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Académie de Paris

Inter-Région Ile-de-France

Coordonnateur : Monsieur le Professeur Christophe BAILLARD

Année 2018

Mémoire pour l’obtention du

Diplômes d’Etudes Spécialisées d’Anesthésie Réanimation

Présenté et soutenu le 06 mars 2018 par

Romain HEIDAR

Impact de la composition du surnageant des culots globulaires

sur la dysfonction rénale et l’immunomodulation post-transfusionnelle

U.F.R. de Médecine : Université Paris XIII

Directeur du mémoire : Pr Karim ASEHNOUNE

Service : Anesthésie-Réanimation du CHU de Nantes

Relu et validé par : Dr Mickael VOUR’CH

Rapporteur : Pr Julien AMOUR

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Remerciements

Merci au docteur Mickael Vour’ch et au professeur Karim Asehnoune de m’avoir permis de

réaliser ce mémoire et de m’avoir conseillé tout au long de sa réalisation.

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Table des matières

Résumé ................................................................................................................................................................................... 4

Liste des abréviations ...................................................................................................................................................... 5

Introduction ......................................................................................................................................................................... 6

Contexte ................................................................................................................................................................... 6

Contexte en chirurgie cardiaque ..................................................................................................................... 7

Objectif...................................................................................................................................................................... 8

Matériel et Méthode .......................................................................................................................................................... 8

Généralités et cohorte ......................................................................................................................................... 8

Critères d’inclusions ............................................................................................................................................. 8

Techniques d’études et d’analyses ............................................................................................................... 10

Résultats ............................................................................................................................................................................. 11

Epidémiologie ..................................................................................................................................................... 11

Composition des CGRs en fonction de la durée de stockage ............................................................... 12

Lien entre la composition du surnageant des CGRs et l’insuffisance rénale ................................ 14

Lien entre la composition de l’urine et l’insuffisance rénale.............................................................. 15

Lien entre le temps de stockage et l'insuffisance rénale ..................................................................... 15

Discussion .......................................................................................................................................................................... 16

A propos de la composition des CGRs en fonction des durées de stockage à l’EFS ..................... 16

Hémolyse et DAMPs en chirurgie cardiaque ............................................................................................ 17

RBP-4 (Retinol-Binding Protein 4) .............................................................................................................. 18

Limites ................................................................................................................................................................... 19

Perspectives : Choix de nouvelles cibles ..................................................................................................... 20

Conclusion .......................................................................................................................................................................... 23

Bibliographie ..................................................................................................................................................................... 24

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Résumé Objectif : Etablir une relation entre la composition du surnageant des CGRs transfusés en chirurgie cardiaque avec la survenue d’une insuffisance rénale dans les 48 premières heures post-opératoires, la durée de stockage des CGRs et l’immunomodulation post-transfusionnelle. Méthode : Une étude de soins courant (étude Transnéphron), monocentrique, était réalisée au CHU de Nantes, contrôlée, non randomisée, ouverte et prospective. Il s’agissait d’un échantillon de 20 patients issu d’une cohorte de chirurgie cardiaque non urgente, sous CEC avec cardioplégie, sans indication de transfusions de CGRs pré-opératoire. On définissait le groupe contrôle par l’absence de dysfonction rénale, il correspondait aux patients ayant reçu entre 1 et 5 CGRs au total, indemnes d’insuffisance rénale (IR) à la 48ième heure post opératoire. L’atteinte rénale était définie par une élévation supérieure à 25% de la créatinémie pré-opératoire. L’analyse quantitative des surnageants des CGRs était effectuée par la technique Luminex. La composition des CGRs des patients ayant développé une IR était comparée avec celle des patients indemnes d’IR. La durée de stockage (DS) correspondait au délai entre le recueil du sang du donneur et la livraison du CGR au bloc opératoire. L’expression cytokinique urinaire des patients était comparée à la survenue d’une IR. Résultats : L’âge moyen des 20 patients de l’échantillon analysé était de 72 ans (SD 7,1), les motifs d’admission étaient principalement la chirurgie de remplacement valvulaire aortique et le pontage coronarien. La moyenne de transfusion cumulée à 48h etait de 1.7 CGR par patient. Le total de la transfusion des 20 premiers patients etait de 30 CGRs. Les durées de stockage allaient de 9 à 37 jours. La DS ne semblait pas avoir d’effet sur la composition du surnageant des CGRs. On retrouvait une tendance à l’augmentation de l’IR chez les patients recevant les doses cumulées les plus importantes pour : RBP4 (468239 [313157-495849] vs 405703 [248434-678338] pg/mL, p= 0.74) et CXCL-12 (150 [0.00-160] vs 0.00 [0.00-0.00] pg/mL), p= 0.54). On retrouvait une tendance à l’IR chez les patients dont le profil cytokinique urinaire présentait les doses cumulées les plus importantes pour : CD40 (3382 [2066-3649] vs 2435 [819-3831], p=0.39), Fas (609 [179-616] vs 113 [0.00-355] pg/mL, p= 0.09), IDO (10.5 [0.00-17.6] vs 0.00 [0.00-1.4] pg/mL, p= 0.19), IL-12p70 (7.2 [0.9-8.6] vs 0.6 [0.0-5.4], p=0.26), IL-15 (23 [0.00-23] vs 0.00 [0.00-0.00], p=0.08), IL-1α (0.27 [0.00-1.44] vs 0.00 [0.00-0.00] pg/mL, p= 0.08) et IL-8 (55 [49-75] vs 29 [6-50] pg/mL, p= 0.08). On ne retrouvait pas d’augmentation de survenue d’insuffisance rénale avec l’augmentation de la DS : 27 [21 ; 29] jours de stockage pour le groupe sans insuffisance rénale vs 19 [16 ; 20] jours (p= 0.06). Conclusion : On ne retrouvait pas de distribution linéaire entre la DS et les doses de cytokines que contenaient les CGRs. L’augmentation de la DS des CGRs ne semblait pas entrainer une augmentation de la survenue d’IR. Nous avons fait l’hypothèse qu’il ne faudrait plus seulement considérer la durée de stockage mais aussi la composition des CGRs car elle était très hétérogène entre les CGRs de DS réputée comme équivalente. Les cytokines contenues dans les CGRs pourraient être le principal déterminant de la morbidité post-transfusionnelle. Le RBP4 est un DAMPs libéré lors de l’hémolyse. Un apport exogène massif de RBP4 pourrait favoriser l’insulino-résistance et l’immunomodulation post-transfusionnelle. La poursuite de l’étude devrait corriger le manque de puissance de notre analyse et aboutir à la caractérisation de différents profils cytokinique responsable ou non de la survenue d’événements indésirables après chirurgie cardiaque et ainsi d’établir des stratégies transfusionnelles spécifiques chez les patients les plus à risques.

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Liste des abréviations

APC Cellule Présentatrice d’Antigène

CD Cellule Dendritique

CEC Circulation Extra-Corporelle

CGR Concentré de Globules Rouges

CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité

CPA Concentré Plaquettaire d’Aphérèse

CXCL-12 C-X-C motif Chemokine Ligand 12

DAMPs Motif Moléculaire Associé aux Dégâts

DS Durée de Stockage

EFS Etablissement Français du Sang

GLUT Glucose Transporter

HLA Human Leucocyte Antigen

IL Interleukine

IRA Insuffisance Rénale Aigue

KIR Killer Immunoglobulin cell-like Receptor

MCP Mélange de Concentrés Plaquettaire

MEC Matrice Extra-Cellulaire

NK Natural Killer

PBMC Cellules Mononucléées du Sang périphérique

PFC Plasma Frais Congelé

RBP-4 Retinol Binding Protein 4

TCR Récepteur des Cellules T

Th1 et 2 T helper 1 et 2

TLR Toll Like Receptor

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Introduction

Contexte

La sécurité transfusionnelle est un enjeu médico-économique majeur. En France, chaque année 500000 patients sont transfusés, et approximativement 15 millions de culots globulaires (CGRs) sont transfusés chaque année aux Etats-Unis. Cette thérapeutique indispensable repose sur le volontariat des donneurs, au nombre de 36 pour 40000 habitants en France. Malgré les mesures de contrôle qualité drastiques que s’impose l’Etablissement Français du Sang (EFS), la transfusion reste une source de morbi-mortalité à court, moyen et long termes [1-3]. Plusieurs études se sont intéressées à la relation entre la survenue de ces complications et les conditions de stockage à l’EFS, en particulier la durée de stockage (DS). Certaines de ces études retrouvaient un lien entre la DS à l’EFS et la survenue de ces complications [4-6]. D’autres études retrouvaient des conclusions contradictoires avec l’absence d’association entre la DS et le sur-risque lié à la transfusion [7-10]. Le lien entre la DS et la morbi-mortalité lié à la transfusion n’a donc pas encore été formellement identifié; et les mécanismes qui gouvernent ce lien ne sont pas établis. Ces interrogations ont formé la base de réflexion nous ayant conduit à réaliser notre étude. On retrouve cependant deux grandes pistes pouvant expliquer ce sur-risque :

1. Les modifications biochimiques et biomécaniques des globules rouges lors du stockage à l’EFS [11, 12]. Les principales modifications, aussi appelées lésions de stockage, sont retrouvées dans le tableau 1 suivant : pH ATP 2,3DPG Glutathion pompe Na/K

Hb libre/Heme/Fe2+/Fe3+ Fragilité osmotique et mécanique Adhésion vasculaire Agrégabilité des GRs ROS

Table 1 : Lésions de stockage des globules rouges

Ces lésions de stockages génèrent donc des DAMPS (motif moléculaire associé aux dégâts) : c’est-à-dire des protéines nucléaires, mitochondriales ou cytosoliques dont la libération dans le milieu extra-cellulaire est associée à une réponse inflammatoire, la présence de cette réponse grève le pronostic des patients [12].

2. Un autre mécanisme qui semble s’associer est l’évolution de la composition du surnageant des culots globulaires lors du stockage à l’EFS avec notamment l’apparition de molécules immunologiquement actives (malgré la leucoréduction systématique). Ces molécules sont probablement impliquées dans l’activation de cascades inflammatoires, ainsi que dans la suppression des fonctions immunitaires innées et adaptatives, responsable de l’immunomodulation post transfusionnelle [13, 14]. Le choix des cibles à doser pour notre analyse se portait donc sur ces molécules immunologiquement actives, dont la présence était connue dans les CGRs et dont le lien avec la survenue de complications liées à la transfusion n’était pas retrouvé dans la littérature.

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Un total de 22 cibles a été identifié. Elles sont présentées dans le tableau 2 suivant :

CD-40 CXCL12

Fas (APO) IDO

IL-10 IL-12p70

IL-1α IL-2

IFN-γ IL-15 IL-18

IL-1β IL-21 IL-22 IL-6 IL-8

RBP4 SFasL

TGF-β1 TGF-β2 TGF-β3 TNF-α

Table 2 : Liste des cibles identifiées à analyser

On ne retrouvait donc pas de conclusions unanimes dans la littérature concernant le lien entre la durée de stockage des CGRs et les complications liées à la transfusion [6, 7, 15, 16]. On ne retrouvait pas non plus de lien clairement établi entre la présence des différentes molécules contenues dans les CGRs avec la durée de stockage et la survenue de complications post-transfusionnelles. Il nous a alors semblé pertinent de répondre à ces interrogations. En effet l’identification de ces substances pourra guider l’EFS en matière de sécurité transfusionnelle et orientera les modifications éventuelles à apporter aux procédures de conditionnement et de stockage (Point de contrôle, Protocole de filtration et de conservation). Ces résultats permettront d’établir des stratégies transfusionnelles spécifiques chez les patients les plus à risques. Cette démarche permettra alors de sensibiliser le prescripteur, d’éclairer sa réflexion en matière de balance Bénéfice/Risque et peut être, à terme, de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Contexte en chirurgie cardiaque

Notre analyse s’est intéressée aux patients de chirurgie cardiaque. En effet ces derniers sont particulièrement vulnérables en raison des pathologies cardiovasculaires avancées dont ils sont atteints, motivant un traitement chirurgical qui ne pourra être conduit seulement grâce à la circulation extra-corporelle, indispensable à la réalisation d’une chirurgie à cœur arrêté mais responsable de phénomènes d’ischémie reperfusion non évitables [17, 18]. Dans cette spécialité la transfusion est un acte quotidien, au bloc opératoire et en réanimation, et constitue un élément essentiel de la prise en charge péri-opératoire [19]. De nombreuses études mettent en évidence une tendance à la surmortalité en chirurgie cardiaque et non-cardiaque chez les patients les plus transfusés [20-27] avec un taux de complication pouvant atteindre 30% selon les séries [28, 29]. Chez ces patients de chirurgie cardiaque, la survenue d’une défaillance d’organe est responsable d’une morbi-mortalité majeure [30-33]. L’insuffisance rénale aigue (IRA) est un de ces éléments péjoratifs en chirurgie cardiaque [34]. En effet on retrouve dans la littérature que 11% des patients après chirurgie cardiaque présenteront une dysfonction rénale transitoire caractérisée par une augmentation de la créatininémie de 25% [35-37]. Chez 3,5% des patients présentant une IRA après chirurgie cardiaque, le recours à la dialyse est nécessaire. Une augmentation modérée de la créatininémie de l’ordre de 20 % dans les 2 à 3 jours postopératoires majore significativement la morbidité

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[21, 23, 25]. Enfin, une augmentation de la créatinémie de 50% est corrélée à une mortalité hospitalière de 10% alors qu’elle est de 1% en l’absence d’IRA. L’intensité de l’insuffisance rénale aigue cotée sur l’échelle de RIFLE [28] est corrélée à la mortalité en réanimation [38]. Koch et al [6] ont étudié l’impact de l’âge des culots transfusés sur le devenir des patients de chirurgie cardiaque. Deux groupes étaient comparés : 2872 patients transfusés uniquement avec des CGRs < 14 jours et 3130 patients transfusés uniquement avec des CGRs > 14 jours. Le groupe « CGRs > 14 jours », présentait une mortalité intra-hospitalière supérieure 2,8% vs 1,7% (p = 0,004) et une plus grande fréquence d’IRA 2,7% vs 1,6% (p = 0,003). Nous avons donc choisi d’étudier spécifiquement cette population chez qui la transfusion était déjà un marqueur de risque de complications post-opératoires, sans que le mécanisme, en particulier immunologique, soit encore élucidé. En effet le lien de causalité entre la dysfonction rénale et les concentrations en médiateurs immunologiquement actifs dans les CGRs n’était pas établi. L’hypothèse dysimmunitaire devait donc être explorée ; et si certains composants présents ou apparaissant au cours du stockage était responsables d’effets indésirables marqués chez des patients vulnérables nous devions les identifier. Ceci permettrait de mettre en œuvre des stratégies de dépistage des CGRs avant transfusion.

Objectif

L’objectif principal était d’établir une relation entre la composition du surnageant des CGRs transfusés et la survenue d’une insuffisance rénale dans les 48 premières heures post-opératoires. Les objectifs secondaires étaient :

o La sécurité transfusionnelle : lien entre la durée de stockage et la composition du surnageant des CGRs.

o Etablir un lien entre la composition de l’urine et l’insuffisance rénale. o Etablir un lien entre le temps de stockage et insuffisance rénale.

Matériel et Méthode

Généralités et cohorte

Nous avons réalisé une étude préliminaire sur les 20 premiers patients inclus dans l’étude Transnéphron menée au CHU de Nantes. L’étude Transnéphron s’intéressant à l’impact de la composition du surnageant des CGRs sur la dysfonction rénale et l’immunomodulation post-transfusionnelle.

Les critères d’inclusions étaient :

o Les patients de chirurgie cardiaque non urgente sous CEC avec cardioplégie. o Sans indication de transfusions de CGRs pré-opératoire. o Sans indication de transfusion de plasma frais congelé ou concentré plaquettaire pré

et per-opératoire

Les critères d’attribution du groupe étaient : o On définissait le groupe contrôle par l’absence de dysfonction rénale. Cela correspondait

aux patients ayant reçu entre 1 et 5 CGRs au total (au bloc opératoire et dans les 4 à 6 heures post opératoires), indemnes d’insuffisance rénale à la 48ième heure post opératoire, selon la classification RIFLE.

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La survenue d’une insuffisance rénale était définie par une baisse de la clairance de la créatinine d’au moins 25% ou une augmentation de la créatinine d’au moins 1,5 fois la créatinine préopératoire observée au moins une fois dans les 48 heures post opératoires. La classification RIFLE est une classification de l’insuffisance rénale aigue en réanimation définie par un groupe d’expert en 2004, dont le grade est corrélé au devenir du patient. Cette classification permet donc de définir un facteur de risque de mortalité en fonction du degré de dysfonction rénale. Pour rappel :

Coefficient de filtration

glomérulaire (GFR)

Diurèse

Risk Créatininémie × 1,5 ou

Clcréat > 25%

< 0.5 ml/kg/h pendant 6h

Injury Créatininémie × 2 ou

Clcréat > 50%

< 0.5 ml/kg/h pendant 12h

Failure Créatininémie × 3 ou

Clcréat > 75%

< 0.3 ml/kg/h ou anurie

pendant 12h

Loss Perte complète de la fonction rénale > 4 semaines

End Stage Kidney Disease Epuration extra-rénale > 3 mois

o On définissait le groupe des insuffisants rénaux chez les patients ayant reçu entre 1 et 5

CGRs au total au bloc opératoire et dans les 4 à 6 heures post-opératoires ; et ayant développé une insuffisance rénale entre H0 et H48 sans nouvelle transfusion avant le diagnostic d’insuffisance rénale selon la classification RIFLE. H0 est définit par l’heure d’incision (début de la chirurgie) et H48 la 48ième heure après l’incision.

Les critères de non inclusion étaient :

o Chirurgie pour greffe cardiaque et/ou pulmonaire o Chirurgie urgente à réaliser dans les 24 heures ; o Patient <18ans o Femme enceinte o Majeur protégé o Majeur dans l’incapacité d’exprimer sa non-opposition o Opposition exprimée par le patient au recueil de ses données o Absence de sécurité sociale française o Patient transfusé dans les 3 mois précédant la chirurgie (CGR ou PFC ou MCP/CPA

(MCP : Mélange de concentrés plaquettaire ; CPA : Concentré plaquettaire d’aphérèse) o Chirurgie pour endocardite ou suspicion d’endocardite o Infarctus du myocarde < 15 jours o Patient sous traitement inotrope ou vasopresseur avant la chirurgie o Patient en cours de traitement immunosuppresseur o Patient sous corticothérapie depuis 21 jours ou plus o Patient Séropositif connu pour le VIH, VHB ou VHC o Traitement antibiotique en cours (hors Antibioprophylaxie péri-opératoire autorisée) o ATCD de cancer évolutif o Clairance < 40ml/min/m2 selon le MDRD lors du bilan préopératoire o Notion de RAI positifs nécessitant un cross-match avant transfusion o Patients avec sonde urinaire à demeure en préopératoire o ECBU pré opératoire positif o Infection urinaire < 21 jours avant la chirurgie o Antécédents de geste sur les voies urinaires hautes ou basses < 1 an

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Techniques d’études et d’analyses :

Paramètres d’évaluation pour le critère de jugement principal : Nous avons procédé à l’analyse quantitative des surnageants de tous les CGRs par Luminex. Nous avons comparé la composition des CGRs des patients ayant développé une insuffisance rénale avec celles des patients indemnes d’insuffisance rénale. A partir des concentrations de chacune de ces molécules dans chaque échantillon, nous avons calculé la quantité totale de molécules immuno-modulatrices reçues par chaque patient au cours de sa transfusion. Nous obtiendrons ainsi une valeur d’exposition du patient pour chaque molécule. Le test de Student a été utilisé pour comparer la composition du surnageant de chaque CGRs avec l’hypothèse principale qui est la survenue d’une insuffisance rénale. Le nombre d’échantillons de CGRs pouvant varier de 1 à 5, la valeur retenue pour chacune des 5 substances étudiées sera égale à la somme des concentrations de chaque CGRs transfusés pour un patient donné. Paramètres d’évaluation pour les critères de jugements secondaires : Pour la sécurité transfusionnelle : Chaque patient inclus a reçu entre 1 et 5 CGRs pour la procédure. Tous les échantillons de CGRs reçu par chacun des patients ont été analysés par technique Luminex (dosage quantitatif de cytokine). Nous avons un nombre d’échantillons suffisant pour décrire l’évolution de la concentration des surnageants en fonction de la DS. Pour l’approche clinique, relevé de morbi-mortalité transfusionnelle :

- Age - Type de chirurgie - Transfusion cumulée à H48 (nombre de CGRs) - Transfusion cumulé à J28 (nombre de CGRs) - Clairance pré-opératoire (MDRD en mL/min) - Créatinémie pré-opératoire (μmol/L) - Clairance post-opératoire la plus basse (MDRD en mL/min) - Créatinémie post-opératoire la plus haute (μmol/L) - Durée de traitement par Dobutamine (en heures) - Durée de traitement par Noradrénaline (en heures) - Rapport PaO2/FiO2 le plus bas de J1 à J5 - Durée de circulation extra-corporelle (en minutes) - Durée d’hospitalisation (en jours)

Collecte et Préparation des échantillons de CGRs : L’opérateur de l’EFS a conservé 3 cartouches pour chaque CGR délivré pendant la période de recueil. Ceci représentait généralement 2000L. L’échantillon était ensuite centrifugé à 3000 tours/min afin de séparer le culot cellulaire et le surnageant. Le volume de surnageant obtenu après centrifugation était de 600 à 700L. Le surnageant était ensuite aliquoté en échantillons de 50L. Sur la totalité des 600-700L : 200L étaient utilisés pour l’analyse Luminex, le reste était stocké dans notre biocollection à -80°C pour les analyses complémentaires. Nous avons préalablement validé que le contenu des tubulures était représentatif de la composition du CGRs dont elles sont issues. L’étude Transnéphron dont la cohorte est issue se déroulait de la façon suivante :

o Recueil de la non-opposition du patient par l’Anesthésiste investigateur lors de la consultation d’anesthésie préopératoire. L’information du patient et sa non opposition

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ont été notées dans son dossier médical. Par ailleurs, en parallèle de cette note d’information, un formulaire de biocollection était présenté afin d’avoir son accord écrit sur le stockage de ses échantillons dans la biocollection à des fins de recherches ultérieures.

o Les patients éligibles au protocole étaient les patients opérés de chirurgies cardiaques réglées se déroulant le matin du lundi au jeudi.

o Pour chaque patient éligible au protocole (critères de pré-inclusion), la commande de produits sanguins réalisée par l’anesthésiste-réanimateur au bloc opératoire comportait la mention « PROTOCOLE TRANSNEPHRON » permettant d’informer l’opérateur de l’EFS. Cette mention l’informait sur la période per et post opératoire. Dans le cas de la période post opératoire : l’investigateur précisais si le bilan de T6 (6 heures après l’arrivée en réanimation) post opératoire était fait ou non (la collecte des échantillons de CGRs n’avait lieu que pendant la période per opératoire et post-opératoire avant la réalisation du bilan).

o Collecte des échantillons par l’antenne de distribution EFS. Pour tous les patients identifiés, l’opérateur de l’EFS stockait à + 4°C un échantillon (3 cartouches soit environ 2000 l) du/des CGR délivré(s).

o Un bilan de routine était réalisé à l’arrivée en réanimation, à T6 (6 heures après l’arrivée en réanimation) comprenant ionogramme sanguin, urée et créatinine.

o Un prélèvement de 200ml d’urine à 8h du matin le jour qui suit l’intervention. o A 48h, l’attaché de recherche clinique statuait définitivement sur l’éligibilité du patient. o Suivi clinique en Réanimation : critère de jugement principal et secondaire ainsi que

relevé de morbi-mortalité par l’assistante de recherche clinique. o Suivi par appel téléphonique des patients à J90 et 1an post-opératoire.

Résultats

Epidémiologie : La première campagne d’analyse de l’étude Transnéphron portait sur 20 patients. On retrouvait dans cet échantillon 15 patients sans insuffisance rénale et 5 qui présentaient une insuffisance rénale selon les critères prédéfinis. L’âge moyen était de 72 ans (SD 7,1 années) pour des chirurgies principalement de remplacement valvulaire aortique et de pontage coronarien. La moyenne de transfusion cumulée à 48h etait de 1,7 CGR par patient. Les données épidémiologiques des 20 patients étudiés sont présentées dans le tableau 3 suivant :

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Moyenne Ecart-Type

Age 72,3 7,1

Type de chirurgie

Remplacement valvulaire aortique 48%

Pontage coronarien 51%

Autres 1%

Transfusion cumulée à 48 heures (nbr de CGR) 1,72 0,75

Transfusion cumulée à J28 (nbr de CGR) 2,11 1,32

Clairance pré-op (MDRD mL/min) 73,1 21,8

Créatinine pré-op (μmol/mL) 83,8 26,8

Clairance la plus basse post-op (MDRD mL/min) 80 29,2

Créatinine la plus haute post-op (μmol/mL) 84,3 37,9

Durée de traitement par Dobutamine (en heures) 3,77 11,19

Durée de traitement par Noradrénaline (en heures) 18,25 25,72

Rapport P/F mini (de J1 à J5) 226 152

Durée de ventilation mécanique (en heures) 5,3 2,53

Durée d'hospitalisation (en jours) 14,78 7,55

Durée de CEC (en minutes) 87,72 30,3

Patients n=20

Table 3 : Données épidémiologiques des 20 patients analysés

Composition des CGRs en fonction de la durée de stockage

Le total de la transfusion des 20 premiers patients était de 30 CGRs. Les durées de stockage des CGRs allaient de 9 à 37 jours. Les résultats des cibles les plus significatives présentes dans le surnageant des CGRs, en fonction de l’âge du culot en jour sont présentées sur la figure 1 suivante :

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Figure 1 : Composition des CGRs en fonction des durées de stockage à EFS

La figure 1 permettait de conclure que le profil cytokinique des CGRs ne dépendait pas de la durée de stockage à l’EFS. En effet on ne retrouvait pas de distribution linéaire entre la DS des CGRs et l’expression des cytokines qu’elles contenaient. On retrouvait à l’inverse une grande variabilité dans le contenu des CGRs.

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Lien entre la composition du surnageant des CGRs et l’insuffisance rénale

L’analyse des 22 cibles sur la première série d’échantillon mettait en évidence une tendance à l’augmentation de l’insuffisance rénale chez les patients recevant les doses cumulées les plus importantes de RBP4 (468239 [313157 ; 495849] vs 405703 [248343 ; 678338], p= 0.749) et de CXCL-12 (150 [0.00 ; 267] vs 0.00 [0.00 ; 267], p= 0.543). Les données sont présentées dans le tableau 4 suivant :

p-value

Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3

RBP4 405703 [248434;678338] 468239 [313157;495849] 413543 [248434;678338] 0,749

(pg/mL)

CXCL-12 0 [0,00;267] 150 [0,00;160] 0 [0,00;267] 0,543

(pg/mL)

Pas d'insuffisance rénale n=15 Insuffisance rénale n=5 Total n=20

Table 4 : Dosage des cibles dans les CGRs versus insuffisance rénale

Les 20 autres cibles également dosées dans le surnageant des CGRs mais dont la présence ne semblait pas en rapport avec la survenue d’une IR dans l’échantillon analysé sont présentées dans le tableau 5 suivant :

Cibles retrouvées dans CGRs et sans IR Cibles non retrouvées dans les CGRs CD-40

Fas (APO) IDO

IL-10 IL-12p70

IL-1α IL-2

IFN-γ IL-15 IL-18 IL-1β IL-21 IL-22 IL-6 IL-8

SFasL TGF-β1 TGF-β2 TGF-β3 TNF-α

Table 5 : Cibles dosées et non reliées à l’insuffisance rénale

On retrouvait donc des cibles dont les doses cumulées n’entrainaient pas d’IR, et d’autres cibles qui n’ont pas été retrouvées dans les CGRs transfusés de l’échantillon analysé ; ce qui pouvait être expliqué par la taille de l’échantillon.

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Lien entre la composition de l’urine et l’insuffisance rénale

L’analyse de la première série d’échantillon de patients mettait en évidence une tendance à l’augmentation de l’insuffisance rénale chez les patients dont les cibles suivantes étaient présentes dans les urines : CD40 (3382 [2066-3649] vs 2435 [819-3831], p=0.39), Fas (609 [179-616] vs 113 [0.00-355] pg/mL, p= 009), IDO (10.5 [0.00-17.6] vs 0.00 [0.00-1.4] pg/mL, p= 0.19), IL-12p70 (7.2 [0.9-8.6] vs 0.6 [0.0-5.4], p=0.26), IL-15 (23 [0.00-23] vs 0.00 [0.00-0.00], p=0.08), IL-1α (0.27 [0.00-1.44] vs 0.00 [0.00-0.00] pg/mL, p= 0.08) et IL-8 (55 [49-75] vs 29 [6-50] pg/mL, p= 0.08). Les résultats sont présentés dans le tableau 6 suivant :

p-value

Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3

CD40 2435 [819;3831] 3382 [2066;3649] 2877 [1615;5831] 0,39

(pg/mL)

Fas 113 [0,00;355] 609 [179;616] 179 [0,00;501] 0,099

(pg/mL)

IDO 0 [0,00;1,46] 10,5 [0,00;17,6] 0 [0,00;10,54] 0,197

(pg/mL)

IL-12p70 0,67 [0,00;5,42] 7,2 [0,99;8,6] 1,34 [0,00;7,52] 0,265

(pg/mL)

IL-15 0 [0,00;0,00] 23,1 [0,00;23,1] 0 [0,00;23,11] 0,212

(pg/mL)

IL-1α 0 [0,00;0,00] 0,27 [0;1,44] 0 [0,00;0,27] 0,08

(pg/mL)

IL-8 29 [6;50] 55 [49;75] 49 [17;55] 0,08

(pg/mL)

Pas d'insuffisance rénale n=15 Insuffisance rénale n=5 Total n=20

Table 6 : Cibles urinaires en rapport avec l’insuffisance rénale On ne retrouvait pas, à l’échelle de l’échantillon analysé, de tendance à l’insuffisance rénale sur le profil urinaire de RBP4 et de CXCL-12. Cependant ce résultat pouvait être nuancé par l’absence de lien retrouvé (par la relation de Pearson) entre RBP4 et CXCL-12 dans le surnageant des CGRs et dans les urines.

Lien entre le temps de stockage et l'insuffisance rénale On ne retrouvait pas de tendance à l’insuffisance rénale avec l’utilisation de CGRs dont la durée de stockage était considérée comme « âgée ». En effet la durée de stockage était supérieure à 14 jours dans le groupe sans insuffisance rénale et cette durée était supérieure à celle du groupe avec insuffisance rénale : 27 [21 ; 29] jours vs 19 [16 ; 20] jours (p= 0.067). Les résultats sont présentés dans le tableau 7 suivant :

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p-value

Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3 Médiane Q1-Q3

Temps de stockage

à l'EFS (jours) 27 [21;29] 19 [16;20] 25 [20;29] 0,067

Pas d'insuffisance rénale n=15 Insuffisance rénale n=5 Total n=20

Table 7 : Impact de la durée de stockage sur l’insuffisance rénale

Discussion A propos de la composition des CGRs en fonction des durées de stockage à l’EFS

Nos résultats ont mis en évidence d’importantes disparités entre la composition du surnageant des CGRs et la durée de stockage à l’EFS. En effet on retrouvait des disparités importantes entre des produits sanguins « réputés équivalents » en termes de durée de stockage. On réalise en effet le plus souvent dans la littérature une dichotomie entre CGRs « jeunes » et « vieux » à partir de 14 jours de stockage, en effet c’est la durée médiane de stockage des CGRs aux Etats-Unis [6]. Nos résultats pouvaient expliquer les conclusions contradictoires des principales grandes études sur l’impact de la durée de stockages sur le devenir des patients transfusés en chirurgie cardiaque : - Koch et al [6] ont comparé dans une étude rétrospective 2872 patients de chirurgie

cardiaque recevant des CGRs<14 jours contre 3130 patients également de chirurgie cardiaque recevant des CGRs>14 jours. On retrouvait un taux de mortalité intra-hospitalière plus élevé dans le groupe >14 jours (2.8% vs. 1.7%, p=0.004) ainsi qu’un plus grand nombre de complications post-opératoire au niveau rénal (2.7% vs. 1.6%, p=0.003) et infectieux (4.0% vs. 2.8%, p=0.01).

- Sanders et al [15] ont retrouvé des résultats similaires et significatif dans une étude

prospective observationnelle chez 176 patients de chirurgie cardiaque ; en terme d’allongement de la durée de séjour et de risque rénal.

- Voorhuis et al [7] ont conclu à l’inverse ; sur une étude rétrospective chez 821 patients de

chirurgie cardiaque, que la transfusion de CGRS>14 jours n’étaient pas associée, et de façon significative, à l’allongement de la durée de séjour, l’augmentation de la mortalité et la survenue de complications.

- Steiner et al [8] ont aussi conclu dans une étude randomisée et prospective sur 1098

patients de chirurgie cardiaque qu’il n’y avait pas de différence en termes de score de dysfonction multiple d’organe entre le groupe ayant reçu des CGRs<10 jours et celui ayant reçu des CGRs>21 jours (8.5 vs 8.7 IC 95%, -0.6- 0.3 p= 0.44)

- Yap et Al [9] ont étudié la transfusion de 670 patients de chirurgie cardiaque dans une étude

prospective observationnelle et n’ont pas retrouvé de lien significatif entre l’âge des CGRs, la mortalité et la morbidité après chirurgie (en termes de dysfonction rénale, respiratoire, infectieuse et de durée de séjour)

- Lacroix et Al [10] ont comparé dans une étude randomisée, multicentrique et en aveugle

1211 patients recevant du sang « jeune » < 8 jours et 1219 patients recevant du sang plus « vieux » (22±8.4 jours) ; chez des patients admis en réanimation (médicale et chirurgicale).

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Ils ne retrouvaient pas de différence significative de mortalité à 90 jours entre les deux groupes.

C’etait un des éclairages majeurs que nous a apporté notre étude. En effet les cytokines contenues dans les CGRs pourraient être le principal déterminant de la morbidité post-transfusionnelle, et nous avons fait l’hypothèse qu’il ne faudrait plus seulement considérer la qualité d’un CGR en fonction de sa durée de stockage à l’EFS mais en fonction des différentes cytokines qu’il contient. Nous avons en effet retrouvé une grande variabilité du contenu des CGRs en fonction de la durée de stockage. Un autre argument de notre étude qui allait dans ce sens était l’absence d’augmentation de survenue d’insuffisance rénale avec l’augmentation de la durée de stockage ; avec une tendance forte (p= 0,067) alors que le nombre total de patients de l’étude Transnéphron dont était issue notre cohorte, n’était pas encore atteint.

Hémolyse et DAMPs en chirurgie cardiaque

Cette notion de profil cytokinique nous renvoie à celle de motif moléculaire associé aux dégâts (DAMPs). En effet la réponse que va induire les DAMPs va activer le système immunitaire, en particulier les cellules présentatrices d’antigènes, afin d’initier un message de réparation tissulaire qui peut devenir incontrôlable et ainsi entrainer des défaillances d’organes. C’est le concept biologique introduit sous le terme de choc cytokinique ou « cytokine storm » [39, 40]. C’est-à-dire une auto-amplification inappropriée de libération de cytokines, responsable de défaillance d’organe. Une des principale voies d’activation des DAMPs est celle de TLR (Toll Like Receptor), en particulier TLR4. En effet de nombreux DAMPs reconnaissent le TLR4 et activent la voie de signalisation MyD88 (Myeloid Differentiation Protein 88). Cette voie va activer le facteur de transcription nucléaire NF-ΚB qui entraine l’activation de nombreux gènes de cytokines pro-inflammatoire [41-43]. Les patients de chirurgie cardiaque sont par définition soumis à une forte hémolyse. En effet la circulation extra-corporelle indispensable à la réalisation d’une chirurgie à cœur arrêté est responsable d’une hémolyse propre dont les mécanismes et la morbidité sont bien documentés [44]. La transfusion, indispensable à la prise en charge des patients de chirurgie cardiaque est responsable d’un apport exogène de produit de dégradation des globules rouges. En effet jusqu’à 25% des globules rouges d’un CGR peuvent hémolyser au cours des 24h suivant la transfusion, en dehors de toute incompatibilité transfusionnelle. Cet effet secondaire est connu et décrit par le Comité Européen de la Transfusion. En effet les recommandations européennes précisent qu’il faut utiliser des solutions additives afin d’obtenir « un taux de survie d’au moins 75% des globules rouges transfusés, au cours des 24h qui suivent cette transfusion » [45] Luten et al [16] ont réalisé la principale étude comparant le pourcentage d’hémolyse des CGRs à 24h de la transfusion en fonction de la durée de stockage (0-10 jours versus 25-35 jours) ; et retrouvaient des résultats en accord avec les recommandations européennes avec cependant une hémolyse moindre dans les CGRs « jeunes » (86.4±17.8 % versus 73.5±13.7 %) Un réservoir majeur de DAMPs était donc l’hémolyse. En effet le contenu des globules rouges libéré dans le milieu extra-cellulaire correspondait à la définition de DAMPs. On retrouvait en particulier RBP4 qui agit sur la voie TLR4 précédemment décrite [42].

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Notre étude retrouvait RBP4 dans le surnageant des CGRs, à des concentrations très élevées, supérieures à celles attendues, jusqu’à 800000 pg/mL. Ce DAMPs semblait jouer un rôle majeur dans les mécanismes de morbi-mortalité lié à la transfusion : RBP-4 (Retinol-Binding Protein 4) :

o Généralités

RBP4 est une adipokine, c’est-à-dire une substance active sécrétée par les adipocytes ; cellules qui se comportent comme un véritable organe paracrine et endocrine. Les autres principales adipokines sont l’adiponectin, la resistin, la leptin et le TFN-α [46]. RBP4 est une protéine plasmatique responsable du transport du rétinol (une des formes disponibles de la vitamine A). Il est donc directement impliqué dans l’homéostasie et la régulation du taux plasmatique de rétinol. RBP4 est secrété par le foie et le tissue adipeux, et son catabolisme a lieu principalement dans le rein. En effet, une fois lié à la transthyrethine, il peut se combiner au rétinol (sous forme holo-RBP4), son poids moléculaire est ainsi augmenté ce qui permet d’éviter sa filtration glomérulaire et son catabolisme par le rein. Après avoir relargué le rétinol, RBP4 se retrouve sous forme apo-RBP4 et est alors rapidement filtré par les glomérules et éliminé [47-49]

o RBP4, insulino-résistance et facteur de risque cardiovasculaire chez les patients de chirurgie cardiaque:

RBP4 semble être directement lié à l’insulino-résistance : L’insulino-résistance est définit par un taux normal de glucose associé à un niveau élevé d’insuline plasmatique. C’est un facteur indépendant de risque cardio-vasculaire [50]. Une des composantes communes aux différentes causes d’insulino-résistance (obésité, diabète de type 2 et syndrome métabolique), est un défaut d’expression de GLUT4, une des principales protéines trans-membranaire de transport du glucose, dont l’action dépend de l’insuline. Ce défaut d’expression a lieu exclusivement au niveau des adipocytes. Il en résulte un défaut d’homéostasie du glucose responsable d’un dérèglement d’expression des cytokines produites par les adipocytes, qui agissent comme un véritable organe paracrine et autocrine avec la sécrétion de substances responsables de l’insulino-résistance. Une de ces substances est RBP4. Ce lien entre l’insulino-résistance et l’augmentation de l’expression adipocytaire de RBP4 a bien été démontré par Yang et al [51]. Ils ont en effet créé un modèle expérimental de perte d’expression de GLUT4, responsable d’une insulino-résistance. Il en résultait une augmentation de 2.5x du taux de RBP4 dans le tissue adipeux. Ils ont aussi comparé le taux adipeux de RBP4 chez des sujets diabétiques, obèses et non-obèses. On retrouvait une augmentation de 1.9x de RBP4 chez les sujets obèses. Ce qui tendait à montrer qu’en dehors de l’hyperglycémie c’est l’insulino-résistance qui est en lien avec l’augmentation de RBP4. Le mécanisme d’action de RBP4 dans l’insulino-résistance se fait via 2 voies [51] :

- Un blocage des récepteurs à l’insuline au niveau musculaire, par inhibition de la phosphorylation du récepteur substate-1 et l’inhibition de l’activation de la phosphatidylinositol 3-kinase. L’inhibition de ce signal de transduction aboutit à un défaut d’utilisation de l’insuline par le muscle.

- Un autre mécanisme est l’activation d’une enzyme hépatique impliquée dans la néoglucogenèse : Pepck, ce qui augmente le taux basal de production de glucose par le foie.

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Les résultats obtenus par nos analyses nous ont permis de faire l’hypothèse que l’apport exogène de RBP4 via la transfusion de CGRs, à des taux parfois très important dans certains culots (jusqu’à 800000 pg/mL) pouvait donc favoriser le déséquilibre glycémique post-opératoire en induisant l’ensemble des mécanismes responsables de l’insulino-résistance vu précédemment. Ce déséquilibre glycémique étant associé en chirurgie cardiaque à la survenue d’événements indésirables infectieux, neurologiques, rénaux et cardiaques, ainsi qu’à une augmentation de la durée de séjour en unité de soin intensif [52, 53]. Il apparaissait donc pertinent d’identifier les CGRs contenant RBP4 afin de déterminer un seuil à partir duquel un sur-risque de complications apparaissait afin d’orienter la stratégie transfusionnelle chez les patients les plus à risques.

o Action de RBP4 sur les cellules présentatrices d’antigènes RBP4 induit une polarisation de type Th1 de la réponse inflammatoire au niveau des cellules présentatrices d’antigènes que sont les macrophages et les cellules dendritiques [54]. La réponse immunitaire a été historiquement caractérisée par le principe de « polarisation » (terme introduit par Mosmann [55] initialement par la description des sous populations de lymphocytes helper) :

- Th1 sécréteur d’IFN- γ, avec une réponse à médiation cellulaire : activation des lymphocytes T cytotoxiques et des macrophages M1 (ce qui correspond à leur polarisation pro-inflammatoires).

- Th2 sécréteur d’IL-4 et IL-13, avec une réponse à médiation humorale : activation des lymphocytes B avec production d’anticorps et modulation de la polarisation des macrophages : inhibition de la polarisation en M1 et initiation de la polarisation en M2, voie dite alternative sécrétrice de cytokines anti-inflammatoires.

Un des mécanismes de ce signal de polarisation est la modulation de l’expression de cytokines pro-inflammatoires par RBP4 au niveau des macrophages adipeux. On obtient alors une activation du système immunitaire inné (avec les macrophages) et du système immunitaire adaptatif (avec les LT-CD4), ce qui amplifie le signal pro-inflammatoire de RBP4. Il a été démontré expérimentalement par Moraes-Vieira et al [54] que le transfert des cellules présentatrices d’antigènes activées par RBP4 chez des souris saines entrainait alors chez ces dernières une insulino-résistance avec l’activation de l’inflammation dans le tissu adipeux et une diminution de la sensibilité à l’insuline. On pouvait alors supposer à la lumière de nos résultats, qu’un apport exogène de RBP4 via la transfusion de CGRs, pouvait initier la polarisation des cellules présentatrices d’antigènes via le récepteur TLR4, vers la voie pro-inflammatoire et ainsi participer à la cascade de libération de cytokines de l’inflammation, dont la présence grève le pronostique cardiaque des patients [56-58].

Limites : La principale limite était le faible nombre de patients, impliquant un manque de puissance. Les résultats qui ont été obtenu n’ont pas été significatifs mais l’analyse préliminaire que constitue notre étude permettait de dégager les principales cibles à explorer et les principales tendances permettant de guider la suite de l’étude Transnéphron.

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Perspectives : Choix de nouvelles cibles

L’étude préliminaire du surnageant des CGRs des premiers patients de l’étude Transnéphron a donc révélée un lien entre des substances immunologiquement actives et la survenue d’une insuffisance rénale dans les 48 premières heures post-opératoires. Une analyse systématique de la littérature au sujet de la composition du surnageant des CGRs, couplée à un éventuel intérêt de nouvelles cibles pour notre étude (c’est-à-dire avec un lien retrouvé avec l’insuffisance rénale et l’immuno-modulation) avait permis de dégager de nouvelles pistes. En effet on retrouvait environ 120 cibles protéiques décrites dans le surnageant des CGRs et ayant potentiellement des effets sur la fonction rénale et le système immunitaire. [12, 14]. Après avoir effectué un recoupage en fonction de :

o La présence des cibles dans le surnageant des CGRs. o L’intérêt de ces cibles pour notre étude. o La faisabilité de ces dosages en accord avec notre laboratoire d’immunologie du CHU de

Nantes. En effet, certaines cibles n’étaient pas dosées en pratique courante, ou nécessitaient l’utilisation de la totalité d’un prélèvement afin d’obtenir un dosage, ce qui n’était pas compatible avec l’obtention d’une liste de nouvelles cibles à analyser (le nombre de prélèvements dans la biocollection étant limité). Il a donc été convenu avec l’équipe du laboratoire que les nouveaux dosages devaient être effectués avec la technique Luminex, une méthode de cytométrie en flux utilisant des billes fluorescentes et une double lecture par deux lasers. Cette technique permettait d’analyser un grand nombre de cibles avec un seul et même prélèvement et permettait par rapport aux autres techniques (dont Elisa), d’obtenir des résultats d’identification plus rapide, plus modulable (par la mise en place de série), et plus sensible.

Le tri des potentielles cibles selon ces critères a donc permis de les classer en fonction de leur intérêt pour notre étude. Ces résultats sont présentés dans le tableau 6 suivant :

Cibles intéressantes et dosable en Luminex

Cibles intéressantes non dosables en Luminex

Cibles non pertinentes pour notre étude

CD-28 CTLA-4

IL-4 IL-33 PD-1

PD-L1 PD-L2 TRAIL

RANTES (CCL-5) TIMP-1

2-3DPG ALAD

Alpha Defensin 1 Ammonium Bicarbonate

Antithrombin III Biliverdin Reductase B Carbonic anhydrase A1

CCL-3 et 4 CD5-L

Clusterin Complement Factor P

Concanavalin A Cystatin F

F-actin Fetuin-A FOXP3 FXIII B GADPH GPX3

Heme libre

ADP ALDOA

Annexin A5 Apolipoprotein A1

Apolipoprotein C1 et C2 Apolipoprotein H

Carbonic anhydrase A2 Caspase 3

CAT Ceruloplasmin

Complement factor H Collagen alpha-1(XVIII)

Cystatin C ENA-78 ENO1 FLNA GST01

GP5 Hb-α 1 et Hb-α 2

Hb-β

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Heme Oxydase HLA-DR

Heparan Sulfate Proteoglycan Heat Shock Protein 70

Histidine-rich glycoprotein sHLA-G et sHLA-E

IL-32 L-Arginine

LFA-1 Lyso-PC

Mannose-binding protein MASP 2 MIC-A MIC-B

miR-150 Nectin-2

PCNA Peroxiredoxin-1 Peroxiredoxin 2

PfHB PEDF

Platelet Factor 4 Prolactine

Proteasome subunit B2 S100 A8-A9

Selenium binding protein 1 Serotonine

Serum amyloid P-component Thrombospondin-1

Vimentin

Hb-γ 1 Hemopexin

IGHG1 IGKC IL-16

Integrin alpha-IIB ITI H1

Kininogen-1 LDH B

LTA-4H MCP-1 MDH-1 MIP-1α

MMP8 et 9 Moesin

Peroxiredoxin 6 Plasma protease C1 inhibitor

Plasma serine protease – Plasminogen

Peptidylprolyl isomerase A Procaspase 3

Profilin-1 Protein C PSM A3

Serpin A1 Serpin A4 et A5

Serpin C1 Serpin F1

TIMP2 TALDO1

Transketolase TPI1

Tropomyosine α4 chain Vitronectin Vinculine

Vitamine D-binding protein

Table 6 : Choix des nouvelles cibles à évaluer Après la prise en compte de l’ensemble de ces prérequis on obtenait donc une liste de nouvelles cibles : CD28 : La reconnaissance du soi et du non-soi passe par la reconnaissance par les récepteurs des cellules T (TCR) d’antigènes présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APC). Certains TCR ont une réaction croisée avec des anticorps du soi, et pourraient être à l’origine de réactions auto-immunes. Afin de prévenir ce phénomène, de véritables check-points immunitaire appelés « tolérance périphérique » permettent de réguler l’activation des cellules T. CD28 agit alors comme une molécule co-stimulant la prolifération des cellules T et la sécrétion par ces dernières d’IL-2. La co-stimulation se fait avec B7-1 et B7-2. On a donc un signal inhibiteur de la tolérance périphérique. L’équilibre de ce signal activateur/inhibiteur se fait entre CD28 et CTLA-4/PD-1 [59, 60].

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CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4): Cette molécule permet donc avec CD-28 et leurs ligands qui sont les mêmes : B7-1 et B7-2, un équilibre entre activation/inhibition de l’activation des NK, après que ces derniers ai été mis en contact avec le CMH des APC. En effet CTLA-4 va avoir un effet opposé sur les NK par rapport à CD28 [59, 60]. CTLA-4 va inhiber le signal des NK en inhibant sa sécrétion d’IFN-γ. La balance CD-28/CTLA-4 a donc une implication importante dans la modulation de la réponse. De nombreuses immunothérapies impliquant le blocage de CTLA-4 sont d’ailleurs utilisées dans le traitement de tumeurs solides, notamment pour le cancer du poumon non à petite cellules et les mélanomes métastatiques, mais aussi pour les cancers non solides comme le myélome [61]. En effet le blocage de ce système inhibiteur de l’immunité permet de restaurer une réponse immunitaire anti-tumorale. PD-1 (Programmed death 1) : Ce récepteur fait partie du check-point immunitaire permettant une régulation négative des fonctions des cellules T, et permet de prévenir les réactions auto-immunes. CTLA-4 et PD-1 agissent à différents temps dans la modulation de la réponse immunitaire au niveau de ces check-points. En effet CTLA-4 va jouer le rôle principal d’inhibiteur en bloquant précocement les cellules T potentiellement auto-réactives (par réaction croisée avec le soi) mais encore non activées. Ce blocage se fait principalement au niveau des ganglions lymphatiques. Tandis que PD-1 va agir plus tardivement dans la réponse immunitaire en inhibant les cellules T et les NK déjà activés, en bloquant la cascade activatrice induite par les TCR. Ce blocage se fait principalement dans les tissus périphériques [61] CTLA-4 agit donc comme inducteur de la tolérance périphérique tandis que PD-1 permet de maintenir à long terme cette tolérance. PD-L1 et PD-L2 (Programmed death- Ligand 1 et 2): Ces protéines sont les ligands du récepteur PD-1 vu précédemment. PD-L1/2 sont donc impliqués dans le check-point immunitaire de tolérance périphérique et jouent un rôle majeur dans l’immunité et les mécanismes d’échappement tumoraux. En effet PD-L1/2 sont exprimées par des tumeurs solide ou hématologique afin d’inhiber à la fois les cellules T et les NK, et donc d’échapper au système immunitaire. L’expression du couple PD-1/PD-L1-2 au niveau des cellules cibles bloque ces dernières dans leur cycle cellulaire au stade G0/G1, sans entrainer leur apoptose. La différence entre PD-L1 et PD-L2 réside dans la force de blocage, en faveur de PD-L1 à concentration égale. Un des principaux mécanismes de ce blocage est un rôle antagoniste sur le couple activateur CD28/B7.[62] Le blocage de l’axe PD-1/PD-L1 est d’ailleurs récemment utilisé dans le traitement de certains cancers afin de rétablir la cytotoxicité des NKs [61]. IL-4 : L’interleukine 4 entraine une réponse de type Th2 de la part des cellules T CD4+. En effet IL-4 inhibe la sécrétion d’IFN-γ, qui est signal inducteur d’une réponse Th1. Quant aux NK dans la réponse immunitaire, ils sont habituellement activés par des cytokines de type Th1 comme IL-2, 12 et 18. Ce sont alors des producteurs majeurs d’IFN-γ qui vont activer la réponse cytotoxique des NK et permettre la clairance des cellules tumorales ou infectées. Cependant les NK peuvent être activés par IL-4, qui induit alors une différenciation de type Th2. Apres avoir expérimentalement activé les NK par IL-4, ces derniers expriment un profil agressif avec une sécrétion plus importante d’IFN-γ, ainsi qu’une plus grande cytotoxicité. Cette activation est double, en effet IL-4 va aussi activer la production par les macrophages d’IL-15, qui entraine aussi un signal activateur sur les NK [63].

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IL-33 : Cette interleukine est principalement sécrétée dans les tissus endommagés et exacerbe la réponse immunitaire Th2 des NKs. En effet après liaison à son récepteur ST2, IL-33 induit une activation du NF-KB via la voie MyD88 et une production majeure d’IFN-γ par les NK [64]. IL-33 a aussi une activité sur les CDs, en effet elle stimule la production de cytokines pro-inflammatoires par ces dernières : IL-6, IL-1β et TNF. Les CDs activées par IL-33 vont aussi amplifier ce signal inflammatoire en stimulant la production par les LT naïfs de cytokines Th2 comme IL-5 et IL-13 [65]. CCL-5 (RANTES) : CCL-5 est une chimiokine de la famille CC (les autres types sont CXC, CX3C et C). Elle est secrétée par les NK après la stimulation de leurs récepteurs activateurs (LFA-1, NKG2D, DNAM-1, 2B4 et CD16). L’activation de ces récepteurs entraine alors la sécrétion de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires dont CCL-5 [66] Cette chimiokine va alors jouer son rôle chimio-attractant et recruter elle-même d’autres NKs sur le lieu de l’inflammation. Les NKs secrétant alors eux-mêmes CCL-5, il se met en place une réaction d’auto-amplification de la réponse inflammatoire. D’ailleurs, les NKs mis en contact avec CCL-5 voient leur potentiel de libération des granules cytotoxiques augmenté [67, 68]. TIMP-1 (Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1) : C’est un inhibiteur des MMPs (Matrix Metalloproteinases), un groupe de peptidase responsable de la dégradation de la matrice extra-cellulaire (MEC). Les MMPs sont impliqués dans la genèse tumorale par modification de cette MEC et par effet inhibiteur direct sur les NKs : en diminuant leurs récepteurs membranaires activateurs, leur nombre de granules cytotoxiques (Perforin et Granzyme B) et leur sécrétion de cytokines INF-γ et TNF-α. La présence de TIMP-1 permet alors de rétablir l’ensemble de ces fonctions et de restaurer l’activité des NKs [69]. TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand) : L’apoptose, essentielle au bon fonctionnement du système immunitaire peut se faire via 2 voies. Une intrinsèque, dite mitochondriale, l’autre extrinsèque, via les récepteurs dit « de mort ». TRAIL joue donc le rôle de ligand activateur sur ces récepteurs : TRAIL-R1 et TRAIL-R2. L’expression de TRAIL est stimulée par l’IFN-β et le LPS (lipopolysaccharide) au niveau des monocytes et des macrophages, et par l‘INF-γ au niveau des NKs et des CDs. TRAIL a donc une activité immunomodulatrice en maintenant une homéostasie entre les populations lymphocytaires et une activité anti tumorale via le message d’apoptose qu’il conduit [70].

Conclusion Notre étude a montré le caractère hétérogène des cytokines présentes dans des CGRs réputés équivalent en termes de DS. Il semblerait alors que ce soit les cytokines contenues dans les CGRs qui pourraient être le principal déterminant de la morbidité post-transfusionnelle, et nous avons fait l’hypothèse qu’il ne faudrait plus seulement considérer la qualité d’un CGR en fonction de sa durée de stockage à l’EFS mais en fonction des différentes cytokines qu’il contient, afin d’orienter la stratégie transfusionnelle chez les patients les plus à risques. En effet il semblerait que les mécanismes qui mènent à l’insuffisance rénale, à l’immunomodulation post-transfusionnelle et probablement au devenir des patients, en termes de marqueur de risque cardiovasculaire et d’insulino-résistance pourraient être en partie expliqués par l’apport exogène de DAMPs, comme RBP4 dans notre étude ; retrouvé à des concentrations supérieures à celles attendues.

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Afin de confirmer la tendance de ces premiers résultats et corriger le manque de puissance de notre analyse, l’ensemble des patients prévus doivent être inclus dans l’étude Transnéphron et analysé à la lumière des nouvelles cibles choisies.

Bibliographie 1. Banbury, M.K., et al., Transfusion increases the risk of postoperative infection after

cardiovascular surgery. J Am Coll Surg, 2006. 202(1): p. 131-8. 2. Hendrickson JE, H.C., Noninfectious Serious Hazards of Transfusion. Anesthesia &

Analgesia, 2009. 3. Qian, Z., et al., Antibody and complement mediated injury in transplants following

sensitization by allogeneic blood transfusion. Transplantation, 2006. 82(7): p. 857-64. 4. Vamvakas, E.C. and J.H. Carven, Transfusion and postoperative pneumonia in coronary

artery bypass graft surgery: effect of the length of storage of transfused red cells. Transfusion, 1999. 39(7): p. 701-10.

5. Zallen, G., et al., Age of transfused blood is an independent risk factor for postinjury multiple organ failure. Am J Surg, 1999. 178(6): p. 570-2.

6. Koch, C.G., et al., Duration of red-cell storage and complications after cardiac surgery. N Engl J Med, 2008. 358(12): p. 1229-39.

7. Voorhuis, F.T., et al., Storage time of red blood cell concentrates and adverse outcomes after cardiac surgery: a cohort study. Ann Hematol. 92(12): p. 1701-6.

8. Steiner, M.E., et al., Effects of red-cell storage duration on patients undergoing cardiac surgery. N Engl J Med. 372(15): p. 1419-29.

9. Yap, C.H., et al., Age of transfused red cells and early outcomes after cardiac surgery. Ann Thorac Surg, 2008. 86(2): p. 554-9.

10. Lacroix, J., et al., Age of transfused blood in critically ill adults. N Engl J Med. 372(15): p. 1410-8.

11. Donadee, C., et al., Nitric oxide scavenging by red blood cell microparticles and cell-free hemoglobin as a mechanism for the red cell storage lesion. Circulation. 124(4): p. 465-76.

12. Neal, M.D., et al., Innate immune activation after transfusion of stored red blood cells. Transfus Med Rev. 27(2): p. 113-8.

13. Ghio, M., et al., Soluble HLA class I, HLA class II, and Fas ligand in blood components: a possible key to explain the immunomodulatory effects of allogeneic blood transfusions. Blood, 1999. 93(5): p. 1770-7.

14. D'Alessandro, A., et al., Supernatant protein biomarkers of red blood cell storage hemolysis as determined through an absolute quantification proteomics technology. Transfusion. 56(6): p. 1329-39.

15. Sanders, J., et al., Red blood cell storage is associated with length of stay and renal complications after cardiac surgery. Transfusion. 51(11): p. 2286-94.

16. Luten, M., et al., Survival of red blood cells after transfusion: a comparison between red cells concentrates of different storage periods. Transfusion, 2008. 48(7): p. 1478-85.

17. Frassdorf, J., S. De Hert, and W. Schlack, Anaesthesia and myocardial ischaemia/reperfusion injury. Br J Anaesth, 2009. 103(1): p. 89-98.

18. Yellon, D.M. and D.J. Hausenloy, Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med, 2007. 357(11): p. 1121-35.

19. Emeklibas, N., et al., Preoperative hemostasis and its association with bleeding and blood component transfusion requirements in cardiopulmonary bypass surgery. Transfusion. 53(6): p. 1226-34.

20. Bilgin, Y.M., et al., Postoperative complications associated with transfusion of platelets and plasma in cardiac surgery. Transfusion. 51(12): p. 2603-10.

[desarmir.fr].Do

cumen

tsou

sLicen

seCrea5

veCom

mon

s(by-nc-sa).

25

21. Brivet, F.G., et al., Acute renal failure in intensive care units--causes, outcome, and prognostic factors of hospital mortality; a prospective, multicenter study. French Study Group on Acute Renal Failure. Crit Care Med, 1996. 24(2): p. 192-8.

22. Carson, J.L., et al., Liberal or restrictive transfusion in high-risk patients after hip surgery. N Engl J Med. 365(26): p. 2453-62.

23. Chertow, G.M., On the design and analysis of multicenter trials in acute renal failure. Am J Kidney Dis, 1997. 30(5 Suppl 4): p. S96-101.

24. Dixon, B., et al., The association of blood transfusion with mortality after cardiac surgery: cause or confounding? (CME). Transfusion. 53(1): p. 19-27.

25. Liano, G. and J. Pascual, Acute renal failure. Madrid Acute Renal Failure Study Group. Lancet, 1996. 347(8999): p. 479; author reply 479.

26. Murphy, G.J., et al., Increased mortality, postoperative morbidity, and cost after red blood cell transfusion in patients having cardiac surgery. Circulation, 2007. 116(22): p. 2544-52.

27. Yun, H.R., Kramer RS, Leavitt BJ, Surgenor SD, Limited blood transfusion does not impact survival in octogenarians undergoing cardiac operations. Ann Thorac Surg., 2012 Dec;94(6):2038-45.

28. Bellomo, R., et al., Acute renal failure - definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs: the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Crit Care, 2004. 8(4): p. R204-12.

29. Sahler, J., et al., CD40 ligand (CD154) involvement in platelet transfusion reactions. Transfus Clin Biol. 19(3): p. 98-103.

30. Kuitunen, A., et al., Acute renal failure after cardiac surgery: evaluation of the RIFLE classification. Ann Thorac Surg, 2006. 81(2): p. 542-6.

31. Bove, T., et al., Acute renal failure and cardiac surgery. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth, 2009. 1(3): p. 13-21.

32. Koch, C., et al., Transfusion and pulmonary morbidity after cardiac surgery. Ann Thorac Surg, 2009. 88(5): p. 1410-8.

33. Weissman, C., Pulmonary complications after cardiac surgery. Semin Cardiothorac Vasc Anesth, 2004. 8(3): p. 185-211.

34. Metnitz, P.G., et al., Effect of acute renal failure requiring renal replacement therapy on outcome in critically ill patients. Crit Care Med, 2002. 30(9): p. 2051-8.

35. Chertow, G.M., et al., Acute kidney injury, mortality, length of stay, and costs in hospitalized patients. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(11): p. 3365-70.

36. Simmons, P.I. and R.J. Anderson, Increased serum creatinine: a marker for adverse outcome before and after cardiac surgery. Crit Care Med, 2002. 30(7): p. 1664-5.

37. Zanardo, G., et al., Acute renal failure in the patient undergoing cardiac operation. Prevalence, mortality rate, and main risk factors. J Thorac Cardiovasc Surg, 1994. 107(6): p. 1489-95.

38. Schneider J, K.R., Grushkin C, Bart R., Serum creatinine as stratified in the RIFLE score for acute kidney injury is associated with mortality and length of stay for children in the pediatric intensive care unit. Crit Care Med, 2010 Mar;38(3):933-9.

39. Tisoncik, J.R., et al., Into the eye of the cytokine storm. Microbiol Mol Biol Rev. 76(1): p. 16-32.

40. Wang, H. and S. Ma, The cytokine storm and factors determining the sequence and severity of organ dysfunction in multiple organ dysfunction syndrome. Am J Emerg Med, 2008. 26(6): p. 711-5.

41. Norseen, J., et al., Retinol-binding protein 4 inhibits insulin signaling in adipocytes by inducing proinflammatory cytokines in macrophages through a c-Jun N-terminal kinase- and toll-like receptor 4-dependent and retinol-independent mechanism. Mol Cell Biol. 32(10): p. 2010-9.

42. Du, M., et al., Serum retinol-binding protein-induced endothelial inflammation is mediated through the activation of toll-like receptor 4. Mol Vis. 23: p. 185-197.

[desarmir.fr].Do

cumen

tsou

sLicen

seCrea5

veCom

mon

s(by-nc-sa).

26

43. Fang H, A.B., Xu X, Huang X, Wu Y, TLR4 is essential for dendritic cell activation and anti-tumor T-cell response enhancement by DAMPs released from chemically stressed cancer cells. Cell Mol Immunol., 2014 Mar;11(2):150-9.

44. Vermeulen Windsant IC, d.W.N., Sertorio JT, van Bijnen AA, Ganushchak YM, Hemolysis during cardiac surgery is associated with increased intravascular nitric oxide consumption and perioperative kidney and intestinal tissue damage. Front Physiol., 2014 Sep 8;5:340.

45. Europe, C.o., Europe CO. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. 2007.

46. Kershaw EE, F.J., Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab., 2004 Jun;89(6):2548-56.

47. Zabetian-Targhi, F., et al., Retinol binding protein 4 in relation to diet, inflammation, immunity, and cardiovascular diseases. Adv Nutr. 6(6): p. 748-62.

48. Thompson, S.J., et al., Hepatocytes Are the Principal Source of Circulating RBP4 in Mice. Diabetes. 66(1): p. 58-63.

49. Farjo, K.M., et al., Retinol-binding protein 4 induces inflammation in human endothelial cells by an NADPH oxidase- and nuclear factor kappa B-dependent and retinol-independent mechanism. Mol Cell Biol. 32(24): p. 5103-15.

50. Ginsberg, H.N., Insulin resistance and cardiovascular disease. J Clin Invest, 2000. 106(4): p. 453-8.

51. Yang, Q., et al., Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature, 2005. 436(7049): p. 356-62.

52. Shine, T.S., et al., Importance of perioperative blood glucose management in cardiac surgical patients. Asian Cardiovasc Thorac Ann, 2007. 15(6): p. 534-8.

53. Giakoumidakis, K., et al., Effects of intensive glycemic control on outcomes of cardiac surgery. Heart Lung. 42(2): p. 146-51.

54. Moraes-Vieira, P.M., et al., RBP4 activates antigen-presenting cells, leading to adipose tissue inflammation and systemic insulin resistance. Cell Metab. 19(3): p. 512-26.

55. Mosmann, T.R., et al., Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol, 1986. 136(7): p. 2348-57.

56. Niemann, J.T., et al., Cardiac function and the proinflammatory cytokine response after recovery from cardiac arrest in swine. J Interferon Cytokine Res, 2009. 29(11): p. 749-58.

57. Liu, M., et al., A meta-analysis of proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Heart Asia. 6(1): p. 130-6.

58. Hohensinner, P.J., et al., Inflammation and cardiac outcome. Curr Opin Infect Dis. 24(3): p. 259-64.

59. Krummel MF, A.J., CD28 and CTLA-4 Have Opposing Effects on the Response of T ceils to Stimulation. J Exp Med., 1995 Aug 1;182(2):459-65.

60. Stojanovic, A., et al., CTLA-4 is expressed by activated mouse NK cells and inhibits NK Cell IFN-gamma production in response to mature dendritic cells. J Immunol. 192(9): p. 4184-91.

61. Buchbinder, E.I. and A. Desai, CTLA-4 and PD-1 Pathways: Similarities, Differences, and Implications of Their Inhibition. Am J Clin Oncol. 39(1): p. 98-106.

62. Latchman, Y., et al., PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol, 2001. 2(3): p. 261-8.

63. Webb, D.C., et al., Comparative roles of IL-4, IL-13, and IL-4Ralpha in dendritic cell maturation and CD4+ Th2 cell function. J Immunol, 2007. 178(1): p. 219-27.

64. Nabekura, T., J.P. Girard, and L.L. Lanier, IL-33 receptor ST2 amplifies the expansion of NK cells and enhances host defense during mouse cytomegalovirus infection. J Immunol. 194(12): p. 5948-52.

65. Besnard, A.G., et al., IL-33-activated dendritic cells are critical for allergic airway inflammation. Eur J Immunol. 41(6): p. 1675-86.

66. Appay, V. and S.L. Rowland-Jones, RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends Immunol, 2001. 22(2): p. 83-7.

[desarmir.fr].Do

cumen

tsou

sLicen

seCrea5

veCom

mon

s(by-nc-sa).

27

67. Fischer, F.R., et al., RANTES-induced chemokine cascade in dendritic cells. J Immunol, 2001. 167(3): p. 1637-43.

68. Matter, C.M. and C. Handschin, RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), inflammation, obesity, and the metabolic syndrome. Circulation, 2007. 115(8): p. 946-8.

69. Goda, S., et al., Matrix metalloproteinase-1 produced by human CXCL12-stimulated natural killer cells. Am J Pathol, 2006. 169(2): p. 445-58.

70. Falschlehner, C., U. Schaefer, and H. Walczak, Following TRAIL's path in the immune system. Immunology, 2009. 127(2): p. 145-54.