Malgré les progrès accomplis ces dernières années, la survie des patientes atteintesd’un cancer du sein stagne autour de 70 % à cinq ans. Les indications thérapeu-tiques sont basées sur des facteurs pronostiques (« choix du patient ») et prédictifsde la réponse thérapeutique (« choix du protocole ») qui, globalement, ont peuévolué depuis une quinzaine d’années. Ces facteurs, histologiques, cliniques etmoléculaires, sont insuffisants pour rendre compte de l’hétérogénéité évolutive dela maladie, conduisant un certain nombre de patientes vers des traitementsinadaptés, toxiques, inutiles ou inefficaces, et traduisant l’existence de sous-classespronostiques non identifiées par ces approches classiques. Etant donné la disponi-bilité croissante de nouvelles molécules anti-tumorales, il est crucial d’améliorer laclassification pronostique du cancer du sein pour affiner les indications thérapeu-tiques et améliorer la survie des patientes.

Face aux limites des approches conventionnelles, il est apparu que de nouvellespercées thérapeutiques ne seraient possibles qu’à travers une caractérisation molé-culaire plus globale, détaillée et objective de la maladie. Le cancer du sein est unemaladie génétique complexe, caractérisée par l’accumulation et la combinaison demultiples altérations moléculaires qui confèrent à chaque tumeur un phénotype etun potentiel évolutif propres. La nécessité d’une compréhension approfondie de lamaladie au niveau moléculaire se heurtait donc jusqu’à présent à des contraintestechniques, donnant peu d’informations par rapport à la complexité du processus.Depuis quelques années, la recherche biomédicale connaît une véritable révolutionavec l’apport de la génomique, fruit de deux facteurs : les avancées et les ressourcessans cesse croissantes produites par le projet Génome humain (clones d’ADN,séquences de gènes, de protéines…) et l’essor de nouvelles technologies (bio-infor-matique, robotique…) capables de les exploiter. Les techniques d’analyse molécu-laire à grande échelle qui ont ainsi été récemment développées permettent d’ana-lyser l’activité de plusieurs milliers de gènes ou protéines simultanément, dans unéchantillon en une expérience, rendant plus abordable la complexité moléculairedes tumeurs. L’hypothèse, confirmée par les travaux publiés, est que l'étude d'une

Profils d’expression génique et Puces àADN dans le cancer du sein : choix dupatient, choix du protocole

F. Bertucci

combinaison de molécules impliquées dans un phénotype complexe est plus infor-mative que chaque molécule prise isolément. Pour des raisons techniques, ce typageà grande échelle s’est d’abord focalisé sur l’étude du transcriptome (ensemble desARN d’un échantillon) au moyen de la technique des puces à ADN qui mesurent demanière quantitative le niveau d’expression au niveau de l’ARN (1, 2). Les applica-tions attendues sont multiples aux niveaux fondamental, clinique et thérapeutique(3). Au niveau clinique, plusieurs publications ont notamment suggéré l’impact decette approche dans l’évaluation pronostique des tumeurs, le cancer du sein en par-ticulier.

Puces à ADN ou DNA micro-arraysLe principe repose sur l'hybridation d'un jeu ordonné de gènes cibles (représentéspar des clones d’ADN complémentaire ADNc ou des oligo-nucléotides) immobi-lisés sur un support solide (puce ou array) avec une sonde complexe produite parrétro-transcription et marquage à partir d'un ARN d'intérêt (figure 1). Elle est ditecomplexe car elle contient, en solution, de nombreuses séquences d'ADNc en quan-tités variables, correspondant aux abondances des espèces d'ARNm dans l'ARN dedépart. L’hybridation sur la puce aboutit à la fixation sur chaque gène cible d’unequantité de l’espèce correspondante d’ARNm de la sonde, proportionnelle à sonabondance dans l’ARN de départ. Après lavage et acquisition de l’image d’hybrida-tion, le signal fixé sur chaque cible est détecté, quantifié et enregistré de façon auto-matique grâce à des logiciels d’analyse. Ce signal reflète la concentration de laséquence correspondante dans la sonde, donc le niveau d'expression du gèneconcerné. Les intensités obtenues sont ensuite normalisées, permettant de dresserpour chaque échantillon (une tumeur, par exemple) un véritable portrait molécu-laire qui pourra alors être comparé à celui d’autres échantillons. L’objectif de cetteanalyse comparative est l’identification d’une signature moléculaire (combinaisonde plusieurs gènes) permettant de définir de nouvelles classes de tumeurs sur laseule base de leur profil d’expression (approches non supervisées) et/ou de caracté-riser des classes de tumeurs associées à un phénotype d’intérêt (la survie parexemple, approches supervisées) (4). Elle fait appel à des outils bio-informatiquessophistiqués traitant l’énorme quantité des données produites.

268 Cancer du sein

Figure 1 - Principe de la mesure d’expression génique sur puces à ADN.

Profils d’expression génique et Puces à ADN dans le cancer du sein… 269

Profils d’expression et pronosticPlusieurs études rétrospectives ont suggéré le potentiel pronostique des puces àADN en cancérologie mammaire à travers l’identification de nouvelles classes pro-nostiques non identifiables par les moyens conventionnels, dans des groupes detumeurs d'apparence histo-clinique homogène, mais hétérogènes sur le plan évo-lutif. Ces études ont porté sur la recherche de profils d’expression associés à la surviesans ou avec traitement systémique (chimiothérapie CT et/ou hormonothérapieHT) en situation adjuvante (analyse de la tumeur réséquée) ou néo-adjuvante (ana-lyse de la biopsie tumorale avant CT), dans des formes localisées ou localementavancées.

Lors d’une étude pilote analysant l’expression d’environ 200 gènes candidatsdans une série de 34 cancers du sein localisés, nous avons identifié, parmi destumeurs de mauvais pronostic traitées par CT adjuvante, deux classes d’évolutiondifférente en terme de survie. Cette discrimination résultait de l’expression différen-tielle de 23 gènes (5). Nous avons ensuite analysé l’expression d’environ 1 000 gènes,incluant les 200 précédents, dans une population théoriquement homogène de 55tumeurs localisées, de mauvais pronostic (6). Toutes les patientes avaient reçu uneCT adjuvante à base d’anthracyclines. Nous avons dans un premier temps validél’intérêt pronostique de notre jeu de 23 gènes dans cette série indépendante detumeurs. Une analyse plus approfondie a ensuite identifié une signature de40 gènes, directement dérivée de la précédente, qui affinait la classification en dis-tinguant trois classes de patientes équilibrées sur les facteurs pronostiques clas-siques, mais présentant une survie globale et sans métastase significativement diffé-rente sur un suivi médian de cinq ans (figure 2). Une étude de validation rétrospec-tive est en cours aujourd’hui au niveau uni- et multicentrique.

Figure 2– Représentation en 2D des résultats de classification hiérarchique des 55 tumeurs en fonc-

tion de l’expression respective des gènes du cluster I (25 gènes corrélés à ESR1 qui codepour RE) et des gènes du cluster II (15 gènes). Pour chaque classification (attention, celleconcernant les gènes du cluster II a été pivotée de 90° pour des raisons de représentationgraphique), chaque ligne représente un gène et chaque colonne représente une tumeur. Lesgènes sont référencés par leur symbole LocusLink et les tumeurs par un numéro. Lesnuméros des tumeurs avec une évolution fatale sont notés en rouge. Pour chaque gène, lesniveaux d’expression sont rapportés au niveau d’expression médian à travers toutes lestumeurs et sont représentés par une échelle de couleur allant du vert pour les gènes sous-exprimés au rouge pour les gènes sur-exprimés. La classification hiérarchique a été appli-quée aux échantillons et aux gènes sur la base d’une similarité des niveaux d’expressiongénique : les échantillons les plus similaires entre eux sont regroupés sur l’axe horizontal,de même que les gènes sur l’axe vertical. La longueur des branches du dendrogrammereliant les éléments reflète leur degré de similarité. La représentation croisée en 2D définitquatre groupes de tumeurs (A, B, C et D). Les carrés noirs indiquent les patientes en vie audernier suivi et les carrés rouges les patientes décédées de leur maladie. Trois classes depatientes (A, B+C, D) sont définies avec une survie significativement différente.

– Courbe de survie sans métastase pour les trois classes.– Courbe de survie globale pour les trois classes.

270 Cancer du sein

Figure 2 - Classification pronostique de 55 cancers du sein localisés en fonction de l’expres-sion de 40 gènes discriminants.

Profils d’expression génique et Puces à ADN dans le cancer du sein… 271

Une équipe hollandaise a abordé le problème du sur-traitement par CT adjuvantedes tumeurs localisées sans envahissement ganglionnaire N- (7). Les auteurs ontmesuré l’expression d’environ 25 000 gènes dans une série de 97 cancers du sein nontraités par CT adjuvante. Les patientes étaient sélectionnées de telle sorte qu’unemoitié avait développé des métastases dans les cinq ans et l’autre moitié en étaitindemne au-delà de cinq ans. Une analyse supervisée réalisée sur 78 échantillons aidentifié un jeu discriminant de 70 gènes qui prédisait correctement le devenir cli-nique dans 83 % des cas. Ce jeu a ensuite été validé sur les 19 échantillons indépen-dants restants. Les auteurs ont ensuite comparé le nombre de patientes qui auraientété candidates à une CT adjuvante selon les critères consensuels de Saint-Gallen etdu NIH, ou selon ce prédicteur à 70 gènes. Les critères classiques auraient conduità traiter environ 95 % des patientes qui ont rechuté et 70 à 91 % de celles qui n’ontpas rechuté, alors que le critère moléculaire aurait permis de traiter un nombreidentique de patientes qui ont rechuté (91 %), mais un nombre bien inférieur parmicelles qui n’ont pas rechuté (27 %). Cette signature moléculaire a été analysée secon-dairement sur une série de 295 tumeurs avec et sans atteinte ganglionnaire (8) et sonimpact pronostique a été confirmé sur l’ensemble de la série, mais également chezles patientes N- et les patientes N+.

Une troisième étude s’est intéressée au cancer du sein localement avancé (9).L’équipe de Stanford a mesuré l’expression d’environ 8 000 gènes dans un jeu de78 tumeurs du sein comprenant une majorité de formes localement évoluées chezdes patientes traitées par doxorubicine en néo-adjuvant. Les auteurs ont défini unjeu de 496 gènes dont l’expression définissait cinq classes de tumeurs différentes dupoint de vue de leur signature transcriptionnelle et de la survie à long terme. Cesclasses étaient reliées au type cellulaire à l’origine de la tumeur et à certaines don-nées d’immuno-histochimie. Les tumeurs négatives pour le récepteur aux estro-gènes (RE-) étaient subdivisées en une classe présentant un profil d’expressionproche de celui des cellules épithéliales basales, une classe qui sur-exprimait ungroupe de gènes contenant ERBB2 et une classe présentant un profil proche du tissumammaire normal. Les tumeurs RE+ présentaient un profil d’expression prochedes cellules épithéliales luminales et étaient subdivisées en deux classes (luminal Aet luminal B) de survie différente. Ces résultats ont été confirmés par la mêmeéquipe sur un jeu plus étendu de 115 tumeurs (incluant les 78 tumeurs précédentes)et sur deux séries de données publiées par deux autres équipes et disponibles surInternet (10). Ces sous-types moléculaires cliniquement et biologiquement rele-vants ont été aussi validés par C. Sotiriou et al. sur 99 tumeurs localisées analyséessur des puces contenant 7 650 gènes (11), renforçant encore la validité de cette clas-sification.

Une autre étude à visée pronostique a été rapportée en 2002 par une équipe alle-mande (12) et concernait, en fait, toutes les formes cliniques du cancer du sein, desstades localisés aux stades métastatiques. Il s’agissait de l’actualisation avec les don-nées de survie d’une étude publiée l’année précédente (13). Les auteurs ont classé55 tumeurs en fonction de l’expression de 41 gènes, et ont identifié une classe depatientes présentant une survie sans métastase significativement inférieure auxautres classes. Cependant, certains aspects méthodologiques cliniques de cette étudeapparaissent peu rigoureux : l’analyse de survie n’a pas pris en compte les tumeurs

272 Cancer du sein

T4, et des paramètres pertinents pour le pronostic tels que le traitement, l’âge despatientes, le statut RE, le grade et le type histologique des tumeurs n’ont pas étémentionnés. Aucune étude n’a été publiée ensuite par ce groupe sur le sujet.

Plus récemment, E. Huang et al. (14) ont analysé l’expression de plus de 12 000gènes (puces Affymetrix) dans une série de 89 cancers du sein localisés. L’étude pro-nostique a porté sur 52 tumeurs ayant 1 à 3 ganglions axillaires envahis (18 rechutesà trois ans contre 34 sans rechute). La méthode d’analyse était originale et utilisait,non pas les gènes individuellement, mais 496 métagènes préalablement définis park-means clustering afin de réduire la multidimensionnalité du jeu de données. Parune méthode de « partitionnement successif » des échantillons, les auteurs ont iden-tifié un prédicteur moléculaire multigénique permettant de classer correctement90 % des cas (estimation par la méthode leave-one-out cross-validation).

Enfin, l’étude la plus récente a été publiée en juin 2004 (15). Elle concernait lepronostic des formes localisées traitées par HT adjuvante. Les auteurs ont analysél’expression de plus 22 000 gènes (puces Agilent) dans une série de 60 cancers dusein localisés RE+ traités en adjuvant par tamoxifène. L’analyse parallèle des échan-tillons tumoraux « entiers » et micro-disséqués a permis de réduire la liste des gènesassociés à la rechute métastatique à deux gènes HOXB13 et IL17BR. Le ratio de l’ex-pression des deux gènes représentait un facteur pronostique fort et indépendant enanalyse uni- puis multivariée, qui a été ensuite validé sur les mesures d’expressiondéfinies par RQ-PCR sur les mêmes échantillons congelés, mais aussi sur 20 échan-tillons indépendants inclus en paraffine. Il s’agit de la première étude par puces àADN s’intéressant à l’évolution sous HT.

Profils d’expression et réponse à la chimiothérapieTrois études rétrospectives récentes se sont intéressées plus directement à la réponseà la CT dans le cancer du sein localisé et localement avancé, traité par CT première.

Toutes suggèrent le potentiel des profils d’expression définis sur puces à ADNdans la prédiction de cette réponse.

La première a été rapportée dans le Lancet par l’équipe du Baylor College deHouston (16). L’analyse, réalisée sur puces à 12 000 gènes (Affymetrix), a concerné24 tumeurs localement avancées traitées par 4 cures de taxotère en néo-adjuvant.L’analyse supervisée a identifié un jeu de 92 gènes dont l’expression était corrélée àla réponse clinique (12 répondeurs et 12 non-répondeurs). En expérience de cross-validation, le taux de classifications correctes était de 88 %.

La seconde étude a été rapportée par l’équipe du MD Anderson (17). Les auteursont analysé l’expression de 30 721 clones (puces personnelles) dans 42 cancers dusein T2-T4 traités par un schéma séquentiel de CT délivrant 12 cures hebdoma-daires de Taxol®, suivies de 4 cures de FAC en néo-adjuvant. L’analyse superviséeportant sur la réponse histologique après CT dans un learning set de 24 tumeurs(13 RCH ou réponse complète histologique et 11 non-RCH) a identifié une signa-ture de 74 clones dont l’expression classait correctement 78 % des tumeurs du vali-dation set (18 tumeurs).

Profils d’expression génique et Puces à ADN dans le cancer du sein… 273

La dernière étude concerne le cancer du sein inflammatoire (18). Nous avonsanalysé l’expression de 8 000 clones (puces personnelles) dans 37 cancers du seininflammatoires. Pour 26 patientes, la réponse histologique à une CT première à based’anthracycline était documentée, incluant 9 RCH+ et 17 RCH-. Par analyse super-visée, nous avons identifié un jeu de 85 gènes discriminants dont l’expression com-binée permettait de séparer cette population en deux groupes présentant respecti-vement 70 % de RCH pour l’un et 0 % pour l’autre (figure 3).

Figure 3 - Classification pronostique de 26 cancers du sein inflammatoires en fonction del’expression de 85 gènes discriminants. Les gènes sont ordonnés de haut en bas en fonctionde leur score discriminant mesuré en analyse supervisée. Les tumeurs sont ordonnées degauche à droite en fonction du coefficient de corrélation de leur profil d’expression avec leprofil médian des tumeurs en réponse complète histologique (RCH). La ligne orange définitdeux classes de tumeurs ayant des taux de RCH significativement différents (rectangle noir,RCH ; rectangle blanc, absence de RCH).

274 Cancer du sein

ConclusionDans toutes ces études, les signatures multigéniques pronostiques et/ou prédictivesparaissaient plus performantes que les classifications conventionnelles basées surdes facteurs histo-cliniques et moléculaires. Des études de validation sont, bienentendu, nécessaires avant toute application clinique sur de plus grandes sériesrétrospectives de patientes. Certaines sont en cours de manière uni- ou multicen-trique, et précèderont l’éventuelle incorporation de ces signatures dans des essaiscliniques prospectifs, premier niveau d’application clinique de cette approche.Le succès de ces études dépendra de collaborations étroites entre chercheurs de dif-férentes disciplines (cliniciens, anatomo-pathologistes, biologistes, bio-informati-ciens, mathématiciens…), de la qualité et de la quantité des échantillons tumorauxdisponibles (avec leurs annotations informatisées cliniques, histologiques et molé-culaires), de l’amélioration de la technologie et des outils d’analyse, et, bien sûr, dubon design des essais.

Références1. The Chipping Forecast (1999) Nature Genet 21 Supplement: 1-602. Granjeaud S, Bertucci F, Jordan BR (1999) Expression profiling: DNA arrays

in many guises. Bioessays 21: 781-903. Bertucci F, Houlgatte R, Nguyen C et al. (2001) Gene expression profiling of

cancer by use of DNA arrays : how far from the clinic? Lancet Oncol2: 674-82

4. Brazma AVilo J (2000) Gene expression data analysis. FEBS Lett 480: 17-245. Bertucci F, Houlgatte R, Benziane A et al. (2000) Gene expression profiling of

primary breast carcinomas using arrays of candidate genes. Hum Mol Genet9: 2981-91

6. Bertucci F, Nasser V, Granjeaud S et al. (2002) Gene expression profiles ofpoor-prognosis primary breast cancer correlate with survival. Hum MolGenet 11: 863-72

7. van 't Veer LJ, Dai H, van De Vijver MJ et al. (2002) Gene expression profi-ling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415: 530-6

8. van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ et al. (2002) A gene-expression signa-ture as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 347: 1999-2009

9. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R et al. (2001) Gene expression patterns ofbreast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications.Proc Natl Acad Sci U S A 98: 10869-74

10. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J et al. (2003) Repeated observation of breasttumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad SciUSA 100: 8418-23

11. Sotiriou C, Neo SY, McShane LM et al. (2003) Breast cancer classification andprognosis based on gene expression profiles from a population-based study.Proc Natl Acad Sci USA 100: 10393-8

Profils d’expression génique et Puces à ADN dans le cancer du sein… 275

12. Ahr A, Karn T, Solbach C et al. (2002) Identification of high risk breast-cancer patients by gene expression profiling. Lancet 359: 131-2

13. Ahr A, Holtrich U, Solbach C et al. (2001) Molecular classification of breastcancer patients by gene expression profiling. J Pathol 195: 312-20

14. Huang E, Cheng SH, Dressman H et al. (2003) Gene expression predictors ofbreast cancer outcomes. Lancet 361: 1590-6

15. Ma XJ, Wang Z, Ryan PD et al. (2004) A two-gene expression ratio predictsclinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen. Cancer Cell5: 607-16

16. Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A et al. (2003) Gene expression profilingfor the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breastcancer. Lancet 362: 362-9

17. Ayers M, Symmans WF, Stec J et al. (2004) Gene expression profiles predictcomplete pathologic response to neoadjuvant paclitaxel and fluorouracil,doxorubicin, and cyclophosphamide chemotherapy in breast cancer. J ClinOncol 22: 2284-93

18. Bertucci F, Finetti P, Rougemont J et al. (2004) Gene expression profiling formolecular characterization of inflammatory breast cancer and prediction ofresponse to chemotherapy. Cancer Res 64: 8558-65

276 Cancer du sein