I I I Bull. SOC. Chim. Belg., 62, pp. 611-618, 2 fig., 1953 I

La Prkparation de I’acide orotique et de quelques dkrivks

H. VANDERHAEGHE (Louvain)

R b s d . - L’acide orotique a C t C prCpar6 a partir de l’acide thio-orotique et de l’acide 2-mCthylmercapto-6-hydroxypyrimidine-4-~ carboxylique. Les spectres U.V. de ces produits ainsi que de leurs esters ont BtC dkterminks, et leur pouvoir bactkriostatique a C t C examinC.

L’acide orotique (ou acide uracil-kcarbonique (11), isole pour la premibre fois par Biscaro et Belloni (l), 9 partir du lait, est actuellement l’objet d’un inter& renouvele. On a d6montrC rbcemment que ce derivk de l’uracil est un facteur de croissance pour le Lactobacillus Bulgaricus (”. Cette activitb s’explique par la demonstration de son incorpora- tion dans les acides uridyliques et cytidiliques, tous deux composants des acides nuckiques (9.

Cette transformation se produit aussi chez les animaux (notamment chez le rat (”. Ces donnees nous ont incites a prbparer des dbrives d’acide orotique, susceptibles d’influen- cer la croissance des bacthries.

Johnson et Caldwell ( 5 ) et Bachstez (R) ont dbmontrk que le 4-carboxyuracil, prepare par Miiller (’) par conden- sation de l’urbe avec l’oxalacetate d’ethyle d a m l’acide

(l) BISCARO, BELLONI, Ann. SOC. Chim. Milano XI, 1905; Chem. Zentr., 11, 63, 1905.

(2) WRIGHT. HUFF, SKEGGS, VALENTIK, BOSSHARDT, J . Am. Chem. Soc., 72, 2312, 1950.

(3) WRIGHT, MILLER, SKEGGS, HUFF, WEED, WILSON, J . Am. Chem. Soc., 73, 1898, 1951.

(3 BERGSTROM, ARVIDSON, HAMMARSTEN: ELIASSON: REICHARD, VON ULISCH, J . Bid. Chem., 177. 495, 1949.

( 6 ) JOHNSON, CALDWELL, J . Am. Chem. SOC., 51, 874, 1929. (6) BACHSTEZ, Ber., 63, 1000, 1930. (’) MULLER, J . Prakt. Chem., [2] 56, 488, 1897.

612 H. VANDERHAEGHE

acetique sature d’acide chlorhydrique, Btait identique a l’acide orotique. Nkanmoins le premier compose isole n’est pas l’ester de l’acide orotique, mais un derive de l’hydantoi- ne (I), comme l’ont demontre Mitchell e t Nyc (*). Et ce produit est transform4 en uracil, par hydrolyse alcaline Li chaud.

NH2

NH2

o=c\ ’ i- COOC2H,

co HCI HOAc NH - CO /NH-CO

\NH-C= CH--COOC,H, <joo I

29 Yo KOH NH

KOH OC\ ’ I f NH-C=CH-COOH

I I CH,

-- -+ oc

I i COOC,H, I l o O O L / \

I I oc co

H N CH

I I1 COOH

Le rendement total de cette operation est assez faible (18 yo). Et ce resultat est d’autant plus devaforable, que l’oxala- cktate d’6thyle ne peut &re is016 de l’enolate de sodium correspondant qu’avec des pertes considkrables. Nous avons alors examine la possibilitk d’utiliser directement ce dernier produit, pour une condensation en milieu alcalin, comme dans la mkthode generale de preparation des derives de thiouracil.

L’oxalacetate d’kthyle sod6 se condense avec la methyl- pseudo-thiouree et la thiouree et donne, avec des rendements acceptables, l’acide 2-mCthylmercapto-6-oxypyrimidine-4-car- boxylique (111) (48 %) et l’acide thio-orotique resp. (IV) (32 %). (*)

( 8 ) MITCHELL, NYC, J. Am. Chern. SOC., 68, 674, 1947. (*) Ida prCparation de l’acide thioorotique par condensation alcaline

a C t B dCcrite r6ceniment par ERNSTING, NAUTA, Rec. Trav. Chim. 72, .527 (1953).

A C I D E OROTIQUE ET DERIVES 61 3

/% s = c I COOC,H,

\

I COOH I11

NH

IV I COOH

La transformation de I11 en acide orotique se fait trks facilement par chauEfage en milieu acide chlorhydrique con- centre.

La d6sulfurisation de l’acide thioorotique (IV) etait plus difficile a realiser. Le chauffage avec l’acide monochlor- ac6tique en milieu aqueux ne donne pas de resultat, comme cela a deja et6 signal6 par Bachstez (9). Neanmoins le fait qu’il etait possible par cette methode, d’obtenir l’acide orotique a partir de l’ester de l’acide thio-orotique, prouva que cette transformation etait realisable. I1 suffit de solubi- liser IV avec son equivalent d’alcali, pour obtenir, avec de bons rendements, le produit desir6.

Nous avons pr6pare les esters methyliques et kthyliques de l’acide orotique. Le point de fusion de l’ester methylique (240-2O) est identique a celui indique par Wheeler (lo) mais different de celui de Bachstez (‘j) (298-3000) dec.); nous observons aussi une difference pour l’ester Bthylique : 207-8.5O, et Bachstez : 324O (dec.). L’analyse klementaire et le spectre U.V., qui est pratiquement identique a celui de l’acide oroti- que, prouve la structure de nos produits. Ces esters ne se dkcomposent pas a leur temperature de fusion, comme cela

(9) BACIISTEZ, Be?.., 64, 322, 1931. (lo) WHEELER, Am. Clww. J . , 38, 364.

614 H . VANDERHAEGHE

a ete indiquk par Bachstez (?. Ceci laisse supposer que ses esters contenaient encore de l’acide orotique (F

Absorption dans U. V. (solution aqueuse)

Acide orotique (11) max. min.

Ester ethylique de 11. max. min.

Acide thioorotique (IV) max.

milieu du pallier min.

Ester Cthylique de IV. max.

milieu du pallier min.

h i d e 2-mCthylmercapto- max. 6-hydroxy-pyrimidine-4- carboxylique

min.

Ahp)

278 241 284 240 216 270 310 238 215 270.5 310 235 235 293

216 274

3350 dhc.).

E

6.800 1.840 7.550 1.560

16.600 18.600 4.550 4.400

13.250 19.800 3.470 3.250

13.120 4.610

9.mo 4.000

L’est6rification du groupe carboxyle de l’acide orotique et thio-orotique ne modifie pas d’une manikre sensible le spectre U.V. I1 en est de mkme si on ajoute aux solutions un Bquivalent d’alcali.

Les spectres de I1 et IV sont similaires a ceux de l’ura- cil (“9 la) et du thiouracil (9, et nous avons adopt6 la struc- ture dichtonique, prouvke pour ces produits (12, la). L’analogie du spectre de I11 avec celui de la 2-methylmercapto-4-methyl- -6-hydroxypyrimidine (9 indique une structure dihnolique pour cet acide.

Le spectre de toutes les substances change d’une faqon apprkciable lorsqu’elles sont dissoutes dans un exces d’alcali, mais ces variations n’ont pas 6th Btudihes d’une fagon syst6- matique.

(11) HEYROTH, LOOFBOUROW, J . Am. Chem. SOC., 53, 3441, 1931. (la) MARSHALL, WALKER, J. Chem. SOC., 1004, 1951. (13) SHUGAR, Fox, Bull. SOC. Chim. Belg., 61, 293, 1952.

ACIDE OROTIQUE ET DERIVES 615

Fig.

loa E

4.0

3.5

3.0

Fig. 2. - Acide thio-orotique et acide 2-mbthylmercapto-6-oxy- pyrimidine-4-carboxylique dans l'eau.

6 16 H. VANDERHAEGHE

L’activite in vitro contre le bacille de Koch (souche HRv 37, milieu Dubos), Escherichia coli e t Staphylococcus aureus, a 6tB examinee pour toutes les substances preparees, mais on n’a pas trouve de pouvoir inhibiteur notable.

PARTIE EXPERIMENTALE

Oxalacktate d’hthyle

On obtient I’enolate sodique en faisant rkagir pendant trois jours 23 g de sodium mktallique dans 1’6ther avec 1 mole d‘acktate e t d’oxalate d’kthyle selon Wislicenus (14). Le produit est essork et skchk.

Ainsi on obtient environ 200 g de sodium oxalacktate d’kthyle. On peut aussi dissoudre ce produit dans l’eau (1,5-21it.) et aprits

avoir ajoutk de l’kther, acidifier avec de l’acide sulfurique diluk. AprCs avoir skpark les deux couches, on extrait encore deux fois; la solution kthkrke est skchke et ensuite kvaporke. Puis le produit est distille sous vide. I1 est nkcessaire de le redistiller, car pendant la premiCre operation le vide est irrkgulier a cause de la dkcomposition. 60 g Eb 25 mm : 1300.

Acide orotique (11)

1. On condense l o g d’iirke et 30g d‘oxalacktate d’kthyle dans 15 rnl d’acide acktique saturk d’acide chlorhydrique (cfr. 7). On obtient 5.0 g de 5(carbethoxymethylidbne)-hydantoine F 181 - 50. Ce produit est hydrolysk pendant 2 h a la temperature de GO-50 en prksence de 20ml KOHN. AprCs addition de 30ml d’acide chlorhydrique conc., on obtient 4.8 g (rend. 18 yo) de cristaux F. 332-50 (dkc.) (ref. 8).

2. 10 g de 2-mkthylmercapto-4-carboxy-6-hydroxypyrimidine sont chauffks a reflux pendant 1% h dans 40 ml d’acide chlorhydrique con- centrk. Le produit est essork et lave & l’eau : 6.6 g (rend. 80 %) F. 335-80 (dec.) Par estkrification avec un mklange CH,OH-HCl on obtient un produit identique a celui obtenu avec de I’acide orotique prkpark selon la mkthode prkckdente.

3. On chauffe 1 g d‘ester Bthylique de l’acide thio-orotique et 1 g d’acide monochloracktique dans 20 ml d’eau, pendant 3 h. La solution, concentrke jusqu’a mi-volume, abandonne a p r b refroidissement, 0.55 g de cristaux. F. 315-20° (dec.) Aprbs avoir redissous le produit dam 5 % NaOH et reprkcipitk avec un mklange HCl-HOAc, le point de fusion est 335-80 (dkc.).

4. On dissout 1.7 g d‘acide thio-orotique dans 10 ml NaOH N. et 10 ml d’eau. On ajoute 1.7 g d’acide monochloracktique et chauffe pendant 3 h. Aprits addition d’acide chlorhydrique, on essore les cristaux 1.34g (rend. 85 %) F. 335.70 (dkc.).

(14) WISLICENUS, Ann., 246, 315, 1888.

ACIDE OROTIQUE ET DERIVES 617

Esters d’acide orotique

On suspend 1 g d‘acide orotique dans 200 ml d’alcool et sature avec de I’acide chlorhydrique gazeux. Aprks avoir chauffk a reflux pen- dant 8 h, on enlkve par filtration le petit rksidu d’acide orotique non dissous et le Piltrat est concentre jusqu’a mi-volume. On essore l’ester qui s’est separd et recristallisk dans l’eau.

F % N calc. trouvC

ester mkthylique 240-2” 16.47 16.45-16.47 ester kthylique 207-80 15.21 15.44-15.44

h i d e de l’acide orotique On dissout 500 mg d’ester mkthylique dans 15 ml d‘eau chaude,

on ajoute 10 ml d’ammoniaque cone., et laisse a la tempkrature ordinaire pendant deux jours. On essore les cristaux (200 mg) et recristalise dans 15 ml d’eau. Le produit se dkcompose de 255 a 2900.

yo N Calc. 27.11 trouvk 26.57 - 26.53.

2 - m8thylmercapto- 4- carboxy- 6- hydropyrimidine ( 111)

21 g (0.1 mole) de sodium oxalacktate d’kthyle sont dissous dans 200 rnl de solution de NaOH a 4 yo. On ajoute 14 g (0.1 mole) de mbthyi- pseudothiourke sulfate et on laisse a la temperature ordinaire pendant 40 h. Ensuite on acidifie avec de l’acide chlorhydrique concentre (20 ml) 8.9 g (48 yo) de produit. F. 235-40O (d6c.). Le rendement ktait un peu plus faible (7.6 g) avec un oxalacktate d’Cthyle sod6 commercial.

On purifie ce produit en le dissolvant dans la soude diluke ( 5 yo) et en reprecipitant avec un melange d’acide acdtique et chlorhydrique. On obtient des cristaux blancs. F. 250-2O (dkc.).

”/b N. calc. 15.06 trouvk 15.06-15.07.

Acide thio-orotique (IV)

1. Dans l’eau On dissout 21 g (0.1 mole) d’oxalacktate d’dthyle sod6 dans 250 ml

d’eau contenant 4 g de NaOH, on ajoute 7.6 g (0.1 mole) de thiouree et laisse la solution B la tempkrature 0rdinail.e pendant un jour. Le produit est prkcipitk par acidification avec 15 ml d’acide chlorhydrique con- centrk et 10 ml d’acide acktique. 5.3 g (32 yo) de cristaux jaunes F 318-200 (d6c.). L’acide thio-orotique est purifik en traitant la solution dam de la soude avec du charbon actif. et en acidifiant ensuite. F. 319-210 (dec.).

2. Dans l’alcool. On chauffe, sur bain-rnarie, 42 g de sodium oxalacktate d’kthyle

et 15.2 g de thiourke dans 400 ml d’alcool pendant 3 h. Ensuite l’alcool est Bvapork sous vide. Le rksidu est dissous dans 300ml d’eau, et

618 H. VANDERHAEGHE

l’acidification avec 20 ml HC1 conc. donne une huile qui ne cristallise pas. Cet ester est saponifik par ajoute de 16 g NaOH, e t chauffage pen- dant 45 min. En acidifiant cette solution, on obtient 8 g (23 %) de cris- taux jaunes F 315-200 (dkc.). En concentrant les eaux-mhres, on rCcolte encore 2.25 g d’un produit brun F. > 4000, de structure inconnue.

Quand on effectue la condensation dans de l’alcool contenant de l’alcoolate de sodium, on obtient uniquement le produit fondant au dessus de 4000.

L’oxalac6tate d’ethyle sod6 du commerce a donne les mkmes ren- dements dans les diffhrents modes operatoires.

Esters

d’acide orotique. 11s sont prkparks selon le mode opkratoire indiquk pour les esters

Ester m6thylique F 260-10 Ester Cthylique F 196-80 yo N calc. 14.01 trouvk 14.01-14.02. Des titrations klectrom6triques des diffkrents acides ont donn6

les valeurs de neutralisation thkoriques, avec une inflexion pour l’acide orotique (pKa : 4 x e t deux inflexions pour l’acide 2-mhthyl- mercapto-6 - hydroxypyrimidinecarboxylique - 4 - (pKa : 4 x et 1.6 x 10-8) et pour l’acide thio-orotique (pKa : 1.8 x e t 1.6 x 10-8).

(r6f. 9).

S.A. R.I.T. (Genval)

Medegedeeld aan de Vlaamse Chemische Vereniging op 26 Augustus 1953.