spécifique pour un groupe d’espèces bactérien, ces plaques s’appellent

galerie API (Appareillage et Procédé d'Identification). Exemple ; API 20E spécifique pour les

Entérobactéries, APIstaph spécifique pour les staphylocoques, etc.

1-1 les tests biochimiques utilisés couramment (Galerie classique)

A. Etude du type respiratoire : Gélose viande-foie (VF) ;

L’étude du type respiratoire d’un micro-organisme permet de définir ses rapports avec l’oxygène

(certaines bactéries nécessitent O2, d’autres l’absence d’O2). La détermination du type respiratoire est

essentielle pour l'identification de la famille ou du genre auquel appartient la bactérie, pour cela, on

utilise un milieu de culture, type gélose viande-foie (gélose VF) : Composition : Peptone pepsique de

viande et de foie : 30 g/L, Glucose : 2 g/L,

Agar : 6 g/L.

Pratique : Au moment de l'emploi, placer les tubes dont la capsule a été partiellement dévissée dans un

bain-marie bouillant pendant 20 minutes (régénération du milieu). Maintenir les milieux en surfusion

dans un bain-marie à 45-50 °C. Plonger l'effilure d'une pipette pasteur boutonnée et stérilisée par

flambage dans une suspension de la bactérie à étudier. Transporter l'inoculum dans le fond du tube puis

remonter la pipette en décrivant des tours de spires très serrés en prenant soin de ne pas aérer le milieu.

Incuber à 37 °C durant 18 à 24 heures. Résultats : Après incubation, on peut reconnaître quatre types

respiratoires :

bactérie aérobie (aérobie strict) : croissance uniquement dans la zone superficielle de la gélose

;bactérie anaérobie (anaérobie strict) : croissance uniquement dans la zone profonde de la gélose ;

bactérie aéro-anaérobie (aéro-anaérobie facultatif) : croissance sur toute la hauteur de la gélose ; bactérie

micro-aérophile : croissance dans un cylindre de gélose d'environ 0,5 cm de hauteur et situé à environ 1

à 2 cm de la surface.

B. Test catalse :

Principe : En présence d'oxygène moléculaire, certaines réactions métaboliques conduisent à la

formation d'eau oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade l'eau oxygénée en eau et oxygène.

2H2O2

Catalase

2H2O + O2

Technique ; déposer sur une lame de verre une ou deux gouttes d'eau oxygénée à 10 volumes.

Prélever à l'aide de l'effilure d'une pipette pasteur un fragment de colonie et dissocier la culture dans

l'eau oxygénée.

19

19

Lecture ; la présence d'une catalase se traduit, en quelques secondes, par la formation de bulles

d'oxygène (une effervescence (dû à un dégagement de dioxygène) signe la présence d'une catalase). Si

rien n'est observable, la bactérie ne possède pas l'enzyme.

C. Test Oxydase :

La recherche de l'oxydase est un des critères les plus discriminatifs et les plus employés pour

l'identification des bactéries, surtout celle des bacilles à Gram négatif.

La cytochrome oxydase ou oxydase est une enzyme de la chaîne respiratoire bactérienne qui

catalyse des réactions d'oxydation du type:

DH2 + ½ O2 D + H2O

La recherche de l'oxydase consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à oxyder la

forme réduite incolore de dérivés méthylés du « paraphénylène diamine », en leur forme oxydée rose

violacé. Le chlorhydrate ou le N-diméthyl paraphénylène diamine (PDA) est utilisé comme réactif,

généralement imprégnés sur des disques (disques oxydases). Un de ces disques est placé sur une lame

et une colonie y est déposée avec une pipette pasteur. S'il y a apparition d'une tache violette au bout de

30 secondes, la bactérie est oxydase+ et elle possède la cytochrome oxydase. Et si rien n'apparaît, cela

signifie que la bactérie est oxydase- et qu'elle ne possède pas l'enzyme respiratoire (cytochrome

oxydase).

Exemples de bactéries cytochrome-oxydase + : Vibrio , Pseudomonas , Neisseria, Brucella.Exemples

de bactéries cytochrome-oxydase - : La plupart des : Entérobactéries, Acinetobacter .

D. Milieux d’identification : Il existe plusieurs milieux d’identification et de testes biochimiques

qui permet de détecter la présence d’enzymes bactériens qui dégrades ; les sucres, les acides

aminés, les protéines et d’autres substances organiques, dans ce TD on va étudier seulement

deux milieux de culture comme exemples ;

Exemple1 : Milieu Kligler-Hajna

Le milieu de Kligler permet l’identification des entérobactéries par la mise en évidence rapide de la

fermentation du lactose et du glucose (avec ou sans production de gaz), ainsi que de la production de

sulfure d’hydrogène. Les fermentations du lactose et du glucose, qui permettent la différenciation des

entérobactéries, se traduisent par une acidification qui fait virer au jaune le rouge de phénol (indicateur

pH).

Composition

Peptone ......................... 15 g

- Extrait de viande ............... 3 g

- Extrait de levure ............... 3 g

- Peptone pepsique de viande ...... 5 g

- Glucose ......................... 1 g

- Lactose ......................... 10 g

- Rouge de phénol ................. 25 mg

- Chlorure de sodium .............. 5 g

- Sulfate ferreux .................. 0,2 g

20

20

- Thiosulfate de sodium ............. 0,3 g

- Agar-agar ....................... 11 g

Techniques :

- À partir d’une colonie suspecte prélevée sur un milieu d’isolement sélectif, ensemencer le culot par

piqûre centrale et la surface inclinée par des stries serrées.

- Il est nécessaire d’utiliser des cultures pures prélevées au centre de colonies bien isolées, sinon les

réactions croisées rendent l’identification impossible à réaliser.

- Incuber à 37°C pendant 24 heures, capsules desserrées, de manière à favoriser les échanges gazeux.

Lecture : Le milieu de Kligler fournit quatre renseignements principaux :

Fermentation du glucose

* Culot rouge : glucose non fermenté

* Culot jaune : glucose fermenté

Fermentation du lactose

* Pente inclinée rouge : lactose non fermenté

* Pente inclinée jaune : lactose fermenté

Production de gaz

* Apparition de bulles de gaz dans le culot

Formation d’H2S

Production d’une coloration noire entre le culot et la pente ou le long de la piqûre.

Exemples :

Exemple 2 : Milieu BCPL :

Domaine d’utilisation : C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobactériacées

dans l’eau, les produits alimentaires, l’urine et les selles. Ce milieu facilite la différenciation des colonies

par le caractère lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boite par des nappes de Proteus, car

il ne contient pas d'électrolytes. C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de

nombreuses espèces n’appartenant pas aux entérobactéries

Principes : c’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries non

exigeantes

Peptone : 5,0 g

Extrait de viande de bœuf : 3,0 g

Lactose : 10,0 g

Pourpre de bromocrésol : 25 mg

Agar : 15 g (dans le cas où on utilise le milieu à sa forme solide, car c’est un milieu utilisé à deux

formes solide et liquide, dans notre TP on a préparé le milieu liquide)

(pH = 6,8)

Techniques : Ensemencement du milieu liquide par les bactéries à identifier et incubation18 à 24 h à

37°C,

ESPECES PENTE CULOT H2S

Lactose Glucose Gaz

Salmonella Typhi - + - +

Shigella flexneri - + - -

Proteus mirabilis - + + +

23

23

Lecture : Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en

milieu acide de l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre.

Colonies bleues : bactéries lactose –

Colonies jaunes : bactéries lactose +

Exercice :

Le tableau ci-dessous donne quelques caractères biochimiques de cinq espèces bactériennes

observés après ensemencement sur milieu Kligler.

Tableau : Caractères biochimiques d’espèces bactériennes ensemencées sur milieu Kligler.

Especes Lactose Glucose Gaz H2S

Salmonella typhi

Shigella flexneri

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacter cloacae

-

-

-

-

+

+

+

+

-

+

-

-

+

-

+

+

-

+

-

-

1) Montrez la méthode d’ensemencement du milieu Kligler

2) Pour chaque espèce, donnez les résultats sur tubes de milieu Kligler après 24h

d’incubation.

3) Est-il possible d’avoir comme résultat un culot rouge et une pente jaune ? et pourquoi ?

Antibiogramme

L’antibiogramme est un test particulier en biologie clinique, car il s’adresse à des êtres vivants

infectieux et non au corps humain. Il constitue l’outil de mesure de la résistance bactérienne. Sa

pratique et son interprétation font appel à de nombreuses connaissances cliniques, pharmaceutiques,

bactériologiques, biochimiques et génétiques. L’interprétation se fait aujourd’hui avec des systèmes

experts qui suivent les recommandations de comités d’antibiogramme par exemple CASFM (comité

de l'antibiogramme de la société française de microbiologie) ou bien CLSI (Clinical and Laboratory

Standards Institute.

Le but de la réalisation d’un antibiogramme est de prédire la sensibilité d’un germe à Un ou plusieurs

antibiotiques afin d’effectuer la surveillance épidémiologique de la résistance bactérienne ou bien de

réaliser une identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles.

Methodes de réalisation d’un antibiogramme :

24

23

L’antibiogramme s’effectue soit en milieu solide (gélosé) par la méthode de diffusion en déterminant

les zones d’inhibition des disques d’antibiotiques standards vis-à-vis d’une souche à tester. Ou bien en

milieu liquide en déterminant la concentration minimale inhibitrice CMI.

1. En milieu solide : la méthode de diffusion se fait par ensemencement de la surface de la gélose

(généralement MULLER-HINTON) avec un inoculum des souches à étudier, ensuite les disques

d’antibiotiques standards (papier filtre imbibé avec une concertation standard d’un antibiotique

donné) sont placés à la surface de la gélose. Le résultat c’est des zones d’inhibitions mesurables à

l’aide d’un double décimètre ou pied à coulisse. L’interprétation des résultats se fait en suivant les

recommandations internationales CASFM, EUCAST ou CLSI (Figure 01).

Figure 01 : Antibiogramme par méthode de de diffusion sur gélose MULLER-HINTON

2. En milieu liquide : des dilutions de l’antibiotique à tester sont effectuées en milieu liquide,

ensuite l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou

de cupules (méthode de microdilution) contenant les différentes dilutions. Après incubation, la

CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique

où aucune croissance n'est visible (figure 02).

3.

Figure 02 : La concentration minimale inhibitrice

24

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Exercice :

Un microbiologiste veut étudier la sensibilité d’une bactérie envers un antibiotique. Pour cela

il a utilisé la méthode de l’antibiogramme sur milieu liquide pour rechercher la CMI

(Concentration Minimale Inhibitrice). Cette technique est basée sur l’utilisation d’un gradient

de concentrations en μg/ml de l’antibiotique. Le résultat est l’apparition d’une croissance dans

certains tubes et l’absence de la croissance dans d’autres. Le résultat est présenté dans la

figure suivante :

μg/ml

Figure : Résultat de la recherche de la recherche de la concentration Minimale Inhibitrice

1) Que signifie la concentration minimale inhibitrice.

2) À partir de la figure 16, déterminer la CMI.

3) Sachant que l’ensemencement à partir de la concentration 128 et 64 μg/ml n’a donné aucune

culture, proposer les concentrations qui peuvent être considérées comme CMB.