Plant Science Letters, 1 (1973) 21--29 © Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam -- Printed in The Netherlands

R()LE DES LIPIDES DANS DIVERSES ACTIVITES ENZYMATIQUES DE LA CHAINE DE TRANSPORT DES ~ECTRONS D'UNE FRACTION MITOCHONDRIALE ISOLI~.E D'INFLORESCENCES DE CHOU-FLEUR

ALAIN JOLLIOT et PAUL MAZLIAK

Laboratoire de Physiologie Cellulaire, Universit~ de Paris VI, 12, rue Cuvier, 75005 Paris (France)

(Re~u le 3 octobre 1972)

SUMMARY

K~le of lipids in the various enzymatic activities in the mitochondrial electron- transfer chain of Cauliflower inflorescences

Evidence is presented that lipids play a role in the mitochondrial electron- transfer chain of Cauliflower inflorescencea Extraction of mitochondrial lipids with aqueous acetone causes an important decrease of NADH--cytochrome c- reductase, NADH-dehydrogenase, succinate--cytochrome c-reductase and suc- cinate<iehydrogenase activities. The activities of the two first complexes can be restored by addition of lipids in a micellar state.

INTRODUCTION

L'intervention des lipides, plus spdcialement des phospholipides, dans le fonctionnement de la chafne mitochondriaie de transport des dlectrons a dtd longtemps soup~onn~e. Trbs tot, on s'est aper~u que le traitement de tissus en- tiers, d'homogdnats ou de fractions mitochondriales d'origine animale, par des venins de serpents contenant diverses phospholipases, se traduisait pax une baisse sdv~re des propri~tds d'oxydation. Dans une ~tape ultdrieure fut mon- trde l'existence d'une relation existant entre la quantitd de lipides prdsents darts les mitochondries et les capacitds d'oxydation de ces m~mes mitochon- dries; la destruction ou l'extraction des phospholipides par diffdrents tmite- ments (par des phospholipases purifides, par des sels biliaires ou par des sol- vants organiques) entraine une diminution quasi-proportionnelle des capacitds oxydatives. L'dquipe de Fleischer fut la premiere ~ montrer qu'on pouvait restaurer diffdrentes activit~s enzymatiques membranaires mitochondriales perdues apr~s un tmitement ~ l'acdtone, en ajoutant aux mitochondries ainsi traitdes une dmulsion de lipides mi~chondriaux ou synth~tiques 1

De tr~s nombreux travaux ont montrd clue les phospholipides intervenaient darts plusieurs fonctions mitochondriaies (pour une revue d~taill~e, voir r~f. 2),

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et plus particuli~rement dans la chafne de transport des ~lectrons. Tous ces travaux ont dtd faits sur des mitochondries d'origine animale. Le prdsent tra- vail a pour objet de savoir si ces rdsultats peuvent ~tre dtendus ~ la chafne de transport des dlectrons d'une fraction mitochondriale d'origine v~gdtale. Pour le ddmontrer, nous avons repris les trois conditions expdrimentales ~noncdes par Fleischer 3 : (1) le complexe enzymatique dtudid doit contenir des lipides; (2) on dolt pouvoir montrer l'existence d'une corrdlation entre la perte des lipides et la diminution de l'activitd enzymatique; (3) on doit pouvoir obtenir la restauration de l'activitd enzymatique initiale par l'addition de lipides ~i des mitochondries ddpourvues de lipides.

MATl~RIEL ET MI~THODES

Prdparation de la fraction mitochondriale Les inflorescences de Chou-fleur (Brassica oleracea L., C.V. Botrytis) utili-

sdes pour la prdparation des mitochondries provenaient d'un marchd local. La m~thode utilis~e pour l 'obtention de la fraction mitochondriale par centri-

fugation diffdrentielle est une adaptation de la mdthode prdconisde par Bon- net 4. 500 g de tissus (poids frais initial) sont broy~s d'abord grossi~rement au broyeur Moulinex, puis finement au broyeur ~1 rouleaux de Jones et Hulme s, en prdsence de 500 ml d'une solution de broyage contenant les pro- duits suivants: mannitol (0.4 M), cystdine (4 raM), chlorure de magndsium (1 raM), tampon Tris--HC1 ~l pH 7.2 (10 raM), acide ~thyl~ne-diamine-tdtm- acdtique (10 raM), sdrum-albumine de boeuf (1 mg/ml). Aprbs passage sur deux dpaisseurs d'un tissu en coton ~ mailles fines ("tissu ~ beurre", Bazar de l'HStel de Ville, Paris), le filtrat est centrifug~ ~ 1500 g pendant 15 rain, ce qui permet de recueillir le culot de ddbris et de noyaux. Les mitochondries brutes sont obtenues en culot par centrifugation du surnageant ~ 10 000 g pen- dant 15 min. Ce culot est alors remis en suspension clans une solution de la- vage ayant la m~me composition que la solution de broyage, exceptde la cys- tdine. Les mitochondries lavdes et partiellement purifides sont obtenues en culot par centrifugation de la suspension ~ 6000 g pendant 15 min.

Traitement de la fraction mitochondriale par diff@rentes solutions ac~toniques 1 O, 30, 50, 70 e t 90% ou par le milieu de lavage A 1 ml de la fraction mitochondriale (15 ~l 25 mg de protdines) sont ajou-

tds 24 ml de diff~rentes solutions acdtoniques telles que les concentrations finales soient dgales ~ 10, 30, 50, 70 et 90% ou bien 24 ml de milieu de lavage. 10 min apr~s, les suspensions sont centrifug~es ~ 15 000 g pendant 15 rain. Le surnageant est alors dcartd et le culot soigneusement lard darts 25 ml de solution de lavage. Une nouvelle centrifugation de 15 min ~ 15 000 g permet d'obtenir un culot qui, une fois remis en suspension, constitue la fraction mitochondriale que nous appellerons fraction tmithe par la solution ac~tonique

10, 30, 50, 70 et 90% ou par le milieu de lavage.

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Traitement de relipidifieation Les lipides utilis~s sont extraits d'une fraction mitochondriale par le m~-

rhode de Bligh et Dyer 6. Evapor~s ~t sec, ils sont dispers& dans une solution de Tris--ac~tate 0.02 M, acide ~thyl~ne~tiamine-t~traac~tique 0.001 M, pH 8.0 par un traitement de 10 ~ 15 rain aux ultmsons 7, sous un courant d'azote (d~sint~grateur M.S.E. No. 7.100). Une centrifugation d'une heure ~t 20 000 g permet d'~liminer les lipides non disperses; le surnageant est recueilli et est utilis~ sans autre traitement.

Le traitement de relipidification consiste ~ traiter par les ultmsons, pendant une dur~e d'une minute 30 secondes, un m~lange constitu~ d'une fraction mitochondriale trait~e par une solution ac~tonique d 90% et de diff~rentes quantit~s de lipides disperses. Les activit~s enzymatiques sont directement tes- t~es sur ce m~lange.

Toutes les operations pr~c~lemment d~crites sont menses en chambre froide, ou en centrifugeuse r~frig~r~e, ou dans des r~cipients baignant dans de la glace.

Mesure des activit$s enzymatiques L'activit~ de la NADH--cytochrome c-rkiuctase (NADH:ferricytochrome

c oxydor~ductase, EC 1.6.99.3) est mesur~e ~ 22 ° en suivant 1'augmentation de l'absorption ~ 550 nm dans un milieu de volume total 2 ml, contenant 70 ~g de NADH, 130 ~g de cyanure de sodium, 1.2 mg de cytochrome c, du tampon Tris--HC1 0.2 M (pH 7.2) et des quantit& variables de diverses frac- tions mitochondriales. La mesure de l'activit~ de la succinate--cytochrome c-r~luctase se fait dans les mSmes conditions et avec les mSmes r6actants que pour la NADH--cytochrome c-rkiuctase; seule le NADH est remplac~ par 10.8 mg de succinate de sodium.

L'activit~ de la NADH d&hydrog~nase (NADH:FAD oxydor~ductase, EC 1.99.) est mesur~e ~ 22 ° en suivant la diminution de i'absorption ~ 600 nm dans un milieu de volume total 2 ml contenant 0.5 mg de NADH, 0.18 mg de FAD, 45/~g de dichloroph~nolindoph~nol, 0.147 mg de cyanure de sodium, du tampon phosphate 40 ram (pH 7.4) et diverses quantit~s de fractions mito- chondriales.

L'activit~ de la succinate d6shydrog~nase (succinate :ph~nazmem~osulfate oxydor~ductase, EC 1.3.99.1) est mesur~e ~ 22 ° en suivant la diminution de rabsorption ~ 600 nm darts un milieu de volume total 2 ml contenant 1.84 mg de ph~nazinem~tosulfate, 60 ~g de dichloroph~nolindophenol, 147 ~g de cya- nure de sodium, 2.49 mg de succinate de sodium, du tampon phosphate 20 mM (pH 7.6). Pour obtenir une activit~ enzymatique maximale, la fraction mitochondriale est raise ~ incuber dans h cuve pendant 15 rain en presence du tampon phosphate et du cyanure de sodium. Le d~part de la r~action est donn~ par 1'addition du succinate.

Certaines mesures d'activit& enzymatiques sont faites, comme il est indi- ~lu~ dans le texte, en pr&ence de 50 ~g de coenzyme QI 0 ajout~ en solution

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dans 30 ~l d'~thanol. Nous avons v~rifid que l'addition de 30 t~l d'~thanol ne modifiait pas les valeurs des activit~s enzymatiques.

Les protdines sont dosds par la m~thode de Lowry s et le phosphore phos- pholipidique par le m~thode de Shibuya et coll. 9

RESULTATS

La fraction mitochondriale non traitSe est en bon dtat physiologique. Le "contr61e respiratoire", mesurd par polarographie 10, est d'environ 1.80 (rdf. 11) et le rapport ADP/O mesurd pour l 'oxydation du succinate varie de 1.2 ~l 1.4 (r~f. 11).

Effets du traitement de la fraction mitochondriale par diff$rentes solutions ac$toniques ~ 1 O, 30, 50, 70 et 90% ou par le milieu de lavage

Dans le but d'extraire des quantitds croissantes de lipides, nous avons trait~ les fractions mitochondriales par des solutions acdtoniques ~l 10, 30, 50, 70 et 90%. Un traitement identique oi~ la solution ac~tonique est remplacde par le milieu de lavage nous sert de t~moin.

Dans le Tableau I sont exprim~es les teneurs en phosphore phospholipidique rapport~es au milligramme de prot~ines de fractions mitochondriales ayant subi ces diff~rents traitements. Nous pouvons observer une augmentation du rapport phosphore/prot~ines ~ la suite des traitements par les solutions ac~to- niques ~ 10 et 30% par rapport ~l un m~me traitement par le milieu de lavage. Pour des concentrations en acdtone sup~rieures ~l 30%, le rapport phosphore/ prot~ines d$croit jusqu'~ ce que 80% des lipides totaux soient extraient par une solution ac~tonique ~l 90%.

Les quatre complexes enzymatiques suivants, NADH--cytochrome c-r~luc- tase, NADH dSshydrog~nase, succinate--cytochrome c-r~ductase et succinate ddshydrogdnase ont un comportement identique (Tableau I): le traitement de la fraction mitochondriale par les solutions acdtoniques ~l 10 et 30% en- traine une augmentation de l'activit~, rapport~e au milligramme de protdines, de chacun des quatre complexes enzymatiques ~tudids; par contre, l'activit~ de ces complexes diminue considSrablement ~1 la suite des traitements par les solutions ac~toniques ~ 50, 70 et 90%. A cette derniSre concentration en acd- tone, l'activit~ de la succinate--cytochrome c-r~ductase devient nulle.

Effets des traitements de relipidification I1 a ~td possible de restaurer compl~tement l'activit~ de la NADH--cyto-

chrome c-r~ductase (Fig. 1) et partiellement celle de la NADH ddshydrog~- nase (Tableau II) perdues apr~s un traitement par une solution acStonique ~l 90%, par l'addition de lipides mitochondriaux sous forme micellaire et de co- enzyme Q10. Cependant, cela n'a pas 6t~ possible pour la succinate--cyto- chrome c-r~ductase et pour la succinate d~shydrog~nase. Ce r~sultat different

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TABLEAU I

EFFET DE DIFFERENTS TRAITEMENTS D'UNE FRACTION MITOCHONDRIALE SUR LE R~APPORT/~g DE PHOSPHO~E PHOSPHOLIPIDIQUE PAR MILLIGRAMME DE PROTEINES ET SUR L'ACTIVITE DES QUATRE COMPLEXES ENZYMATIQUES SUIVANTS! NADH-cytochrome c-r~duetase, NADH d}shydrog~nase, succinate--cytochrome c-r}ductase et succinate d~shydrog~nase. Les chiffres entre parentheses sont calculus en prenant comme base 100 les valeurs ex- prim~es dans la premiere colonne (traitement par le milieu de lavage). Les chiffres du tableau proviennent d'une seule d'exp~riences pr~sent~e ~ titre d'exemple. Trois autres s~ries d'ex- p~riences ont donn~ des r~sultats similaires.

Traitement d'une fraction mitochondriale par

Milieu Acetone Acetone Acetone Ac~toneAcStone de (10%) (30%) (50%) (70%) (90%) lavage

~g phosphore phospholipidique/ 171 197 226 201 37 34 mg prot~ines (100) (115) (132) (117) (22) (20)

NADH--cytochrome c-rdductase 3.31 4.57 6.42 0.76 0.10 0.16 (mg cyt. c r~duit/min/mg pro- (100) (135) (194) (23) (3) (5) t~ines)

NADH d~shydrog~nase (nmoles 246 320 350 204 141 132 de substrat oxyd~/min/mg pro- (100) (130) (142) (83) (57) (54) t~ines)

Succinate--cytochrome c-r~duc- 358 748 684 186 90 0 tase (~g cyt. c r~duit/min/mg (100) (209) (191) (52) (25) (0) prot~ines)

Succinate d~shydrog~nase (n- 22.7 35.1 23.8 23.8 12.4 2.7 moles de substrat oxyd~/min/ (100) (155) (105) (105) (55) (12) mg prot~ines)

signifie sans doute que le complexe enzymatique No. II (succinate--coenzyme Q-rc~ductase) est ddnaturd au cours du traitement par la solution acdtonique, ce qui emp~cherait toute restauration ultdrieure de l'activitd enzymatique i

DISCUSSION

Nous avons vou lu voir, dans ce travail, si les rdsultats acquis p r~c~demment sur l ' impl ica t ion des lipides dans l 'activitd des en zy m es des mi tochondr i e s ani- males, pouva i en t ~tre d tendus aux mi tochondr i e s v~g~tales. Les membrands des organi tes ~v~g~taux son t en effe~ g~n~ralement b e a u c o u p plus r iches en li- pides insa tur& que les membranes des mi tochondr i e s animales 2 et ce t te dif- fdrence p e u t re ten t i r sur la s t ruc tu re des membranes mi tochondr ia les .

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./.i mg cyt. c r~=duit / mg prot~ines 4

I ~ E

D

C

• D

i 2 Temps (minutes)

Fig. 1. Effets de quantit~s croissantes de lipides sur l'activit~ de la NADH--cytochrome c-r~ductase de diverses fractions mitochondriales. (A), fraction mitochondriale (28 #g de prot~ines) trait~e par le milieu de lavage. (B), fraction mitochondriale traitde par la solu- tion ac~tonique ~ 90%. (C), (D) et (E), fractions mitochondriales trait~es par la solution ac~tonique ~ 90%, puis soumises ~ la relipidification (C, 150 #g de phospholipides; D, 300 #g de phospholipides; et E, 600 ug de phospholipides). Toutes les me.sums d'activit~s enzyma- tiques sont faites en presence de 50 #g de coenzyme Q10 ajout~ en solution dans 30 ul d'~thanol.

Notre approche exp~rimentale diff~re en outre quelque peu de celle pr~- conis~e par Lester et Fleischer ~. Ces auteurs ont d'abord cherch~ ~ extraire d'embl~e le maximum de lipides, en employant pour cela de l'ac~tone pure. Puis, par l'emploi de solutions ac~toniques ~ 96 et 90%, ils ont tent~ de pr~- ciser la nature des lipides impliqu~s dans le fonctionnement des activitds en- zymatiques. De notre cSt~, dans le but de bien montrer l'existence d'une cor- r4lation entre la perte des lipides mitochondriaux et la diminution des activi- t~s enzymatiques, nous avons cherch~ ~t enlever les lipides d'une faqon pro- gressive; aussi, nous avons trait~ les fractions mitochondriales par des solutions acStoniques ~ 10, 30, 50, 70 et 90%. Un traitement identique, mais dans le- quel la solution ac~tonique est remplac~e par le milieu de lavage, nous sert de t4moin.

Le traitement des fractions mitochondriales par des solutions ac~toniques 10 et 30% se tmduit, par rapport ~ un traitement identique par le milieu de

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TABLEAU II

EFFETS DE Q UANTITES CROISSANTES DE LIPIDES SUR L'ACTIVITE DE LA NADH DESHYDROGENASE D'~NE FRACTION MITOCHONDRIALE TRAITEE PAR LA SO- LUTION ACI~FONIQUE A 90%

Traitement de la fraction mitochondriale par

Activit~ (en nmoles de substrat oxyd~/min/mg de prot~ines)

Milieu de law'ge 178

Acetone a 90% 106

Acetone ~ 90% + 48 #g de 128 phospholipides

Acetone a 90% + 96 #g de 139 phospholipides

Acetone ~ 90% + 192 #g de 150 phospholipides

Acetone ~ 90% + 263 #g de 152 phospholipides

Acetone a 90% + 336 ~g de 147 phospholipides

lavage, par une augmentation du rapport phosphore phospholipidique/pro- t~ines (Tableau I); ceci peut facilement s'expliquer en consid~mnt que le m~- lange tr~s polaire ac~tone--eau entraine une perte de prot~ines mitochondria- les d'environ 25--30%. Pour des faibles concentrations en acetone (10 --30%), les lipides ne seraient que peu ou pas extraits. La v~ritable d~lipidification n'interviendrait en fait que pour des concentrations en acetone ~gales ou sup~- rieures ~ 50%. I1 est d'ailleurs remarquable de constater que les activit& des quatre complexes enzymatiques ~tudi~s ne diminuent qu'~ partir de ces der- nitres concentrations, ce qui ~tablit bien le lien existant entre la perte des li- pides mitochondriaux et la diminution des activit& enzymatiques consid&~es.

L'augmentation des activit& enzymatiques au cours des traitements par les solutions ac~toniques ~ 10 et 30% ne peut pas s'expliquer enti~rement par la seule perte de prot~ines. Nous n'avons pas ~tudi~ ces prot~ines re je t~s dans le milieu, mais elles sont forc~ment d'autre nature que les prot~ines enzyma- tiques dtudi~es. On peut penser qu'apr~s un traitement par l'ac~tone, l'archi- tecture des membranes mitochondriales est affaiblie, ce qui pourrait entrainer une meilleure accessibilit~ des substrats aux sites enzymatiques.

L'activitd de la NADH--cytochrome c-r&tuctase est fortement abaiss~e hi suite du traitement de la fraction mitochondriale par une solution ac~toni-

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que ~ 50%; or, ~l cette derni~re concentrat ion en acetone, les lipides mitochon- driaux ne sont encore que faiblement extraits. Comme il est possible de res- taurer compl~tement par l 'addition de lipides, l'activit~ de ce complexe en- zymatique (Fig. 1), on peut exclure que la baisse d'activit~ observ~e soit due

une d~naturation des prot~ines enzymatiques. Deux explications peuvent ~tre avanc~es: (1) la solution ac~tonique ii 50% pourrait extraire pr~f~rentiel- lement un phospholipide don t le complexe enzymatique aurait un besoin ab- solu (comme cela a ~t~ montr~, sur des mitochondries animales, pour la ~- hydroxybutyrate-d~shydrog~nase 1 ~ ,13 ). (2) la solution ac~tonique ~ 50% pourrait rompre des liaisons existant entre lipides et prot~ines 14, ce qui abais- serait l'activit~ enzymatique sans pour autant entrainer une perte importante de lipides membranaires.

Finalement, pour la NADH d~shydrog~nase et la NADH--cy tochrome c-r~- ductase, il a ~t~ possible de montrer l 'existence d 'une correlation entre l'addi- t ion de quantit~s croissantes de lipides ~ des mitochondries d~lipidifi~es et la restauration (totale pour la NADH--cy tochrome c-r~ductase, partielle pour la NADH d~shydrog~nase) des activit~s enzymatiques. Tous les faits cites pr~- c~demment d~montrent , d 'une mani~re indiscutable, l ' intervention des lipides dans le fonct ionnement de la chafne mitochondriale de transport des ~lectrons chez les v~g~taux.

Plusieurs explications de la restauration par les lipides de l'activit~ de cer- taines enzymes li~es ~ des membranes animales ont ~t~ propos~es: les lipides peuvent soit servir de coenzyme ' s, soit fournir un environnement mol~cu- laire hydrophobe favorable aux transferts d'~lectrons ~ s, soit encore conf~rer aux prot~ines enzymatiques de la membrane une configuration particuli~re n~cessaire au bon fonct ionnement de ces enzymes ' s. Des recherches ult~ri- eures doivent nous permettre d'~tablir quel rSle exact jouent les lipides des membranes mitochondriales v~g~tales et commen t ces lipides favorisent la pleine activit~ des enzymes dans les membranes.

RI~SUMI~

Les lipides interviennent dans le fonct ionnement de plusieurs enzymes de la chafne de t ransport des ~lectrons de mitochondries isol~es d' inflorescences de Chou-fleur. L 'extract ion des lipides mitochondriaux par un t ra i tement ~l l 'ac~tone ~l 90% entraine une diminut ion importante de l'activit~ des quatre complexes enzymatiques suivants: NADH--cy tochrome c-r~ductase, NADH d~shydrog~nase, succinate- -cytochrome c-r~ductase et succinate d~shydrog~- nase. Les activit~s des deux premiers complexes ont pu ~tre restaurSes par l 'addit ion de lipides sous forme micellaire.

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