Les bonnes pratiques dhygiène dans la filière du café Lanalyse de lOTA: une composante importante des programmes de prévention dOTA Module 6.2

Les bonnes pratiques d’hygiène dans la filière du café

L’analyse de l’OTA:une composante importante des

programmes de prévention d’OTA

Module 6.2

Diapositive 2Module 6.2 – L’analyse de l’OTA:

une composante importante des programmes de prévention d’OTA

Justification des analyses d’OTA

Soutien des programmes de surveillance: Production de données sur le degré et la répartition de

la contamination,

Mesure de l’impact des mesures préventives et optimisation des programmes;

Certification que la teneur d’OTA est conforme aux spécifications officielles ou à celles des acheteurs,

Contribution à la recherche visant à améliorer les connaissances et à tester des solutions.



Planification des analyses d’OTA

Pour bien exploiter les résultats des analyses d’OTA, il est indispensable que les services d’analyse aient: Les compétences et le matériel nécessaires

pour effectuer les analyses aux niveaux de sensibilité et de quantification requis,

La capacité de procéder au nombre d’analyses requis dans les délais fixés.



Investissements nécessaires à l’analyse d’OTA

Locaux adaptés: Réduction des risques professionnels; environnement

permettant d’assurer le bon fonctionnement et l’entretien du matériel;

Equipements et matériels nécessaires: Pour mettre en oeuvre le dépistage et les méthodes

d’analyse officielles, suivant le besoin; Personnel compétent et qualifié:

Analystes ayant un niveau de deuxième cycle universitaire ou titulaires d’un diplôme d’études supérieures; techniciens qualifiés pour assurer l’entretien et la réparation du matériel; personnel de soutien; formation périodique en cours d’emploi.



Les coûts sont-ils acceptables?

Renforcement de la confiance dans le secteur national du café: Lorsque l’on peut clairement démontrer la qualité des

programmes officiels de surveillance et d’analyse d’OTA, la confiance des importateurs et la place du pays dans le commerce international s’en trouvent renforcées.

Protection des consommateurs nationaux: Contre le risque que le café de qualité inférieure ne soit

destiné aux consommateurs locaux. Recouvrement des coûts par l’industrie:

Un recouvrement au moins partiel des coûts est envisageable.



Questions techniques relatives aux programmes d’analyse d’OTA

Les principaux volets des programmes d’analyse d’OTA sont: Les plans d’échantillonnage, Les méthodes d’analyse validées, Le système d’assurance de la qualité.



Plans d’échantillonnage de l’OTA dans le café

La distribution hétérogène d’OTA dans les lots de café justifie qu’une attention particulière soit portée à l’échantillonnage car il est important d’obtenir des échantillons représentatifs.

Les plans d’échantillonnage doivent être conçus par rapport à l’objectif visé: Obtenir une unité représentative pour estimer l’‘ensemble’, Caractériser un segment spécifié de la population.

L’élaboration de plans d’échantillonnage officiels a pour but de fournir des méthodes internationales afin de prévenir les litiges commerciaux d’ordre juridique et technique liés à l’échantillonnage (Codex Alimentarius).



Détermination des méthodes d’échantillonnage

Les méthodes d’échantillonnage utilisées dans le cadre des programmes de surveillance et d’analyse d’OTA doivent préciser: Les procédures de prélèvement et de

préparation des échantillons, La taille et le nombre de prélèvements

élémentaires pour un échantillon représentatif, Les critères statistiques d’acceptation ou de

refus d’un lot sur la base des échantillons prélevés.



La taille de l’échantillon et le nombre d’échantillons influent sur:

Le pourcentage de lots acceptés sur la base de concentrations inférieures à la limite réglementaire (bons lots),

Le pourcentage de lots refusés sur la base de concentrations supérieures à la limite réglementaire (mauvais lots).

Incertitudes liées à la méthode de vérification de l’OTA

Risques pour l’acheteur

Risques pour le vendeur

Aspects-clés de l’échantillonnage destiné aux analyses officielles d’OTA



Conditions requises pour les méthodes officielles d’analyse

Les méthodes doivent être validées, Exactes, Et les résultats doivent être

reproductibles (intra et interlaboratoires)

Dans les limites des critères de performance minimum établis.



Principales caractéristiques des méthodes d’analyse officielles

1. Exactitude,

2. Applicabilité,

3. Limites de détection/détermination,

4. Linéarité,

5. Précision,

6. Répétabilité

7. Sélectivité,

8. Réactivité.



Qui décide des méthodes d’analyse officielles?

Les méthodes validées peuvent être reconnues comme méthodes

officielles par:

Le Codex Alimentarius, AOAC International, Les normes nationales et

internationales.



Choix de méthodes en cas de non disponibilité ou de non applicabilité de

méthodes officielles

Validation interne – sur la base du document de l’Union internationale de chimie pure et appliquée (IUPAC) intitulé ‘Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis’.

Méthode précisée dans la norme ISO/IEC 17025:1999 ou dans les Principes de bonnes pratiques de laboratoire.



Méthodes officielles

Méthodes validées au niveau international ou par collaboration dans le cadre des

Protocoles internationaux harmonisés

Café torréfié - Entwisle et coll. 2001; AOAC 2000.09; CEN EN 14132:2003.

Café vert - Vargas et al. 2005; AOAC 2004.10. Le site web de l’AOAC ne recommande

aucune méthode de dépistage officielle pour l’ochratoxine A dans le café.



Diagramme des étapes d’analyse d’OTA

Diagramme des étapes générales

d’échantillonnage, de préparation des

échantillons et d’analyse des

mycotoxines dans les denrées agricoles

Préparation de l’échantillon

ECHANTILLONNAGE

Echantillon

Lot

Extraction

Séparation et quantification

NettoyageAnalyse de détermination de

l’OTA

BROYAGE ET HOMOGENISATIO

N

Sous-échantillonnage

Résultat de l’analyse des mycotoxines

Assurance de

qualité

analytique

(AAQ)



Evaluation des méthodes d’analyse d’OTA

Critères opérationnels importants: Exactitude et répétabilité.

Conditions de réalisation importantes: Rapidité de l’analyse, Analyse qualitative ou quantitative, Compétences requises pour opérer les

dosages, Coûts initiaux et récurrents.



Les étapes d’analyse de l’OTA:préparation de l’échantillon

Etape critique de l’analyse.

Exige du temps:

Broyage

Homogénisation

Préparation du mélange



Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction

Des solvants spécifiques sont utilisés en fonction du substrat/ou des étapes de purification/quantification



Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction

Retrouver la véritable concentration de la mycotoxine est un point critique

Solvant organique en présence d’un acide ou solvant d’extraction contenant un

bicarbonate de soude aqueux

Agitateur secoueur ou mélangeur à grande vitesse



Les étapes d’analyse de l’OTA - nettoyage

Implique essentiellement: La séparation de la mycotoxine des autres

substances extraites en même temps, L’étape de concentration initiale.

Méthodes de nettoyage: Les procédures conventionnelles sont longues et

laborieuses, Colonne d’immunoaffinité avec sorbants pour

études immunologiques en phase solide:• Un évolution importante, • Fournit des méthodes hautement sélectives.



Les étapes d’analyse de l’OTA - nettoyage

Nettoyage d’une colonne d’immunoaffinité contenant du café vert



Les étapes d’analyse de l’OTA - extraction, détection et quantification

Les méthodes disponibles sont: La chromatographie liquide avec détection

par fluorescence, La chromatographie en couche mince, Le test ELISA (acronyme de ‘Enzyme-linked

immunosorbent assay’), La fluométrie, Les instruments de lecture latérale (FLD), Le dosage immunologique par polarisation de

fluorescence (FPIA).



Les étapes d’analyse de l’OTA: extraction, détection et quantification

Nouvelles méthodes analytiques

Méthodes d’extraction rapide, peu onéreuses: Fondées sur des biosenseurs,

Kits de diagnostic rapide sur bandelette.

Chromatographie liquide couplée: Aux techniques d’onisation par

électropulvérisation en spectométrie de masse (MS),

Spectométrie de masse en tandem ou séquentielle (MS/MS).



Chromatographie liquide et analyse d’OTA

Principaux avantages: Possibilité d’automatisation, Pouvoir d’extraction, Sélectivité, Limites de détection plus faibles (0,12-0,2

g/kg).

Principaux inconvénients: Coût élevé, Exige des analyses et des techniciens

qualifiés.



Chromatographie liquide et analyse d’OTA

Détection et quantification

Chromatogramme d’une solution d’OTA standard à une concentration de 0,0218

µg/mL. Phase inverse 250x4,6 mm – 0,5µm. Détection par fluorescence. Phase mobile: acétonitrile: méthanol: eau: acide

acétique(35+35+29+1). Vitesse de filtration: 0,8mL/min.

Processeur d’échantillons automatique



Chromatographie à couche mince (CCM)

et analyse d’OTA Technique simple, rapide, économique, robuste

Principaux avantages

Relativement bon marché Expérience et compétences considérables dans les pays en développement

Utilisée dans les applications courantes

Colonne d’immunoaffinité

Prélèvements d’échantillons libres des principales interférences de substrats

Adaptée à l’analyse l’analyse CCM unidimensionelleAmélioration: sensibilité, extraction, résolution et visualisation



Chromatographie à couche mince et analyse d’OTA

Confirmation d’OTA par CCM Pulvérisation de chlorure d’aluminium et de

carbone de soude sur les plaques,

Exposition des plaques à la vapeur d’ammoniaque,

La chromatogaphie à couche mince en phase inversée est considérée comme une méthode de confirmation de la présence d’OTA dans le café.




Principaux inconvénients:

Le coût élevé des fluorodensitomètres, La quantification reste un facteur

contraignant, Les analystes doivent être capables de

quantifier la toxine par examen visuel, Le manque de résolution, La sensibilité est médiocre.




Des échantillons d’OTA standards et naturellement contaminés sont dissolus par de

l’acide acétique et du toluène (99:1, v/v) et observés sur des plaques CCM normales



Méthodes de détection pour l’analyse d’OTA

Principaux avantages:

Méthodes d’essai rapides, Faciles à utiliser, Analyse réalisable sur le terrain.




Limites: Réponse qualitative: contamination oui/non, Faux résultats négatifs, Nécessité de confirmer les résultats positifs.

Inconvénients: Coût récurrent élevé, Manque d’attention aux conditions de

prélèvement des échantillons, Tendance à ignorer les conditions

d’échantillonnage.




Kits de tests de détection du café

Ochratoxin (2 – 40ppb)

Analyse Société Nom du kit Reconnaissance Substrats primaires

Ochratoxine r-Biopharm GmbH

RIDASCREEN OTA Column - Grains de café

Ochratoxine VICAM OchraTest - Grains de café

OTA TECNA S.r.l. Immunoscreen OCHRA -

Céréales, al.animale café vert, cacao, vin

Ochratoxine Tepnel BioSytems Ltd.

BioKits OTA Assay - Céréles, fruits secs, cafévert, vin blanc

OTA et B Romer Labs AgraQuant OTAssay (2 – 40ppb) -

Orge, maïs, café vert, maïs, soja et blé

OTA et B Romer Labs AgraQuantR

ELISA Test Kit -

Maïs, orge,café vert, blé



Test ELISA pour l’analyse d’OTA

Avantages: Facilité d’utilisation, Nombre d’échantillons pouvant être

analysés simultanément.

Test de détection populaire et utile en raison de la disponibilité des anticorps policlonaux

et monoclonaux dirigés contre l’OTA.



Test ELISA pour l’analyse d’OTA

Inconvénients: Moins exact et moins sensible, Très peu de corrélations ont été montrées, Faux résultats positifs ou négatifs, À ne pas utiliser comme méthode quantitative, À n’utiliser que pour les denrées alimentaires

pour lesquelles le procédé a été largement testé et validé,

Procéder à des contrôles suffisants pour chaque test.



Méthodes spectrofluométriques pour l’analyse d’OTA

Condition requise: Utilisation de colonnes d’immunoaffinité

couplées à un fluoromètre.

Principal inconvénient: Augmentation des taux de résutats faux

positifs/faux négatifs.



Assurance de la qualité analytique

Les programmes d’assurance de la qualité analytique (AQA) sont indispensables pour valider les résultats.

L’accréditation est importante lorsque l’acceptabilité est exigée au niveau international.

Des directives détaillées concernant l’AQA pour l’analyse d’OTA sont fournies dans les documents de référence du module 5.2 du présent CD-Rom.

Documents

Les bonnes pratiques dhygiène dans la filière du café Lanalyse de lOTA: une composante importante des programmes de prévention dOTA Module 6.2