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Différence, traitement et classificationLeucémie signifie « sang blanc », le rapport habituel de 1 globule blanc pour 1 000 globules rouges dans le sang périphérique n’est plus respecté lors de ces pathologies, et ce au profit d’un trop grand nombre de cellules blanches… Dans les leucémies aiguës, cette prolifération est associée à un blocage de la maturation cellulaire et conduit donc à une augmentation du nombre de cellules immatures ou blastes. On distingue les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), les premières étant deux fois plus fréquentes que les secondes. Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont dues à la transformation d’un progéniteur hématopoïétique multipotent, responsable d’une prolifération cellulaire sans anomalie de la différenciation cellulaire, et donc d’une augmentation du nombre de cellules matures, sans prédominance des blastes. L’érythropoïèse extramédullaire est fréquente, marquée par une splénomégalie. Depuis plusieurs années, l’évolution des connaissances notamment moléculaires modifie les approches thérapeutiques pour des prises en charge de plus en plus personnalisées. Elle modifie également les modes de classification de ces pathologies, privilégiant le classement en fonction des profils génétiques voire moléculaires, et non plus seulement sur les « simples »

critères cytologiques, ce qui explique l’évolution des classifications en parallèle de l’évolution des connaissances.

Les leucémies aiguësSi la leucémie aiguë lymphoblastique est la première cause de cancer chez l’enfant, la leucémie aiguë myéloïde touche plutôt le sujet âgé, elle est de ce fait une maladie en devenir, du fait du vieillissement de la population. Sa médiane est actuellement autour de 70 ans.

Bien connaître les bases du traitementBien identifier le type de leucémie est fondamental car les bases de leur traitement sont différentes.

La première phase du traitement est une phase d’induction initiée dès que le diagnostic est posé. Cette induction est différente et spécifique s’il s’agit d’une LAL, d’une LAM ou d’une LAM promyélocytaire. Dans les autres cas de leucémies aiguës, le mécanisme d’induction est relativement générique. L’objectif est d’obtenir une rémission complète, c’est-à-dire avoir une moelle et un sang d’apparence normale, ce qui signifie avoir moins de 5 % de blastes dans la moelle, et pour l’hémogramme, des neutrophiles au moins supérieurs à 1 000/mL.

Les explorations des leucémies aiguës et néoplasies myéloprolifératives

Hémopathies | Leucémie myéloïde.

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Les hémopathies, 5e cause de cancers, regroupent en fait une grande diversité de pathologies, au sein desquelles les leucémies aiguës représentent environ 15 %, ce qui en fait des maladies relativement rares, soit 4 à 5 pour 100 000 habitants en France, mais dont la prise en charge reste une urgence. Les néoplasies myéloprolifératives (ou syndromes myéloprolifératifs) sont des maladies encore plus rares. La connaissance moléculaire de ces hémopathies a permis de grands progrès thérapeutiques, mais l’hémogramme reste la première étape incontournable dans la prise en charge de ces patients.

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La deuxième phase sera la consolidation du traitement, sans laquelle la rechute est constante. Cette phase est variable en durée et toxicité des cures. Si la réponse au traitement n’est pas satisfaisante, une phase d’intensification peut alors être nécessaire, allant jusqu’à l’allogreffe de moelle. La possibilité de rechercher la présence d’oncogènes permet maintenant de compléter cette polychimiothérapie classique par des trai-tements plus ciblés, maladie par maladie. Ainsi par exemple l’oncogène bcr-abelson (bcr-abl), connu dans la leucémie myé-loïde chronique (LMC) (cf. ci-après), existe également dans la LAL. Le traitement par inhibiteur de tyrosine kinase comme l’imatinib, améliore de façon significative la survie des leucémies aiguës lymphoblastiques de type Ph1 +.

L’objectif de l’exploration biologiqueIl s’agit donc à la fois, et idéalement, d’affirmer le diagnostic, d’identifier les cibles thérapeutiques, de donner d’emblée un pro-nostic d’évolution, aidant à ajuster au mieux risque thérapeutique et risque lié à la maladie elle-même, et enfin donner les éléments de base des marqueurs de réponse pour le suivi thérapeutique. L’hémogramme occupe pour cela une place essentielle. C’est lui qui oriente le diagnostic et déclenche la prise en charge du patient. Il est caractérisé par une pancytopénie, des blastes en % variable. Les autres anomalies sont plus ou moins présentes (D-dimères, LDH…). Cette pancytopénie constitue donc le tableau clinique majoritaire : une insuffisance d’oxygénation due à l’anémie des signes infectieux liés à la neutropénie, hémorragiques dus à la thrombopénie ou de type CIVD dans la LAM promyélocytaire. Le diagnostic de suspicion est affirmé sur le myélogramme s’il y a plus de 20 % de blastes, sachant que la valeur considérée normale est inférieure à 5 %. Il est à noter que les critères ont évolué, cette valeur seuil étant à 30 % dans la classification FAB. Les blastes peuvent être d’aspect physiologique ou malin, et toute l’expertise du biologiste cytologiste est nécessaire alors pour poser le dia-gnostic entre LAM non promyélocytaire, LAM promyélocytaire ou LAL. La phase d’induction thérapeutique sera conditionnée par ce diagnostic différencié.

Les différents typages pour la classification des leucémies aiguësLa classification historique est basée sur la cytologie, il s’agit de la classification FAB (french american british). Toujours considérée utile, elle n’est cependant plus seule prise en compte actuelle-ment. Des typages immunologiques, cytogénétiques ou molé-culaires lui sont associés et les classifications OMS considèrent maintenant l’ensemble de ces éléments.

L’immunophénotypage (étude des antigènes de surface, technique sur 1 à 2 jours)Il s’agit de repérer la population blastique en fonction des pro-téines de surface ou des protéines intracellulaires à l’aide d’anti-corps fluoromarqués. Tout d’abord les blastes sont isolés du fait de leur caractère hypoCD45 et hypogranuleux. Puis cette population

est analysée à l’aide de différents mélanges d’anticorps marqués. Un premier profil d’orientation permet de différencier les types myéloïdes, lymphoïdes B ou T ou biphénotypiques, puis un profil de confirmation permet un typage plus précis, de mieux cerner le degré de différenciation (le caractère immature étant un élément de mauvais pronostic) et de repérer les cibles thérapeutiques pour traitement par anticorps monoclonaux (CD33 par exemple, qui est une cible thérapeutique donc intéressante pour le clinicien).

Le caryotype (étude des anomalies chromosomiques, technique sur 4 à 5 jours)Après mise en culture des cellules blastiques et blocage de la division cellulaire au stade de métaphase, les chromosomes sont colorés puis classés par taille (des plus grands, chromo-somes 1, jusqu’aux plus petits, chromosomes 21) + les chro-mosomes sexuels. Cette analyse est réalisée sur 20 mitoses au minimum. Ce classement, ainsi que les bandes matérialisées par la coloration permettent de repérer les anomalies. Pour les LAM par exemple, la perte de chromosome ou monosomie est un élé-ment de mauvais pronostic, tout comme la présence d’anomalies sur les chromosomes 5 et 7. L’information apportée est surtout pronostique : les caryotypes sont classés avec risque favorable, défavorable et intermédiaire. Devant un caryotype à risque favo-rable, le clinicien pourra opter pour une chimiothérapie classique, plutôt que pour une allogreffe, alors que devant un caryotype à risque défavorable, le clinicien pourra prendre le risque d’une allogreffe si le sujet est jeune… Dans le cas de caryotype à risque intermédiaire, le clinicien aura besoin d’autres éléments d’aide et le typage moléculaire peut apporter un éclairage important. Pour les LAL, l’apport du caryotype est similaire. Il met en évidence soit une anomalie de structure, comme dans le cas de bcr-abl, soit une anomalie quantitative, à savoir une hypodiploïdie qui est de mauvais pronostic, ou une hyperdiploïdie (dans un nombre restreint) qui est de meilleur pronostic.

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La biologie moléculaireCette technique connaît une évolution technologique très impor-tante. Elle est basée sur deux méthodes principalement : la CGH ou hybridation génomique comparative et le séquençage. La CGH analyse le contenu en ADN et permet de repérer les gains ou les pertes, même très minimes du génome. Les évolutions techno-logiques permettent d’appliquer le séquençage au génome com-plet du patient ou bien aux parties codantes (exons) uniquement.La biologie moléculaire est en pleine « explosion » actuellement et cela de manière trop récente encore pour pouvoir discerner les anomalies importantes parmi toutes les nouvelles mutations mises en évidence. Exemple pour les LAM de l’insertion de 4 bases TCTG sur le dernier exon de la nucléophosmine qui est une protéine nucléaire : cette mutation entraîne un décalage du cadre de lecture de l’ADN et conduit à produire une délocalisation de cette protéine qui n’est plus nucléaire mais intracellulaire. Cette mutation serait un événement primaire dans l’apparition des LAM. Exemple pour les LAL de IKaros : ce facteur de trans-cription joue un rôle critique dans la différenciation lymphoïde B et sa délétion dans la LAL serait associée à bcr-abl de l’enfant et donc de mauvais pronostic, voire de renforcement thérapeutique. L’intérêt de la biologie moléculaire est essentiellement pour l’ins-tant de confirmer si besoin un caryotype. Elle permet de connaître des anomalies non visibles sur le caryotype, d’évaluer le pronostic et identifier des marqueurs de suivi de réponse au traitement.

En conclusionLes laboratoires de biologie médicale assument l’importance du premier temps de prise en charge, qui est de repérer l’urgence éventuelle devant une grande hyperleucocytose, avec le risque de CIVD dans le cadre de LAM promyélocytaire : il faut penser à faire un bilan d’hémostase en présence de nombreux blastes, et pen-ser au risque d’infection… Les laboratoires de première intention permettent également de détenir un échantillon biologique de départ et peuvent alors le transmettre vers l’une des 28 plateformes en France afin de réaliser les examens complémentaires, sans diluer ni répéter les examens inutilement (exemple des ponctions réalisées auparavant dans les centres hospitaliers…). Ces plateformes réunissent les spécialistes de cytologie, immunophénotypage, caryotype, biologie moléculaire et cliniciens qui assurent des réu-nions pluridisciplinaires qui sont non seulement des obligations légales mais surtout utiles à la prise en charge de ces leucémies.

Les néoplasies myéloproliférativesContrairement aux leucémies aiguës, la prolifération cellulaire ici n’est pas associée à un arrêt de différenciation. Ce sont donc des cellules matures que l’on retrouve en hyperproduction d’une ou plusieurs lignées. Ces maladies, encore plus rares que les leucémies aiguës myéloïdes, ne présentent pas d’anoma-lie de différenciation mais il existe des anomalies de tyrosine kinase. Il se produit une hématopoïèse extramédullaire avec splénomégalie, des thromboses ou hémorragie et elles évoluent à long terme en leucémie aiguë ou en myélofibrose.

Leucémie myéloïde chronique (LMC)Elle survient à tout âge, mais surtout entre 30 et 50 ans. Les trois éléments caractéristiques du sang périphérique sont une hyperleucocytose allant de 40 à 400 Giga/L ou plus, une formule sanguine avec une myélémie qui respecte la pyramide de maturation (contrairement aux leucémies aiguës), et une augmentation des polynucléaires basophiles. Le myélogramme montre une moelle très riche avec une prédominance de la lignée granulocytaire avec une pyramide de maturation toujours conservée. Ceci est évocateur de LMC mais ne suffit pas à l’affirmer. Il est nécessaire de faire appel à la cytogénétique ou la biologie moléculaire pour mettre en évidence respectivement le chromosome dit Philadelphie, issu d’une cassure et d’une translocation réciproque sur les chromosomes 9 et 22, et le gène bcr-abl issu de ce réarrangement chromosomique. La protéine codée par ce gène, également appelée protéine BCR-ABL, pré-sente une activité tyrosine kinase constitutive qui joue un rôle dans la prolifération et la survie des cellules responsables de la LMC. La cytogénétique (caryotype ou technique Fish) réalisée sur la moelle osseuse révèle la translocation 9-22 dans 90 %. Dans 5 à 10 %, un troisième chromosome est également impli-qué dans la translocation (sans impact particulier), et dans 1 % des cas le chromosome Phi est dit masqué, c’est-à-dire non vu au caryotype. C’est la biologie moléculaire (PCR multiplex) qui révèle alors la présence du transcrit de fusion bcr-abl.

TraitementLe traitement qui a révolutionné la prise en charge de la LMC et qui est maintenant le traitement de référence en première ligne est l’imatinib. Inhibiteur de la tyrosine kinase, il empêche la fixation de l’ATP et bloque ainsi la phosphorylation des substrats en aval, et donc la prolifération des cellules.Il existe des recommandations très précises pour déterminer le niveau de réponse au traitement, dont l’objectif est matérialisé par des réponses dites complètes sur les plans hématologique, cytogénétique et moléculaire.Une réponse hématologique complète correspond à une normalisation de l’hémogramme et une disparition de la splé-nomégalie. La réponse cytogénétique complète s’exprime par un caryotype normal (absence de chromosome Phi). La réponse moléculaire complète sera l’absence de détection de transcrit bcr-abl par RT-PCR. L’expression de cette réponse passe par le ratio BCR-ABL/ABL (mesuré sur le sang périphérique).• Au moment du diagnostic, ce ratio est de 100 %.• Après 3e mois, la réponse hématologique doit être complète.• Au 12e mois, c’est la réponse cytogénétique qui doit être complète.• Ensuite le suivi se fait exclusivement par réponse moléculaire ou suivi de maladie résiduelle : au bout de 18 mois, il est recherché une réponse moléculaire majeure, c’est-à-dire un ratio BCR-ABL/ABL inférieur à 0,1 %.Si la réponse moléculaire reste indétectable pendant 2 ans, l’arrêt du traitement est envisagé. Dans la moitié des cas, il y aura perte

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de réponse, et donc nécessité de reprise du traitement qui reste efficace et réduit à nouveau le ratio BCR-ABL/ABL. Les pertes de réponse moléculaire, plus précoces que les variations de l’hémo-gramme, peuvent être dues à la non compliance au traitement, mais également à l’apparition de résistance, dont la forme la plus fréquente est une diminution de l’affinité du médicament pour la protéine, par mutations au niveau du domaine tyrosine kinase ABL.

En pratique• Le diagnostic d’orientation est posé par la splénomégalie et l’hémogramme.• Le diagnostic est confirmé par le caryotype sur la moelle, la bio-logie moléculaire sur le sang.• Le suivi de traitement ciblé et personnalisé est réalisé par l’hémogramme tous les 3 mois, le caryotype tous les 6 mois jusqu’à normalisation puis tous les ans en surveillance.• Le ratio BCR-ABL/ABL est utile tous les 3 mois.L’évolution naturelle de la LMC vers la leucémie aiguë a beaucoup régressé, du fait notamment de ce suivi thérapeutique régulier. Si elle survient cependant, ou si le diagnostic est fait au moment de la phase de transition, elle entraîne une perte de la pyramide de maturation dans la myélémie. Hémogramme et caryotype sont des examens remboursés, le suivi quantitatif (rapport BCR-ABL/ABL) est pris en charge par l’INCa (Institut national du cancer).

La maladie de Vaquez, ou polyglobulie primitiveSouvent diagnostiquée chez les patients d’environ 60 ans, de manière fortuite sur un hémogramme ou sur des signes cliniques en lien avec l’hyperviscosité sanguine (céphalées, vertiges…), un prurit à l’eau, une érythrose faciale…, elle correspond à une augmentation de la lignée érythroïde essentiellement, même si toutes les lignées cellulaires peuvent être atteintes.Le premier temps de diagnostic est l’affirmation de la polyglobulie vraie, par rapport notamment aux polyglobulies consécutives aux états de déshydratation ou à la pseudopolyglobulie de stress. L’augmentation de volume globulaire total signe la poly-globulie vraie. Elle est révélée par technique isotopique, sauf si l’hématocrite (ou hémoglobine) est très élevé (supérieur à 56 chez la femme et 60 chez l’homme, dans ce cas, il est inutile de réaliser cette technique isotopique).Le deuxième temps est l’élimination d’une polyglobulie secondaire à une élévation de l’EPO (érythropoïétine). Cette der-nière peut avoir pour cause une hypoxie, révélée par une analyse des gaz du sang, diminués. Il peut s’agir également d’une tumeur rénale, induisant une production élevée d’EPO.Le troisième temps est la confirmation de la maladie de Vaquez. La découverture du rôle de la tyrosine kinase Jak2 a simplifié le diagnostic de cette maladie. Jak2 est une protéine associée au domaine intracytoplasmique de récepteur de cyto-kines qui, de ce fait, est phosphorylée et induit des phospho-rylations en aval, jouant ainsi un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaire. En cas de mutations, cette activation peut devenir indépendante de la présence de cytokines, et donc

peut générer une phosphorylation permanente de Jak2. Selon l’OMS, il faut deux critères majeurs, à savoir le taux d’Hb (ou la masse de globules rouges) et la présence de mutations sur Jak2, et un critère mineur. Les critères mineurs correspondent au taux d’EPO (normal ou abaissé dans ce cas), à la biopsie ostéomédullaire et aux colonies érythroïdes dites spontanées (c’est-à-dire même en absence d’EPO). Il est à noter que ces deux derniers ne sont recherchés que si la recherche de muta-tions Jak2 est négative.

En pratiqueTrois tubes de sang suffisent aujourd’hui à poser le diagnostic : un pour l’Hb (ou Hte), un pour l’EPO, un pour la recherche de mutations Jak2.

La thrombocytémie essentielleLe plus souvent diagnostiquée vers 50 à 60 ans, il existe cepen-dant un pic chez la femme vers 30 ans. Le plus souvent de décou-verte asymptomatique. Il est important de retenir que 90 % des thrombocytopénies sont secondaires et de plus, il faut éliminer le diagnostic de myélodysplasies et des autres NMP. Le diagnostic sera essentiellement posé par l’augmentation des plaquettes sériques, la prolifération de la lignée mégacaryocytaire sur la biopsie ostéomédullaire et la présence de mutations sur Jak2.

La myélofibrose primitiveAppelée auparavant splénomégalie myéloïde chronique, elle peut être spontanée (de novo) ou être l’évolution d’une maladie de Vaquez ou d’une thrombocytémie essentielle. La particularité sur l’hémogramme sera d’identifier les dacryocytes et éventuel-lement une érythromyélémie. La biopsie ostéomédullaire révè-lera la fibrose médullaire et la biologie moléculaire recherchera les mutations Jak2. Il est important de noter que Jak2 est un marqueur de clonalité mais n’est pas spécifique de la maladie de Vaquez où ses mutations sont présentes dans 96 % des cas, contre 55 % des cas de thrombocytose essentielle et 65 % des cas de myélofibrose primitive.

En conclusionDans les NMP, les marqueurs moléculaires prennent également de l’importance mais ils n’enlèvent en rien le rôle du labora-toire de biologie médicale de première intention, compte tenu de la place de l’hémogramme dans le diagnostic d’orientation (associé à la splénomégalie), et de l’importance d’éliminer les causes secondaires, beaucoup plus fréquentes que les néoplasies myéloprolifératives. |

Déclaration d’intérêts : l’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation

avec cet article.

ROSE-MARIE LEBLANCConsultant biologiste, Bordeaux

rmleblanc@romaconsult.fr

SourceD’après les communications d’Eric Delabesse et de Véronique De Mas (Centre hospitalier

universitaire de Toulouse) - Journées de biologie de Midi-Pyrénées – juin 2012.