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FACULTE DE MEDECINE
A L'ECOLE DES GRADUES
POUR L'OBTENTION
DU GRADE DE MAITRE ES SCIENCES (M.Sc.)
PAR
ANDRE BOULET
BACHELIER ES SCIENCES
EN BIOLOGIE MEDICALE
UNIVERSITE DU QUEBEC A TROIS-RIVIERES
THESE
PRESENTEEH S 5
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX POUR LE DEPISTAGE DE
L'ANTIGENE HBsAg ASSOCIE AU VIRUS DE L'HEPATITE B.
FEVRIER 1985
AVANT-PROPOS
Je remercie tout spécialement le Dr Normand
Marceau, mon directeur, ainsi que le Dr Jean-Paul
Valet pour son aide et son enthousiasme soutenu tout au long
de ce projet. Je remercie aussi le Dr Jacques Hébert pour
les facilités matérielles qu'il a mises à ma disposition pour
la production des anticorps monoclonaux, les techniciens et
techniciennes du laboratoire d1 hématologie spéciale pour les
encouragements de tous les jours ainsi que le Centre de
Transfusion Sanguine de la Croix-Rouge (Québec) qui a
spontanément collaboré avec nous.
ii
RESUME
Université Laval - Février 1985
Titre: Production d1 anticorps monoclonaux pour le dépistage
de 11 antigène HBsAg associé au virus de 11 hépatite B.
Des anticorps monoclonaux, dirigés contre
11 antigène de surface du virus de 1'hépatite B (HBsAg) ont
été obtenus par fusion de lymphocytes de souris
immunisées avec de 11 antigène purifié par chromatographie
d1 affinité et des cellules de myélome de souris (Sp2/0)
maintenues en culture exponentielle. Le dépistage des clones
sécréteurs a été effectué par RIA en phase liquide. Pour
chaque fusion, nous avons obtenu entre 10 et 20% de clones
sécréteurs. La sélection a été effectuée d'après le titre de
11 anticorps sécrété dans le surnageant de culture. Les
hydrides intéressants ont été clonés par dilution limite.
Parmi le souches obtenues, deux ont été sélectionnées comme
composantes d'une trousse de dépistage. Ces anticorps sont
dirigés contre le déterminant commun "a" de 1'HBsAg. Le
seuil de sensibilité de cette trousse, indépendamment du sous-
type ("ad" et "ay") est de 0.06 ng./ml de sérum. Tous les
échantillons trouvés positifs lors de 1'utilisation de
réactifs commerciaux l'ont été aussi avec cette trousse.
Par contre, nous avons trouvé parmi 1114 donneurs de sang un
faux positif dû à la présence d'anticorps anti-
ill
immunoglobulines de souris. Cette reaction a pu être
neutralisée par addition d1 immunoglobulines de souris a
11 anticorps révélateur. Des essais complémentaires sur les
échantillons du "College of American Pathologist", démontrent
que la trousse, mise au point avec des anticorps monoclonaux,
est supérieure à celles utilisées dans les laboratoires
inscrits à ce service.
André Boulet(B.Sc.) Jean-Paul Valet (Ph.D.)
Normand Marceau (Ph.D.)
iv
TABLE DES MATIERES
Page
AVANT-PROPOS........................ ........... .......... . i
RESUME »eo.'»eee«> 1 Î
TABLE DES MATIERES... ............................. . ----- iv
LISTE DES ABREVIATIONS......................... . vii
LISTE DES TABLEAUX............................... ..... . . . viii
LISTE DES FIGURES.................. ........... ...... . . . . x
INTRODUCTION..................................... ........ 1
I. Les hépatites.......... ...... . 1
II. L 1 hépatite de type B.................... 1
A. Généralités......... 1B. Description du virus de 1'hépatite B...... 2C. Les marqueurs sérologiques...... 5D. Evolution sérologique............ 6E. Modes de transmission........ 9F. Distribution géographique de
11 hépatite B.......... ....................... 10G. Importance du diagnostic.................. 10H. Problématique des porteurs chroniques..... 11I. La vaccination............................... 12
III. Les méthodes de dépistage......... ............ 12
IV. Apports des anticorps monoclonaux............ 16
V. But du présent travail.......... . 17
MATERIELS ET METHODES................... 20
I. Purification de l'HBsAg....................... 21
A. Source de l'HBsAg........................... 21B. Sous-typage et titration.................. 21C. Purification par chromatographie
d ' affinité.................................... 22
II. Production d ' hybridomes....................... 24
A. Matériels et milieux....................... 24
1. Equipement 24
V
2 . Milieux. ....... 24i. Le sérum de veau foetal............ 24ii. Les solutions de travail........... 24
B. Protocole d'immunisation.................... 27C. Choix des cellules de myélome.............. 28D. Fusion cellulaire. ............ .............. 28
1. Préparation des cellulesno u 11 s s x c je o s........................... 2 8
2. Préparation des Sp2/0.................... 303. Splénectomie........................... 314. Fusion. ............ 325. Dépistage.............................. 33
i. Production de 11 antisérum anti-immunoglobulines de souris........ 33
ii. Marquage de 11 antigène............. 34iii. Epreuve radio-immunologique....... 34iv. Sélection des hybrides ........ 35
6. Clonage....................... 357. Cryopréservation.......................... 36
E. Difficultés de la fusion cellulaire....... 37
1. Les contaminations....................... 372. Perte de production...................... 3 83. Diminution de la croissance............ 384. Non-sélection du milieu HAT............. 39
III. Production et caractérisation des anticorpsmonoclonaux...................................... 39
A. Identification du type d1 immunoglobulinessécrétées....................... ........... . . 39
B. Production d 1 ascites........................ 40C. Purification des anticorps................. 42
1 . Protéine A-Sépharose................. 422. Le Séphacryl 300......................... 45
D. Couplage des anticorps sur la matrice..... 46
1 . Choix de la matrice...................... 462. Couplage des anticorps................... 47
E. Marquage des anticorps à 1'Iode-125....... 47F. Détermination des composants de la
trousse....................................... 50
1 . Procédures d 1 incubation................. 502. Détermination de 11 anticorps de la
matrice.................................... 50
3. Détermination de 11 anticorpsrévélateur............................. 51
vi
4. Pairage des anticorps ........ ........... 515. Détermination de la sensibilité.«...... 526. Détermination de la stabilité.......... 52
RESULTATS....................... 53
I. Purification de l'HBsAg........................ 54
II. Résultats des fusions cellulaires............. 54
III. Essais des divers anticorps.................... 58
A. Essais sur matrice........ 58B. Es sais de marguage........................ 58C. Pairage des anticorps........ 61
IV. Essais de sensibilité de la trousse.......... 61
V. Essais cliniques............ 62
VI. Essais de stabilité...... 70
DISCUSSION......... 71
I. Résultats des fusions........................... 72
II. La trousse................. 73
CONCLUSION.................................... 75
BIBLIOGRAPHIE........ ............................. ..... . . 76
LISTE DES ABREVIATIONS
AEC :
AFI :
CEP :
cm :
CPM :
DMSO :
D.O. :
g :
g :
i. p. :
i. v. :
mCi :
Min. :
mg. :
ml. :
mm. :
mM. :
M
nm. :
N :
PBS :
PEG :
RPM :
s. c . :
S VF :
Adjuvant de Freund complet
Adjuvant de Freund incomplet
Contre-électrophorèse
Centimètre
Compte par minute
Dimethyl sulfoxide
Densité optique
Gramme
Unité de gravité
Intrapéritonéal
Intraveineux
Milli-Curie
Minute
Milligramme
Millilitre
Millimètre
Millimole
Mole
Nanomètre
Normale
Tampon phosphate salin
Polyéthylène glycol
Rotation par minute
Sous-cutané
Sérum de veau foetal
viii
LISTE DES TABLEAUX
Page
TABLEAU I : Sous-types de l'HBsAg.................. 4
TABLEAU II : Méthodes de dépistage de
1 antigene HB s......................... *14
TABLEAU III : Expression des immunoglobulines
chez quelques myélomes de souris....... 29
TABLEAU IV : Absorption des anticorps à
divers pH....... 48
TABLEAU V : Résultats des fusions cellulaires...... 56
TABLEAU VI : Clones conservés pour essais........... 59
TABLEAU VII : Essais sur matrice des divers
anticorps............. 60
TABLEAU VIII: Essais de marquage à 11Iode-125
des divers anticorps ..................... 63
TABLEAU IX : Clones sélectionnés comme composants
possibles dans la trousse 64
ix
TABLEAU X : Pairage des divers anticorps...... . . . .. 65
TABLEAU XI : Detection de 1'HBsAg purifié (ad)...... 66
TABLEAU XII : Detection de 11HBsAg purifié (ay)...... 67
TABLEAU XIII: Dépistage de 1'HBsAg sur 1114
donneurs de sang......... ...... ......... 68
TABLEAU XIV : Comparaison de la performance de
la trousse monoclonale aux autres
trousses commerciales sur le panel
d'échantillons fournis par le
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1
FIGURE 2
FIGURE 3
FIGURE 4
FIGURE 5
FIGURE 6
FIGURE 7
Page
: Structure du virus de 11 hépatite B...... 3
: Schéma typique de 11 évolution des
marqueurs sérologiques chez les
malades présentant une hépatite B
aiguë ....................... ...... . 7
: Profil sérologique d'un porteur
d'HBsAg chronique: pas de
séroconversion......... ................... 8
: Profil sérologique d'un porteur
d'HBsAg chronique: séroconversion
tardive..................................... 8
: Représentation schématique d'une
épreuve radio-immunologique............ 15
: Production d ' hybridomes.......... 19
: Immunodiffusion double
d'Ouchterlony......... 41
xi
FIGURE 8 : Elution d1 immunoglobulines, d'une
souris immunisée, sur Protéine A-
Sépharose................ .................. 43
FIGURE 9 : Purification d'un anticorps
monoclonal (IgGl) par élution sur
Protéine A-Sépharose.............. »....... 44
FIGURE 10 : Tamisage de l'HBsAg sur Sépharose
S-6B...................... .................. 55
INTRODUCTION
I - Les hépatites.
Les hépatites virales frappent des centaines
de millions de personnes dans le monde. L1 Organisation
Mondiale de la Santé (O.M.S.) les considère comme un problème
majeur à la santé publique (1). En 1976, elles étaient
responsables de plus de 30,000 cas d1 hépatites post-
transfusionnelles aux Etats-Unis (2).
On distingue trois types d1 hépatites virales
provoquées par différents agents. L1 hépatite A ou
"infectieuse" est causée par un virus à ARN. L1 hépatite B ou
"sérique", la plus grave, d'après les séquelles souvent
engendrées, est causée par un virus à ADN. Enfin, 11 hépatite
Non A-Non B dont, on ne connaît pas l'agent infectieux mais
qui est responsable, depuis que le dépistage de l'HBsAg est
effectué, de 90% des hépatites post-transfusionnelles (1).
II - L'hépatite de type B
A- Généralités.
L'hépatite B est la plus grave des hépatites
virales ; il n'y a pas de traitement efficace connu et le
taux de mortalité peut atteindre 5% (3). Cette maladie est
caractérisée par une atteinte hépatique plus ou moins aiguë
et la présence du virus dans le sang du malade. La période
d'incubation varie entre 6 à 26 semaines (4). Après cette
période, les principaux signes cliniques apparaissent
2
(fièvre, perte d'appétit, nausées, fatigue, etc.) suivis de
11 ictère.
B- Description du virus de 1'hépatite B.
Le virus de 11 hépatite B possède une
structure complexe. Le virion (Particule de Dane) qui a un
diamètre de 42 à 45 cm est composé d'une enveloppe et d'une
capside (Figure 1). L'enveloppe, de nature lipoprotéique, a
7 nm d'épaisseur et entoure la capside de 28 nm (4). Elle
constitue 1'antigène de surface du virus (HBsAg). Cette
enveloppe peut être libérée de la particule entière par des
détergents et ainsi permettre l'étude de ses composants. Elle
est composée, en grande majorité, de deux polypeptides : PI
dont le poids moléculaire (P.M.) se situe entre 22 et 24,000
daltons; et P2 de poids moléculaire de 29,500 daltons (5).
Sur 1'antigène de surface, on retrouve le
déterminant antigénique commun "a" auquel sont associés les
déterminants, mutuellement exclusifs, d/y et w/r. Il y a
donc possibilité de quatre sous-types majeurs de 1'HBsAg:
adw, ayw, adr et ayr (Tableau I). La division du déterminant
"a" en "al", "a2", "a3", et autres spécificités
intermédiaires permet de classifier 1'HBsAg en dix autres
catégories (7). Ces sous-types n1 ont de 1'importance que
lors d'études épidémiologiques (Section F) et du
développement de trousses de dépistage.
La capside du virus, de symétrie cubique,
FIGURE 1 : STRUCTURE DU VIRUS CE V HEPATITE B
TABLEAU I: SOUS-TYPES DE L'HBsAg,
a: DETERMINANT COMMUN
5
contient un ADN bicaténaire circulaire associé à une ADN
polymérase qui assure la multiplication virale (6). Elle est
composée, majoritairement, d'un polypeptide (HBcAg) de 19,000
daltons (7).
Par ailleurs, une particule antigénique "e"
(HBeAg), thermolabile et dont la nature n'est pas encore
déterminée, pourrait correspondre à une partie de 1'HBcAg
transformée par une kinase associée à cette dernière (8).
C- Les marqueurs sérologiques de
11 hépatite B.
Il existe cinq marqueurs sérologiques
permettant de suivre 11 évolution d'une hépatite de type B:
l'HBsAg, les anticorps diriges contre l'HBsAg (Anti-HBs), les
anticorps dirigés contre 1'HBcAg (Anti-HBc), 1'HBeAg et les
anticorps dirigés contre 1'HBeAg (Ati-HBe).
L'HBsAg se retrouve dans les sérums des
patients sous forme de petites sphères dont le diamètre est
de 20 à 22 nm et sous forme de bâtonnets de diamètre
semblable mais dont la longueur varie de 40 à 400 nm (Figure
1 ) (9). Il est 1'indicateur le plus précoce de la présence
d'une infection aiguë ou chronique. L'apparition d'anticorps
correspondants (Anti-HBs) indique la guérison clinique ainsi
que 1'immunité contre le virus.
Les anticorps anti-HBs traduisent, soit une
infection active en phase aiguë ou bien une infection active
en phase chronique. La détection des anticorps de classe
6
IgM, spécifiques à l'HBcAg, aide à différencier ces deux cas :
lors d'une infection aiguë, on retrouve un niveau élevé de
ces anticorps (Type IgM) contrairement à 1'infection
chronique où ces derniers sont détectés à un bas niveau. Il
est à noter que l'HBcAg n1 est pas un marqueur sérologique
puisqu'il ne peut être détecté dans le sang circulant, étant
masqué à 1'intérieur des particules de Dane. On ne le
retrouve qu'au niveau des noyaux des hépatocytes.
L'HBeAg est 1'indicateur d'une infection
aiguë représentant la période la plus contagieuse. Les
anticorps anti-HBe indiquent la guérison. En 1'absence
d'HBsAg et des anticorps correspondant à ce dernier, les
anticorps anti-HBe indiquent la convalescence et persistent
entre 1 à 2 ans (10). La détection de ces anticorps permet
d'identifier les individus qui deviennent porteurs
chroniques.
D- Evolution sérologique.
Les marqueurs sérologiques sont présents à
différents moments de la maladie et permettent ainsi de
suivre 1'évolution de cette dernière.
L'HBsAg apparaît après la période
d1 incubation qui varie entre 6 à 26 semaines. Peu après
11 apparition des symptômes, il atteint son maximum et
disparaît généralement après 1 à 3 mois (Figure 2). Les
anticorps anti-HBs n'apparaissent que de 2 à 16 semaines
Concentration relative
7
Figure 2: Schema typique de 11 evolution des marqueurs sérologiques chez les malades présentant une hépatite B aiguë.
Infection Infecti on Phase postinfectieuse
aiguë (années)aiguë
récenteHBsAg
Anti-HBeAg
HBeAg Anti-HBsAg
6 à 26 4 à 12
Anti-HBeAg
Temps (semaines)
Concentration relative
Concentration relative
8
Figure 3: Profil sérologique d'un porteur d'HBsAG chronique: pas de séroconversion
| Infection chroniqueaiguëInfection
HBeAg Anti-HBcAg
HBsAg
6 à 26
Temps (semaines)
Figure 4: Profil sérologique d'un porteur d'HBsAG chronique: séroconversion tardive
Infection aiguë ction chronique
HBsAg
* » * *
HBeAg Anti-HBeAg
6 à 26
Temps (semaines)
9
après la disparition de l'HBsAg. Il y a donc une période où
l'on ne peut détecter ces deux marqueurs et où il est
important d1 utiliser les autres marqueurs.
Les anticorps anti-HBc apparaissent en même
temps que les symptômes et persistent toute la vie. Etant
présents à tous les stades de 11 infection, ils représentent
11 indicateur le plus fiable de la maladie ou de l'état de
porteur chronique.
L'HBeAg apparaît en même temps que l'HBsAg
et disparaît peut de temps avant ce dernier. Il est le signe
de la réplication virale donc de la phase infectieuse. Peu
de temps avant sa disparition, les anticorps anti-HBe
apparaissent indiquant la séroconversion.
Le profil sérologique présenté n'est pas le
seul possible (Figures 3 et 4). Des études ont démontré
1'existence de divers autres profils sérologiques (11).
E- Modes de transmission.
La transmission de 1'hépatite B semble, pour
la plus large part, associée au sang et à ses dérivés
I(Transfusions sanguines ou injections de dérivés sanguins).
Cependant, d'autres liquides biologiques sont soupçonnés de
jouer un certain rôle dans la transmission de 1'infection:
la salive, le liquide vaginal, le sperme, le liquide
amniotique, le colostrum, le lait et le sang menstruel (1,
2). La transmission se fait généralement par des biais
divers : acupuncture, tatouage, injections diverses,tatouage, inj ections
percutanée (via de petites blessures) et par le contact
sexuel.
F- Distribution géographique de 11 hépatite B
L1 hépatite B ne frappe pas également dans
tous les pays du monde. Des études épidémiologiques
démontrent que dans les pays où le niveau de vie est élevé,
il n1 existe que peu de porteurs chroniques (0.1 à 1 %)
comparativement aux zones plus défavorisées (Afrique
équatoriale, Asie) où le taux peut atteindre 20% (1).
Des études sur la dispersion géographique
des quatre principaux sous-types de l'HBsAg montrent que le
sous-type "adw" est prédominant en Amérique du Nord et dans
le Nord-Ouest de 11 Europe; que 11"ayw" se retrouve en
Méditerranée et en Afrique; que 1'"adr" est retrouvé presque
exclusivement en Extrême Orient et que 11"ayr" est confiné
dans la région du Pacifique (14).
G- Importance du diagnostic.
Les raisons justifiant la recherche de la
présence du virus de 1'hépatite B sont nombreuses et ne
doivent pas être prises à la légère.
-Un test positif pour l'HBsAg implique le
rejet du sang donné pour fins de transfusion.
-Un test positif doit faire prendre des
précautions afin d1 éviter la contamination d'autres patients
ou du personnel médical lors de la manipulation de
prélèvements sanguins ou lors d1 interventions chirurgicales.
-Les porteurs chroniques doivent être
identifiés car ils peuvent représenter un danger pour les
personnes qui les côtoient.
-Le dépistage systématique des porteurs
chez les donneurs de sang du Québec a permis de situer son
incidence à 39 cas sur 10,000 (12, 13).
-Le contrôle des hépatites de type B
pourrait permettre d1 abaisser 11 incidence du cancer du foie
car des études ont démontré que 11 hépatite B serait à
11 origine des cancers primitifs du foie (1, 16). Cela revêt
une grande importance dans les pays d'Afrique et d'Asie où la
proportion de porteurs chroniques peut atteindre 20%.
H- Problématique des porteurs chroniques.
En 1976, la population mondiale des porteurs
chroniques était évaluée à environ 112 millions (2). Il a
été observé que les hommes deviennent plus facilement
porteurs que les femmes. Cependant, d1 autres facteurs
semblent amener à la chronicité: une infection contractée en
bas âge, un déficit immunitaire congénital ou acquis, et
semble-t-il, certaines causes d'ordre génétique (2).
Il est clair que les porteurs chroniques
constituent un problème universel pour les transfusions
sanguines et autres soins médicaux. Ils représentent une
source constante de transmission de 11 hépatite B qui ne
peut être négligée. Il est donc nécessaire de les identifier
afin d'éviter toute transmission ultérieure.
I- La vaccination.
En 1983, Merck Sharp and Dome a introduit,
sur le marché Nord-Américain, un vaccin contre l'hépatite B.
La mise au point d'un tel vaccin s'est heurtée à
l'impossibilité de cultiver le virus. Il est donc nécessaire
de purifier l'HBsAg du sérum de porteurs chroniques, de
l'inactiver et d'y ajouter un adjuvant (hydroxide d'alumine).
Cependant, la production d'HBsAg, par le génie génétique,
figure parmi les autres sources possibles de vaccin.
Certains gènes viraux ont déjà été clonés chez la bactérie et
permettent d'espérer, pour bientôt, l'utilisation d'un vaccin
"synthétique".
La mise au point du vaccin contre l'hépatite
B permet un certain contrôle de cette infection dans les
laboratoires d'hôpitaux.
III - Les méthodes de dépistage.
Depuis qu'il est obligatoire qu'un test de
détection de l'hépatite B soit effectué sur tous les dons de
sang (et de ses dérivés) pour fins thérapeutiques,
l'incidence des hépatites post-transfusionnelles a diminué
d'environ un tiers (17). Le test de dépistage, généralement
utilisé, est la détection de 1'antigène de surface du virus
(HBsAg).
Il existe diverses méthodes de dépistage, de
1'HBsAg, de qualité et de sensibilités variables (Tableau
II). L1 épreuve radio-immunologique est reconnue comme étant
la plus sensible pour le dépistage de 1'HBsAg (14).
L1 épreuve immuno-enzymatique, à peu près aussi sensible, est
cependant très intéressante puisqu'elle évite la manipulation
de produits radioactifs et fournit des réactifs plus stables
(3 mois vs 4 semaines). Le principe de ces deux épreuves est
similaire. Dans le cas de 1'épreuve radio-immunologique
(RIA), un premier anticorps anti-HBs couplé à la matrice
(tubes ou billes de plastique) permet de fixer la particule
antigénique (HBsAg) dont la présence est confirmée par
1'addition d'un second anticorps (Anti-HBs) marqué à l'Iode-
125 (Figure 5). Pour ce qui est de 1'épreuve immuno
enzymatique (EIA), le principe demeure le même mais dans ce
cas, le second anticorps (Anti-HBs) est couplé à un enzyme et
c'est la capacité de ce dernier à dégrader un substrat qui
nous permet de détecter la présence de 1'HBsAg.
Généralement, les deux anticorps utilisés sont d'origines
animales différentes.
La plupart des trousses, présentement sur le
marché, utilisent l'une de ces deux méthodes. Ces trousses
sont composées d'anticorps polyclonaux de diverses sources
(cobaye, chèvre) (18). Une seule trousse, utilisant des
anticorps monoclonaux, est actuellement sur le marché Nord
Américain (N.M.L. Laboratories, U.S.A.).
14
TABLEAU II:
METHODES DE DEPISTAGE DE L'ANTIGENE HBs
METHODES SENSIBILITE .
1) DIFFUSION DOUBLE 1
2) CONTRE ELECTROPHORESE 5
3) TEST AU LATEX 5
4) INHIBITION D'HEMAGGLUTINATION PASSIVE 10 A 20
5) FIXATION DU COMPLEMENT 10 A 20
6) HEMAGGLUTINATION PASSIVE (RCA) 5 A 100
7) TEST RADIOIMMUNOLOGIQUE (PHASE SOLIDE) 500 A 1000
8) TEST IMMUNOENZYMATIQUE 500
.5
FIGURE 5:REPRESENTATION SCHEMATIQUE D'UNE EPREUVE RADIO-IITUNOLOGIQUE
a) Phase solide: matrice et anticorps spécifiquesb) Antigène du sérumc) Antigène fixé sur la phase solided) Anticorps radioactife) Dosage des antigènes par radioactivité
IV - Apports des anticorps monoclonaux.
Les antisérums conventionnels présentent des
inconvénients qui ne sont pas négligeables. Leur production
demande une purification continuelle d'antigène. La
spécificité des antisérums peut être compromise par une
réactivité naturelle ou à la suite d'une immunisation avec un
antigène qui n'est pas absolument pur d'où la nécessité de
les absorber. La proportion des immunoglobulines
spécifiques, dans un antisérum, est faible par rapport aux
autres immunoglobulines et exige d'autres étapes de
concentration et de purification. Le titre et 11 affinité ne
sont pas constants d'un lot à un autre puisque la réponse
immunitaire, pour un même antigène, varie d'un animal à un
autre.
La technologie des hybridomes, producteurs
d'anticorps monoclonaux, développée en 1975 par Milstein et
Kohler (19) est aujourd'hui bien établie (20, 21) et trouve
une multitude d'applications. Les anticorps monoclonaux
remédient aux inconvénients des antisérums conventionnels et
sont à la base d'une véritable révolution technologique (22,
23, 24, 25, 26).
La préparation d'anticorps monoclonaux ne
requiert pas un antigène pur ni de nouvelles immunications à
moins que l'on désire d'autres clones sécréteurs. L'antigène
purifié n'est nécessaire que lors du dépistage des clones
sécréteurs. Une fois produit, 1'anticorps monoclonal peut
1 7
servir à purifier 11 antigène à un très haut degré de pureté.
La spécificité et l'affinité des anticorps monoclonaux sont
constants puisqu'un clone ne sécrète qu'un type
d'immunoglobulines. Lorsqu'un clone est établi, l'anticorps
sécrété peut être obtenu en grandes quantités par le passage
du clone à la souris.
Les anticorps monoclonaux ne présentent pas
que des avantages; puisqu'ils ne reconnaissent qu'un site
antigénique, ils ne peuvent être utilisés dans les essais de
précipitation tels que l'immunodiffusion radiale, 1'immuno
électrophorèses , etc. Dans les essais de cytotoxicité
(fixation du complément), il peut arriver que l'anticorps
sécrété ne fixe pas le complément et que l'on soit obligé de
générer d'autres clones dans l'espoir de trouver l'anticorps
désiré.
Il n'en reste pas moins que la technique des
hybridomes demeure le chef de file de la biotechnologie.
V - But du présent travail.
Notre but est de développer une trousse de
détection de l'HBsAg utilisant la technologie des anticorps
monoclonaux. Les lignées d'hybridomes seront développées
lors de fusions de cellules spléniques, provenant de souris
BALB/c immunisées avec de l'HBsAg (ad ou ay), et des cellules
de lignée myéloïde (Sp2/0) (Figure 6). Ils seront
sélectionnés selon leur stabilité, la spécificité et
l'affinité des anticorps qu'ils produisent. Des essais de
fixation sur matrice et de marquage à l'iode-125 seront
18
effectués sur les divers anticorps sélectionnés afin de
trouver ceux pouvant composer la trousse. Par la suite, des
essais de pairages seront effectués, entre les anticorps
sélectionnés, afin de trouver la meilleure combinaison. La
sensibilité de la trousse sera déterminée comparativement à
la trousse maison du laboratoire ainsi qu'au test AUSRIA II
(Abbott Laboratories, U.S.A.); ce dernier étant reconnu comme
le meilleur dans sa catégorie (polyclonaux) (17). Ensuite,
la trousse servira d'outil de dépistage sur un volume
minimal de 1000 sérums et cela, parallèlement a la trousse
AUSRIA II. De façon générale, nous désirons développer une
trousse, de sensibilité et spécificité accrues, qui servira
d'outil de dépistage dans le laboratoire clinique.
19
CULTURE
FIGURE 6: PRODUCTION D'HYBRIDOMES.
#• ••
F U S I ON
S p 2 / O
2 5 x«
1 O
HAT + 20%'FBS
Clonage
ASCITE
CONG ELATI ON
\. X.
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MATERIELS ET METHODES
21
I - Purification de 1'HBsAg.
A- Source de 11HBsAg.
Des plasmas de porteurs asymptomatiques ont
été fournis par le Centre de Transfusion Sanguine (C.T.S.) de
Québec qui effectue le dépistage (HBsAg) sur tous les dons de
sang par une méthode radioimmunologique très sensible. Parmi
ces plasmas, nous avons sélectionné les plus riches en
antigène pour purification ultérieure.
B- Sous-typage et titration.
La titration et le sous-typage des plasmas
positifs sont effectués par contre-électrophorèse (C.E.P.)
sur plaque d'agarose 0.8% (Bio-Rad, U.S.A) dans du tampon
barbitral 0.05M pH 8.6. Les dilutions des plasmas sont mises
à migrer contre 11 anticorps anti-HBsAg pendant 30 minutes
sous une tension de 250 volts. Un arc de précipitation entre
les puits (anticorps-plasmas) traduit une réaction positive.
L1 inverse de la dilution maximale donnant un précipité
indique le titre (0 à 1/256). Seuls les sacs de sang dont le
titre est supérieur à 1/16 sont conservés pour purification
ultérieure. Le sous-typage est effectué par la même méthode
mais sur une seule dilution de 11 antigène (titre 1/2 à 1/16).
Les réactifs de titration et de sous-typage
ont été préparés au laboratoire par immunisation de lapins
avec de 11 antigène purifié. Des antigènes ("ad" et "ay") et
22
des anticorps de références fournis par le N.I.H. (Bethesda,
U.S.A.) ont permis de standardiser nos antisérums de sous-
typage. En bref, des lapins ont été immunisés avec 1 à 2 mg.
d1 antigène ("ad" ou "ay") en adjuvant de Freund complet
(Difco Laboratories, U.S.A) suivi d'une seconde injection (21
jours plus tard) en adjuvant incomplet (Difco Laboratories,
U.S.A.). Dix jours après la seconde injection, les lapins
ont été saignés à blanc. Les antisérums anti-"ad" ont été
saturés avec de 11HBsAg-"ay" (prépurifié et concentré à un
titre de 1/1000 en C.E.P.) jusqu'à ce que 1'anticorps ne
reconnaisse que les antigènes de sous-type "ad". De la même
manière, les antisérums anti-"ay" ont été saturés avec de
11 antigène HBsAg-"ad". Nous avons ainsi obtenu des
antisérums spécifiques à chaque sous-type d'HBsAg.
C- Purification par chromatographie d'affinité
Du serum de mouton anti-HBsAg, préparé
antérieurement au laboratoire, est précipité au sulfate
d'ammonium à 50% de saturation. La fraction
d'immunoglobulines obtenue est dialysée extensivement contre
du tampon phosphate salin pH 7.4. Les anticorps anti-HBsAg
sont couplés à 30 ml. de Sépharose CL 4B (Pharmacia, Suède)
fraîchement activé avec du bromure de cyanogène (27) à raison
de 20 mg. de protéine par ml de gel. Le couplage est
effectué à pH de 7.4 afin de conserver 1'intégrité de
1'anticorps. L'immunoabsorbant obtenu est lavé avec du PBS,
23
puis sature avec une solution de glycine 1M (pH: 8.0) et
finalement vidé dans une colonne de 25 X 60 cm (Pharmacia,
Suède). Après un cycle de lavage à haut et bas pH,
1'immunoabsorbant est placé en tampon PBS pH 7.5, 50 nM
citrate de sodium.
Des "pools" de plasmas positifs HBsAg-ad et
HBsAg-ay (Titre 1/16 à 1/64), sont passés successivement sur
la colonne d'immunoabsorbant jusqu’à saturation de
11 anticorps. Après lavage du gel avec du tampon phosphate
0.5M NaCl (pH 7.4), 1'antigène HBsAg est élué avec une
solution de Nal 5M, 50 mM Tris-HCl, pH 6.5. L1élution de
11 antigène est suivie par la lecture de 11 absorbance à 280 nm
(D.O. 3.4 = 1 mg./ml). Les fractions contenant 11 antigène
sont réunies et dialysées une nuit à 4°C contre de la saline
(NaCl 0.85%) puis concentrées par ultrafiltration sur
membrane XM 50 (Amicon, U.S.A.).
La solution obtenue (8 ml) est appliquée sur
une colonne de Sépharose 6B (5X60 cm, Pharmacia, Suède)
équilibrée avec du tampon phosphate salin; 11 antigène sort
peu après le volume mort de la colonne et les fractions
correspondant au pic d1 absorption (280 nm) sont réunies et
concentrées par ultrafiltration.
A ce stade, 11 antigène est assez purifié pour
servir aux immunisations et aux dosages radio-immunologiques.
24
II - Production d'hybridomes.
A- Matériels et milieux.
1) Equipement
Pour les fusions cellulaires, trois items
sont essentiels : une hotte à flux laminaire (Canadian
Cabinet, Canada), un incubateur à atmosphère contrôlée (Forma
Scientific, U.S.A.) et un système pour cryopréservation à
azote liquide (Linde, U.S.A.). Les autres fournitures
requises pour cette technique sont celles retrouvées dans
un laboratoire de culture cellulaire.
2) Milieux
i) Le sérum de veau fêtai (SVF).
Ce ne sont pas tous les lots de SVF
qui peuvent être utilisés lors de fusions cellulaires. Il
est donc nécessaire de "tester" différents lots, en
effectuant une fusion, afin de trouver celui donnant un haut
rendement d1 hybrides. Un bon sérum permet de voir des clones
de 10 à 30 cellules quatre jours après la fusion et cela,
dans 50 à 60% des puits.
ii) Les solutions de travail.
Toutes les solutions de travail
doivent être stérilisées sur filtre 0.22 microns (u).
25
- Milieu standard
Pour la culture des cellules
tumorales et des hybrides établis, le milieu Iscove's
Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (Gibco, U.S.A.) est
utilisé. Il est alors supplémenté de 5% SVF, de 0.05% 2-
Mercaptoéthanol (0.1M), de pénicilline (10 unités
internationales/ml) et de streptomycine (0.1 mg./ml) (Gibco,
U.S.A.). Le milieu peut être conservé à 4°C pour une période
maximale d'un mois.
- Milieu sélectif HAT
Les ingrédients du milieu HAT sont
préparés en solutions concentrées 100X. Dans un ballon de 100
ml, 1.8 mg. d1 aminoptérine (Sigma, U.S.A.) est ajouté à de
l'eau déionisée et dissous par 1'addition de NaOH 1N. Le pH
de la solution est ensuite ajusté à 7,8 et la solution est
complétée à 100 ml. Des aliquots sont préparés et congelés à
-20 °C.
L'hypoxanthine et la thymidine
peuvent être préparés en une seule solution. Dans un ballon
de 100 ml, 136 mg. d'hypoxanthine (Sigma, U.S.A.) sont
dissous dans de l'eau déionisée, par 1'addition de NaOH 1 N.
Puis, 76 mg. de thymidine (Sigma, U.S.A.) sont ajoutés ; le pH
est réajusté à 9,5 avec de l'acide acétique et le volume
complété à 100 ml. La solution est aliquotée et conversée
à -20°C.
La préparation du milieu sélectif
26
"HAT" requiert le milieu standard (IMDM) préparé tel que
décrit précédemment. Cependant, la concentration de SVF est
portée à 20% et les ingrédients "HAT" sont ajoutés à raison
de 1%. Le milieu sélectif ne doit être préparé que 24 à 48
heures avant la fusion.
- Milieu "HT"
Le milieu "HT" est préparé de la même
manière que le milieu sélectif mais en omettant
11 aminoptérine. Il est conversé à 4°C pour une période
n1 excédant pas deux semaines.
- Tampon salin (PBS)
Le tampon PBS, utilisé lors de la
production des hybridomes, est composé des éléments
suivants: NaCl 0.15 M, KC1 0.005 M, Na2HP04 .01 M, NaH2P04
0.005 M, dextrose 0.2% et rouge de phénol (Sigma, U.S.A.) à
0.001%. Il peut être conservé à 4°C pour une période d'un
mois.
- Solution de dénombrement des
lymphocytes.
Afin d1 évaluer le nombre de
lymphocytes obtenus de la rate, il est très efficace
d'effectuer une dilution dans une solution qui provoque la
lyse des globules rouges. Une telle solution est composée
d'acide acétique glacial (Fisher Scientific, U.S.A.) à 3% et
27
- Agent fusionnant
L'agent fusionnant utilisé est le
Polyéthylène Glycol (PEG). Fazekas (21) a étudié l'effet des
divers types de PEG en association avec diverses
concentrations de Diméthyl Sulfoxide (DMSO). Ces études ont
révélé que le meilleur milieu fusionnant est celui composé de
PEG 4000 (Merck, Allemagne) à 50% 'et de DMSO à 5% final. Les
deux éléments sont dissous dans du tampon PBS (pour
hybridomes) à 45°C. La solution est stérilisée et conservée
à 37°C. Il est à noter que cette solution n'est préparée
que le jour de la fusion.
- Milieu de congélation
Le milieu utilisé pour la
cryopréservation des cellules est composé de milieu standard
(IMDM) supplémenté de 20% SVF et de 10% DMSO. Ce milieu ne
peut être conservé que 14 jours à 4°C.
B- Protocole d'immunisation.
Il existe une multitude de protocoles
d'immunisation qui varient selon 1'auteur et le type
d'antigène (29). Nous utilisons, pour l'HBsAg, un protocole
standard utilisant des souris BALB/c (Jackson Laboratories,
U.S.A.) âgées de 6 à 8 semaines (18-20 g.) et qui se décrit
comme suit :
- Jour 0: 0.05 mg. d'HBsAg + AFC : s.c.
28
- Jour 21: 0.05 nung. d'HBsAg : i.v.
- Jour 22: 0.05 mg. d'HBsAg : i.v.
- Jour 25: FUSION.
C- Choix des cellules de myélome.
Le choix de la lignée de cellules tumorales
est d'une grande importance. De nombreuses lignées ont été
développées avec chacune leurs propres caractéristiques
(Tableau III). Il est plus avantageux de sélectionner une
lignée qui ne synthétise ni ne sécrète de chaînes légères.
La lignée Sp2/0-Ag14, un hybride de la P3/X63-Ag8, répond à
ce critère. Cette lignée étant la plus utilisée, il nous a
été facile de nous la procurer.
La Sp2/0 est cultivée dans des boîtes de
culture de 80 cm2 (Nunc, Danemark) en présence de milieu
standard à 5% SVF (15 ml) dans un incubateur à atmosphère
contrôlée (37°C, 5% Co2 et 95% humidité).
D- Fusion cellulaire.
1) Préparation des cellules nourrissières.
L'apport des cellules nourrissières,
pour la production d'hybridomes, a déjà été démontré (20,
21). L'utilisation de ces dernières aide à la croissance et
à la survie des hybrides. Les macrophages péritonéaux entrent
dans cette catégorie et sont facilement disponibles.
TABLEAU III: EXPRESSION DES IMMUNOGLOBULINES CHEZ QUELQUES MYELOMES DE SOURIS.
Synthese Secretion
P326BU4 Kappa Kappa
45,6, TGI,7 Kappa Kappa
P3/NS1/1-Ag4-1 _____ _____
Sp2/0-Ag14 ° _____
P3/X63-AG8 Kappa Kappa
Hybride de P3/x63-Ag8//P3/x65-Ag8o
30
Normalement, on les retrouve en nombre peu élevé d'où la
nécessité de stimuler leur migration à l'aide d'une solution
stérile d'amidon à 2% (saline). Cette stimulation est
effectuée sur 2 à 3 souris BALB/c (1 ml/souris), 2 jours
avant la fusion.
Le jour précédant la fusion (jour 24),
les souris "stimulées" sont sacrifiées. On injecte, dans la
cavité péritonéale, une solution stérile de PBS-sucrose
11.6% à raison de 10 ml par souris. Après un massage délicat
de 1'abdomen, le liquide est recueilli et déposé dans un tube
de 50 ml stérile (Corning, U.S.A.). Le volume est complété
avec du PBS (pour hybridome) et le tube est centrifugé 10
minutes à 200 X g. Puis, le surnageant est décanté et le
culot est resuspendu dans un volume minimal de PBS afin d'en
effectuer le décompte cellulaire (hémacytomètre). La
solution-mère est, de nouveau, lavée avec du PBS et le culot
resuspendu dans du milieu sélectif HAT afin d1 obtenir une
concentration de 15,000 macrophages/ml.
A l'aide d'une pipette multiple
(Dynatech, U.S.A.), 0.1 ml de la solution de macrophages est
déposé dans chaque puits d'une plaque à culture de 96 puits
(Nunc, Danemark). Pour une fusion (1 rate), 16 plaques sont
ainsi préparées puis placées en atmosphère contrôlée.
2) Préparation des Sp2/0.
Lors d'une fusion cellulaire, il est
31
recommandé que les cellules tumorales soient en phase de
croissance exponentielle» Dans ce but, la journée précédant
la fusion, les cellules sont repiquées (1/2) dans du milieu
standard supplémenté de 20% SVF.
La journée de la fusion, les cellules
sont récupérées, centrifugées (200 X g, 10 minutes) et
resuspendues dans un volume minimal de PBS (10 ml). Les
cellules sont dénombrées, lavées de nouveau puis
resuspendues dans du PBS afin d'obtenir une concentration
finale de 10 millions de cellules par ml de milieu. Pour une
fusion, le minimum de cellules tumorales requises est de 20
millions.
3) Splénectomie.
La souris immunisée est sacrifiée et le
sérum de cette dernière est conservé pour être utilisé, comme
témoins positif, lors du dépistage des clones sécréteurs. La
rate est prélevée aseptiquement et déposée dans un plat de
pétri stérile de 100 X 15 mm (Fisher Scientific, U.S.A.)
contenant 5 ml de PBS stérile. En grattant la capsule avec
une pipette stérile, les cellules sont récupérées puis lavées
dans 50 ml de PBS stérile (200 X g, 10 min.). Elles sont
resuspendues dans un volume minimal de PBS et dénombrées par
une dilution (1:10) de la solution-mère dans la solution pour
décompte lymphocytaire. Les cellules sont, de nouveau,
lavées puis resuspendues dans du PBS afin d'obtenir une
32
concentration finale de 10 millions de lymphocytes par ml de
tampon.
4) Fusion.
Dans un tube de 50 ml stérile (Corning,
U.S.A.), 20 millions de Sp2/0 (2 ml) sont combinés à 100
millions de lymphocytes (10 ml). Le volume est complété avec
du PBS et le tube est centrifugé à 200 X g pendant 10
minutes. La solution est décantée et le culot est dissocié
par 11 application de chiquenaudes sur le tube.
Sous agitation constante, 1 ml de la
solution de PEG (37°C) est ajouté au culot sur une période de
1 minute. Puis, le tube est fermé et, en agitant, plongé
dans un bain-marie (Haakes, U.S.A.) à 37°C pendant 90
secondes. On arrête la fusion par 11 addition de 20 ml de
PBS dans les temps suivants:
T (sec.) Quantité (ml)
30
30
60
1
3
1 6
Le volume est complété avec du PBS et
la solution est laissée au repos pour environ cinq minutes.
Les cellules sont centrifugées (200 X g, 10 min), lavées une
seconde fois, avec du milieu IMDM pur et resuspendues dans
160 ml de milieu sélectif HAT.
A l'aide de la pipette multiple, les
cellules sont distribuées dans les 16 plaques (96 puits) à
33
raison de 0„1 ml par puits. Les plaques de culture sont
replacées dans l'incubateur à atmosphère contrôlée.
5) Dépistage.
Après environ dix jours, les plaques
sont inspectées et le milieu HAT est remplacé par du milieu
frais. Deux jours plus tard, le dépistage est effectué.
Plusieurs méthodes de dépistage ont été décrites par divers
auteurs (20, 21) et tous estiment que la méthode choisie doit
être rapide et reproductible. Notre choix s'est arrêté sur
le RIA en phase liquide. i)
i) Production de l'antisérum anti-
immunoglobulines de souris.
Des IgG de souris sont purifiés par
passage du sérum de souris normale sur Sépharose-Protéine A
(Pharmacia, Suède) suivi d'un tamisage sur Séphacryl 300
(Pharmacia, Suède) (voir section III, C). La concentration
des immunobulines est évaluée au spectrophotomètre à 280 nm
(D.O.:1.5 = 1 mg./ml) et la solution est dialysée contre de
la saline (NaCl 0,.9%) pendant une nuit à 4°C.
Quatre lapins "Nouvelle zélande" sont
immunisés selon le protocole suivant:
- Jour 0: 2 mg. d'immunoglobulines +
ACF : s.c.
34
- Jour 21: 2 mg. + AIF : s.c (1/2) et
i.m. (1/2).
- Jour 31: Prélèvement par 11 oreille.
Chaque antisérum est dilué (1/2, 1/4,
1/8,1/10 et 1/16) afin d1 évaluer sa capacité à précipiter les
immunoglobulines d'un sérum, de souris normale, dilué 1/100.
La dernière dilution où il se produit de la floculation est
celle qui sera utilisée lors du dépistage. Elle est
habituellement de l'ordre de 1/10.
ii) Marquage de 1'antigène.
L'HBsAg est marqué à 1'iode-125 suivant
la méthode utilisant 1'Iodo-Gen (Pierce Chemical, U.S.A.)
(Voir section III, E). Une fois marqué, il est dilué dans un
tampon PBS-BSA (0.5%) de manière à obtenir 20,000 CPM par 0.1
ml.
iii) Epreuve radio-immunologique.
Pour chaque puits où il y a croissance
de cellules, 0.1 ml de surnageant est prélevé et déposé dans
un tube de verre 12 X 75 mm (Quélab, Canada) contenant 0.1 ml
d'HBsAg marqué (20,000 CPM) auquel a été ajouté du sérum de
souris normale (1%). Après une heure d'incubation à la
température de la pièce, 0.1 ml d'antisérum, dilué dans du
PBS-BSA (0.5%) est ajouté au mélange. Après une heure à la
température ambiante, 1 ml de saline froide (NaCl 0.85%) est
ajouté à chaque tube. Les tubes sont centrifugés dans une
centrifugeuse Centra 7 (I.E.C., U.S.A.) à 3,000 RPM pendant
35
30 minutes (4°C). Le liquide est alors décanté et les tubes
sont comptés dans un compteur gamma (Abbott Laboratories,
U.S.A.).
iv) Sélection des hybrides.
Les hybrides, trouvés positifs lors du
dépistage, sont évalués selon la capacité de chacun à
précipiter l'HBsAg marqué. Les surnageants sont dilués dans
du PBS-BSA (0.5%), de 1000 à 1 million de fois. Un RIA
(phase liquide) est effectué sur chaque dilution et seuls les
hybrides, précipitant au moins 25% de 11 antigène et à une
dilution minimale de 100,000, sont conservés. La capacité à
précipiter est évaluée face aux deux sous-types "ad" et "ay".
Les hybrides à haute capacité seront renourris avec 0.1 ml de
milieu HT et les plaques (96 puits) sont replacées en
atmosphère contrôlée. Le lendemain, les hybrides
sélectionnés sont repiqués dans des plaques à culture de 24
puits (Nunc, Danemark) contenant 1.5 ml de milieu HT par
puits. Les plaques sont placées dans les conditions
habituelles pour environ une semaine.
6) Clonage.
Lorsque les cellules forment une
couronne dans les puits, les surnageants sont "testés" afin
de s'assurer que les hybrides sécrètent toujours. Si
11 épreuve est positive, le milieu HT est remplacé par 1.5 ml
36
de milieu standard supplémenté de 20% SVF et les plaques sont
retournées à 11 incubateur pour une nuit.
Le lendemain, chaque hybride est cloné,
par dilution limite, dans du milieu standard supplémenté de
20% SVF. Trois plaques à culture de 96 puits sont
"ensemencées" avec des dilutions respectives de 3 , 1.5 et 0.5
cellules par puits et cela, pour chaque hybride sélectionné.
Les plaques, ainsi préparées, sont placées dans les
conditions de culture habituelles.
Après 12 à 14 jours, les surnageants des
puits où il y a croissance, sont "testés" (RIA liquide).
Pour la plus forte dilution cellulaire (0.5) , si tous les
puits sont positifs, le clone peut être repiqué dans une
boîte à culture de 25 cm2 (Nunc, Danemark) contenant 6 ml de
milieu standard supplémenté de 20% SVF. Par la suite, le
clone sera passé graduellement à du milieu standard contenant
5% de SVF.
Dans le cas contraire, 11 hybride doit
être recloné jusqu'à 11 obtention d'un clonage positif à 100%.
7) Cryopréservation.
Tous les clones doivent être congelés,
le plus rapidement possible, afin d'éviter la contamination
de ces derniers. Soixante millions de cellules sont
récupérées et centrifugées à 200 X g pendant 10 minutes. Le
surnageant est décanté et le culot est resuspendu dans 6 ml
de milieu à congélation froid (4°C). Six cupules à
37
congélation de 1 ml (Sarstedt, Allemagne) sont remplies puis
placées dans un congélateur à -80 °C (Forma Scientific,
U» S.A.) pour la nuit. Le lendemain, les cupules sont
transférées dans un récipient à azote liquide (Linde,
U.S.A.).
Quelques jours plus tard, une cupule est
décongelée afin de vérifier la stérilité et la viabilité
cellulaire. La cupule est placée dans un bain-marie à 37°C,
jusqu'à ce que le milieu soit complètement dégelé. Les
cellules sont lavées une fois, dans du PBS puis transférées
dans une boîte de culture contenant le milieu standard (5%
SVF); cette dernière est ensuite placée dans 11 incubateur à
atmosphère contrôlée.
E- Difficultés de la fusion cellulaire.
La fusion cellulaire est une technique
délicate qui demande des attentions particulières. Les
difficultés rencontrées lors de la production d'hybridomes
peuvent être prévenues par une bonne planification. La
vérification de la stérilité des milieux ainsi qu'une bonne
méthode de dépistage sont essentielles avant d'effectuer
toute fusion.
1) Les contaminations.
Meme en présence d'antibiotiques, il
38
peut y avoir contamination de certains puits. Une méthode
efficace, pour circonscrire la contamination, est de laver
les puits contaminés avec une solution de NaOH 10N et de les
assécher.
Un clone établi, qui est contaminé, peut
être sauvé par le passage de ce dernier chez la souris
(BALB/c). Cinq à sept jours après l'injection du clone, les
cellules sont récupérées aseptiquement puis remises en
culture.
2) Perte de production.
Les hybrides ont tendance à perdre leur
chromosomes et ainsi cesser de sécréter. Il est important
de suivre 11 évolution des clones, de la fusion à la
congélation. Certaines précautions doivent être prises afin
d1 éviter de perdre des clones :
- Vérifier périodiquement la croissance
des clones, car un milieu appauvri en éléments nutritifs
favorise la perte de chromosomes.
- Eviter les passages multiples en
culture ou en ascite sans reclonages périodiques.
- Lors de la décongélation d'un clone,
toujours recloner ce dernier.
3) Diminution de la croissance.
Les hybrides sont très sensibles à
39
"11 environnement" et certains facteurs doivent être
surveillés afin d'éviter la perte de clones:
Le PEG doit être l'objet d'une
attention particulière car certains lots sont toxiques.
La qualité du SVF doit être de
premier ordre.
4) Non-sélection du milieu HAT.
La non-sélection du milieu HAT provient
soit de la mutation des cellules tumorales (peu fréquent),
soit de la dégradation de l'aminoptérine. Ce dernier cas
peut être évité par l'essai périodique, sur des cellules
tumorales, du milieu HAT.
III - Production et caractérisation des anticorps
monoclonaux.
A- Identification du type d'immunoglobulines
sécrétées.
L'identification, du type d'immunoglobulines
sécrétées, est effectuée par immunodiffusion double
d'Ouchterlony (30) sur des surnageants de cultures à
confluence.
Une solution de PBS-Agarose (0.8%) est
chauffée jusqu'à dissolution complète de 1'agarose. Lorsque
la température est redescendue à environ 55°C, la gélose est
coulée sur des lames de microscopes (Fisher Scientific,
40
U.S.A.) fixées à un support (Gelman, U.S.A.). Lorsque la
gélose est solidifiée, on la perfore avec une matrice à 7
puits de 3 mm (Gelman, U.S.A.).
Les surnageants sont déposés dans les puits
périphériques en ayant soin d'ajouter un standard.
L'antisérum spécifique (Miles Laboratories, U.S.A.) est
déposé dans le puit central. L1 opération est répétée avec
divers antisérums (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA et IgE)
(Figure 7). La plaque est incubée, dans une chambre humide
pour la nuit à la température de la pièce. Le lendemain, la
plaque est lue à l'aide d'une source lumineuse.
B- Production d'ascites.
La production d'anticorps monoclonaux peut
s'effectuer de deux manières : la culture, en milieu
synthétique, est une méthode qui permet de récolter entre
0.05 et 0.10 mg. d'anticorps par ml comparativement à la
production sous forme d'ascites qui donne entre 1 et 10 mg.
par ml. Cette dernière méthode est très avantageuse lorsque
de grandes quantités d'anticorps sont requises.
La production de liquide ascitique est
facilitée par le traitement des souris (BALB/c) avec une
injection intrapéritonéale de 0.5 ml de pristane (Aldrich
Chemicals, U.S.A.) (2, 6, 10, 14-Tétraméthylpentadécane) 8 à
10 jours avant l'injection des cellules. Après ce temps, 2
millions de cellules, contenues dans du milieu IMDM pur, sont
41
FIGURE 7î IMMUNODIFFUSION DOUBLE D'OUCHTERLONY,
ANTISERUM SPECIFIQUE
® STANDARD
O SURNAGEANTS DE CULTURE
42
injectées intrapéritonêalement à chaque souris„ Après 12 a
14 jours, le liquide est récolté en perforant 11 abdomen avec
une aiguille 18G (Becton Dickinson, Canada). Les souris
peuvent ainsi être prélevées plusieurs fois et donnent
généralement entre 5 à 10 ml de liquide par souris. Le
liquide est aussitôt centrifugé et congelé à -80°C.
C- Purification des anticorps.
1) Protéine A-Sépharose.
Les anticorps de type IgG peuvent être
purifiés selon une technique simple et rapide: la
chromatographie d1 affinité sur Protéine A-Sépharose (31).
L'affinité de la protéine A pour la portion Fc des IgG dépend
du sous-type de 11 immunoglobuline. Par des variations de pH,
on peut purifier chaque sous-type d'IgG (Figure 8). A pH
8.0, les IgM et les IgA sont éluées alors que les IgG sont
retenues. En abaissant le pH, les sous-types sont élués
séparément et sont ainsi purifiés. Cette technique peut
s'appliquer à des sérums, des surnageants de culture, aux
liquides ascitiques ou à tout autre liquide biologique.
Un volume de 5 ml de protéine A-
Sépharose (Pharmacia, Suède), contenu dans une colonne de 0.9
X 60 cm (Pharmacia, Suède), est équilibré avec du tampon
phosphate 0.1 M (pH: 8.1). Le liquide ascitique (5 ml), dont
le pH a été ajusté à 8.1 avec une solution de K2HP04 (1 M,
pH: 8.8), est passé sur la colonne et collecté à raison de
3.6 ml par tube. Du tampon phosphate 0.1 M (pH: 8.1) est
43
FIGURE 8:ELUTION DES IMMUNOGLOBULINES, D'UNE SOURIS IMMUNISEE, SUR PROTEINE A-SEPHAROSE (31)-
D.O.
pH
h8.1
t5.5
t4.5
I1.6
FRACTIONS: 0.65 mlFIGURE 9: PURIFICATION D,'UN ANTICORPS MONOCLONAL (igGi ) PAR ELUTION SUR
PROTEINE A-SEPHAROSE,
45
ajouté sur la colonne jusqu'à ce que la D.O. à 280 nm soit
égale à 0 (Figure 9). On procède alors à 11élution avec un
tampon citrate de plus bas pH. La même procédure est suivie
avec les autres tampons citrate à divers pH (4.5, 3.5 et
3.0). Le pH des fractions désirées doit être ajusté à 7.5
en ajoutant du K2HP04 1M (pH: 8.8). Ces fractions sont
réunies et dialysées, contre du tampon PBS-azide de sodium
(0.1%), toute la nuit à 4°C. La D.O. est alors prise et
11 anticorps est congelé à -80°C.
Il est à noter que le dernier tampon
citrate (pH: 3.0) nettoie la colonne et que cette dernière
peut alors être remisée en présence de PBS-azide, à 4°C.
Malheureusement, la protéine A ne résout
pas tous les problèmes car certains IgG ne se fixent pas à
cette dernière. Dans ce cas. il est nécessaire de purifier
11 anticorps par une autre méthode.
2) Le Séphacryl-300.
Lorsque la purification sur protéine A
ne peut s'appliquer, la filtration sur Séphacryl S-300 donne
d'excellents résultats. A un volume de 5 ml de liquide
ascitique, on ajoute, sous agitation, 5 ml d'une solution
saturée de sulfate d'ammonium (final = 50%). On laisse
reposer 30 minutes et on centrifuge à 6,000 X g pendant 10
minutes. Le surnageant est alors décanté et le précipité est
46
repris dans un volume minimal (2 ml) de tampon PBS-azide de
sodium.
La solution est appliquée sur une
colonne de 1.5 X 90 cm contenant 450 ml de Sephacryl S-300
équilibré dans du PBS-azide de sodium. Les fractions sont
collectées à raison de 4 ml par tube et la D.O. à 280 nm est
prise pour chacune d'elles. Les protéines éluées se
présentent dans l'ordre suivant: IgM, IgA, IgG et albumine.
Les fractions désirées sont réunies et concentrées à 1 mg./ml
par précipitation au sulfate d'ammonium (50%). Le concentré
est dialysé toute la nuit (4°C) contre du tampon PBS-azide
puis congelé à -80°C.
D- Couplage des anticorps sur la matrice.
1) Choix de la matrice.
Il existe plusieurs types de matrices,
de qualité variable, pouvant être utilisées dans une épreuve
radio-immunologique. Il importe de choisir une matrice dont
la capacité d'absorption des anticorps est la même d'un lot
à un autre, qui maximise la probabilité de contact entre
l'antigêne et la phase solide, et dont le coût est peu
élevé. Les plaques Immulon I (Dynatech, U.S.A.) répondent à
ces critères et sont, d'ailleurs, recommandées pour les
protéines de poids moléculaires supérieurs à 30,000.
47
2) Couplage des anticorps.
Les anticorps, à une concentration de
0.001 à 0.01 mg. par ml, se couplent très facilement à une
matrice de polystyrène lorsqu'ils sont dilues dans du tampon
carbonate-bicarbonate à pH de 9.6 (32). L1 absorption des
anticorps est maximale après 24 heures à 4°C (33).
Cependant, l'étude de 1'absorption de divers anticorps en
fonction du pH nous a démontré que certains anticorps sont
absorbés à un plus haut niveau à des pH inférieurs à 9.5
(Tableau IV). Les anticorps monoclonaux, purifiés (1
mg./ml), sont dilués mille fois dans du tampon PBS (pH: 7.0),
dans du tampon Tris (10mM, pH : 8.2) et dans du tampon
carbonate-bicarbonate (0.1M, pH: 9.6). Chaque solution est
distribuée à raison de 0.3 ml par puits, dans une plaque
Immulon qui est ensuite placée à 4°C pour la nuit. Le
lendemain, un RIA (phase solide) est effectué afin de trouver
le pH idéal d'absorption.
Une fois le pH déterminé, d'autres
plaques sont préparées puis saturées avec une solution de PBS-
BSA 0.5%-azide de sodium (0.1%) (1 nuit à 4°C). Elles
peuvent être conservées ainsi ou lyophillisées.
E- Marquage des anticorps à 1'Iode-125.
La chloramine T et la lactoperoxydase sont
les agents les plus utilisés pour ioder des protéines.
48
TABLEAU IV; ABSORPTION DES ANTICORPS A DIVERS pH.
anticorpsXpH 7,0
(p/n)8,2
(p/n)9,5(p/n)
1c9 296,3 534,7 551,1
3p3 534,7 473,2 509,6
]2o8 483,0 552,5 551,7
49
Cependant, 11Iodo-Gen (Pierce Chemical, U.S.A.) s'est révélé
supérieur à ces derniers (34).
Puisque 11Iodo-Gen est insoluble dans les
milieux aqueux, on se doit de le fixer à une matrice en
verre. Il est donc dissous dans du chloroforme de manière à
obtenir une concentration finale de 0.008 mg. par ml. La
solution est distribuée dans des tubes de verre 12X75 mm, à
raison de 0.05 ml par tube. A l'aide d'un jet d'azote, les
tubes sont séchés et conservés dans un dessicateur à -20°C.
L'Iodo-Gen étant d'une grande stabilité, les tubes peuvent
être conservés pour une période d'environ 6 mois.
Le marquage des protéines, par 1'Iodo-Gen,
est d'une très grande rapidité. Dans un tube (traité), on
dépose 0.01 ml de PBS, 0.01 mg. de protéines contenues dans
du PBS et 1 mCi d'iode-125 (Energie Atomique du Canada). La
solution est légèrement agitée puis laissée au repos pour 12
minutes.
La réaction est arrêtée par 1'addition de
0.5 ml de PBS. Le mélange est déposée sur une colonne de
Séphadex G-50 (Pharmacia, Suède) saturé avec une solution de
PBS-BSA 0.5%, et collecté à raison de 1 ml par tube.
La protéine marquée (premier pic) est
.conservée à 4°C dans un tube de polystyrène déposé dans une
gaine de plomb. La colonne est lavée avec du PBS-azide puis
remisée à 4°C.
50
F„ Détermination des composants de la trousse.
1) Procédures d'incubation.
Lors du dépistage de l'HBsAg, deux
protocoles d'incubation sont utilisés et cela, en fonction
des besoins du laboratoire.
Le premier protocole donne les résultats
rapidement. Les sérums sont incubés, à raison de 0.2
ml/puits, à 45°C pendant deux heures. Les puits sont ensuite
lavés cinq fois avec du PBS et l'anticorps révélateur est
ajouté à raison de 160,000 CPM/0.2 ml/puits. Les plaques
sont incubées pendant 1 heure à 45°C et sont ensuite lavées
10 fois avec du tampon PBS. Chaque puits est alors détaché
de la plaque et déposé dans un tube de polystyrène 12 X 75 mm
(Simport, Canada). Les tubes sont comptés dans le compteur
gamma.
Le second protocole diffère du premier
en un seul point: les sérums sont incubés une nuit à la
température de la pièce. Les autres manipulations demeurent
les mêmes que dans le premier protocole. Cette méthode est
habituellement plus sensible que la première.
2) Détermination de l'anticorps de la
matrice.
Afin de déterminer les anticorps à
rendement supérieur sur la phase solide, chacun d'eux est
51
évalué selon sa capacité à fixer 11 antigène, comparativement
à 11 anticorps polyclonal.
Tous les anticorps sélectionnés sont
fixés sur la matrice puis "testés" en présence de sérums
négatifs à l'HBsAg ainsi qu'en présence du témoin positif de
la trousse ALJSRIA II (Abbott Laboratories, U.S.A.) et cela,
selon la procédure d'incubation courte révélée avec
l'anticorps polyclonal marqué. Les rapports positifs/
négatifs (P/N) sont calculés et comparés à celui du
polyclonal.
3) Détermination de l'anticorps révélateur.
Pour la détermination de l'anticorps
révélateur, des plaques Immulon I sont préparées avec de
l'anticorps polyclonal. Elle sont incubées avec des témoins
négatifs et positifs selon la procédure courte. Tous les
anticorps sélectionnés sont marqués puis "testés" pour leur
capacité à révéler comparativement au polyclonal. La encore,
les rapports P/N sont calculés et comparés à celui du
polyclonal.
4) Pairage des anticorps.
Selon le même protocole d'incubation,
chaque anticorps, sélectionné comme composant matriciel, est
révélé avec chacun des anticorps sélectionnés comme
52
révélateur. Le pairage donnant le rapport P/N le plus élevé
sera celui utilisé dans la trousse.
5) Détermination de la sensibilité.
La sensibilité de la trousse est
déterminée face aux deux sous-types ("ad" et "ay"), dilués
dans une solution de saline-sérum de boeuf (50%) à des
concentrations variant entre 10 et 0.04 ng./ml, incubés selon
les deux protocoles déjà décrits.
6) Détermination de la stabilité.
La stabilité des composants est évaluée
sur une période d'un mois. L'anticorps, couplé à la matrice,
est conservé sous forme lyophillisée à 4°C. L1 anticorps
marqué est conservé dans les mêmes conditions mais sous forme
liquide.
RESULTATS
54
I - Purification de 1'HBsAg.
Des résultats similaires ont été obtenus
lors de la purification des deux sous-types "ad" et "ay".
Un volume de 350 ml de plasmas ("ad" et "ay") de titre 1/64
(C.E.P.) a été passé sur la colonne de chromatographie
d'affinité. Nous avons récupéré 17 ml (titre de 1024) que
nous avons, par la suite, tamisés sur Sépharose S-6B (Figure
10). Les tubes, dont la D.O. est supérieure à 0.6, ont été
réunis puis concentrés sur une membrane Amicon (XM 50). Nous
avons ainsi obtenu 20 ml d1HBsAg purifié de titre 1024 et de
densité optique de 7.0 (40 mg.). Le spectre d1élution sur
Sépharose S-6B (Figure 10) nous montre que 1'HBsAg, obtenu
après la chromatographie d1 affinité, ne contient pas ou peu
de contaminants.
II - Résultats des fusions cellulaires.
Huit fusions cellulaires ont été effectuées
(Tableau V) dont six utilisant des souris immunisées avec de
1'HBsAg de sous-type "ad" (A, B, C, D, E, F, H) et deux
utilisant des souris immunisées avec le sous-type "ay" (D et
G). Quatre fusions (A, C, D, E) ont été effectuées en accord
avec le protocole d1 immunisation déjà décrit. Les anticorps
obtenus lors de ces fusions étaient des IgG1 (80%) ou des
IgG2 (20%). Deux fusions (B, F) ont été effectuées après de
' £80 nm
Volume mort : 270 ml . y
i—i—ri—i—rTubes (8 ml )
figure 10;Tamisage de l'HBsAg sur sepharose s-Gb.
LnLn
56
TABLEAU V:RESULTATS DES FUSIONS CELLULAIRES
FUSION CLONES TESTES CLONES (+) CLONES SELECTIONNES
A 596 118 (19,8%) 45
B 476 57 (12,0%) 6
C 510 103 (20,2%) 30
D 578 104 (18,0%) 42
E 498 95 (19,0%) .36
F 533 63 (11,8%) 9
G 396 73 (18,4%) 29
H 522 98 (18,8%) 35
57
courtes immunisations (jours 1 et 2: injection i.v., jour 5:
fusion) où 100% des anticorps sécrétés étaient de classe IgM.
Pour les deux dernières fusions (G et H), nous avons utilisé
le protocole suivant:
- Jour 0:
- Jour 24:
- Jour 150
- Jour 1 51
- Jour 154
0.1 mg. + ACF : i.p,
0.1 mg. + AIF : i.p.
0.05 mg. : i.v.
0.05 mg. : i.v.
FUSION.
Par ce protocole, nous espérions obtenir des
clones sécrétant des anticorps de plus forte affinité que
ceux obtenus auparavant. Dans ce dernier cas, 84% des
anticorps sécrétés étaient des IgG1 et 26% des IgG2.
En moyenne, 17.2% des clones dépistés se
sont révélés positifs. La sélection, basée sur la capacité
de précipitation des surnageants, a mis en évidence 13 clones
réagissant avec le déterminant commun "A" et ayant un pouvoir
de précipitation élevé (Tableau VI). Les autres clones se
sont révélés comme ayant un pouvoir précipitant inférieur à
100,000, ou comme étant spécifiques à l'un des sous-types
(2.8%). Ces derniers ont été conservés comme outil possible
dans le sous-typage des sérums positifs à l'HBsAg.
Les 13 hybrides, ainsi sélectionnés, ont été
clonés, typés, puis injectés à des souris pour la production
de liquide ascitique. Les anticorps ont été purifiés, du
liquide ascitique, soit par élution de la protéine A-
Sépharose, soit par tamisage sur S-300 selon le type
d1 immunoglobuline sécrétée (Tableau VI). La quantité
58
d1 anticorps purifies, pour les différents clones, variait
entre 4 et 9 mg. par ml de liquide d1 ascite.
Un seul clone a cessé de sécréter après la
décongélation, le B-7B5. Meme en le redonant plusieurs
fois, il nous a été impossible de le sauver. Nous avons,
quand même, effectué quelques essais avec 11 anticorps obtenu
du liquide d'ascite.
III- Essais des divers anticorps.
A- Essais sur matrice.
Les essais de couplage à la phase solide des
anticorps monoclonaux comparativement à 11 anticorps
polyclonal, démontrent que six clones sécrètent des anticorps
dont 11 affinité est supérieure, une fois couplés à la
matrice, au polyclonal (Tableau VII). L1 utilisation de ces
six monoclonaux augmente le rapport positif/négatif (P/N) de
2 à 4 fois comparativement à celui de 11 anticorps polyclonal.
Les six clones sélectionnés, comme éléments possibles sur la
matrice, sont A-10F12, B-7B5, D-9H5, G-1C9, H-12D8 et H-7H12.
B- Essais de marquage.
Les essais de marquage des anticorps à
11iode-125 démontrent que cinq d'entre eux peuvent être
marqués de manière à augmenter la ratio P/N comparativement
au polyclonal (Tableau VIII). Les cinq clones sélectionnés
59
TABLEAU. VI:
CLONES CONSERVES POUR ESSAIS
Code Dilution limite( ad)
Dilution limite( av)
Type d'imunoglobuline
A-10F12 10s 10" IgGi
A-1ID3 10s 10" IgGi
B-8B7 105 10" IgM
B-7B5 10s 10s IgM
D-13C3 10s 106 IgGi
D-GC4 10s 10s IgG2a
D-9H5 10s 106 IgGi
G-3D2 106 106 IgGi
G-1F7 10s 10s IgGi
G-1C9 106 105 IgGX
G-7D9 10s 106 lGGi
H-12D8 10s 106 IGG^
H-7H12 10s 106 IgG2a
TABLEAU VII:
ESSAIS SUR MATRICE DES DIVERS ANTICORPS *
Code Positif Négatif P/N
(CPM) (CPM)
A-10F12 8420 50 168.4*
A-I1D3 5760 50 115.2
B-8B7 4970 50 99.4
B-7B5 10900 30 363.3*
D-13C3 6000 50 120.0
D-6C4 5600 40 140.0
D-9H5 9790 40 244,75*
G-3D2 6600 40 165.0
G-IF7 6650 90 73.9
G-1C9 9900 30 330.0*
G-7D9 6600 35 188.6
H-12D8 9600 30 320,0*
H-7H12 9050 30 301,6*
Polyclonal 4500 68 66.2
* Révélés avec des anticorps polyclonaux marqués,(ioo% = 180,000 cm)
61
sont D-13C3, D-9H5, G-3D2, G-1F7 et H-12D8.
La compilation de ces essais avec les
précédents permet de sélectionner neuf clones sécrétant des
anticorps pouvant être utilisés dans la trousse de dépistage
(Tableau IX).
C- Pairage des anticorps.
Les résultats de pairages des anticorps,
sélectionnés (Tableau IX), révèlent que deux pairages donnent
des résultats 3 à 4 fois supérieurs aux anticorps polyclonaux
(Tableau X). Le G-3D2 excelle, comme anticorps révélateur,
associé à G-1C9 ou à B-7B5, sur la matrice. Le clone B-7B5
ayant cessé de sécréter, 11 anticorps G-1C9 est sélectionné
comme composant "matriciel"" de la trousse. Donc, les
composants retenus pour la trousse sont:
- Anticorps de la matrice: G-1C9
- Anticorps révélateur: G-3D2.
IV - Essais de sensibilité de la trousse.
La sensibilité de la trousse est déterminée
pour les sous-types "ad" et "ay", comparativement à la
trousse AUSRIA et cela, selon les deux protocoles
d1 incubation précédemment décrits (A =2 heures, 45°C, 1
heure; B = 1 nuit à température ambiante, 1 heure à 45°C)
(Tableaux XI et XII).
Notre trousse (C.H.U.L.) a une sensibilité
62
de détection, pour les deux sous-types, de 0.06 ng. par ml;
indépendamment du protocole d1 incubation. Pour les deux
types d1 incubation, elle est supérieure à la trousse AUSRIA
II.
V - Essais cliniques.
En collaboration avec le Centre de
Transfusion Sanguine de la Croix-Rouge de Québec (C.T.S.), le
dépistage de l'HBsAg a été effectué, parallèlement à la
trousse AUSRIA II, sur 1114 échantillons (sérums et plasmas)
de donneurs de sang (Tableau: XIII).
Tous les échantillons trouvés positifs,
avec la trousse commerciale, l'ont été aussi avec notre
trousse. Par contre, notre trousse a donné, parmi ces
échantillons, un faux positif qui s'est avéré contenir des
anticorps dirigés contre les immunoglobulines de souris de
classe IgG. La réaction a pu être neutralisée par
11 addition, à 1'anticorps révélateur (G-3D2), de 1% (v/v) de
sérum de souris normale.
Des essais complémentaires sur les
échantillons fournis par le "College of American Pathologist"
(C.A.P.) démontrent que notre trousse est supérieure à celles
utilisées dans les laboratoires inscrits au programme du
C.A.P. (Tableau XIV).
63
TABLEAU VIII:
ESSAIS DE MARQUAGE A L'IODE-125 DES DIVERS ANTICORPS *
Code Positif Négatif P/N
(CFM) (CPM)
A-10F12 3000 50 60
A-1ID5 80 40 2.0
B-8B7 70 40 1.75
B-7B5 ** - - -
D-BC3 5000 48 104.2*
D-6C4 230 - 45 5.1
D-9H5 4000 55 72.7*
G-3D2 5200 52 100.0*
G-1F7 5450 48 107.3 •
G-1C9 3950 50 79.0
G-7D9 1000 50 20.0
H-12D8 4200 55 76.4*
H-7H12 2200 50 44.0
Polyclonaux 4300 64 67.2
* Sur la matrice : anticorps polyclonaux
** Clone perdu
54
TABLEAU IX:CLONES SELECTIONNES COMME COMPOSANTS POSSIBLES
DANS LA TROUSSE
SUR LA MATRICE COITE ANTICORPS REVELATEURS
A- 10F12 D- 9H5
B- 7B5 D- 13C3
D- 9H5 G- 3D2
G- 1C9 G- IF7
H- 12D8 H- 12D8
H- 7HI2
65
TABLEAU X:PAIRAGE DES DIVERS ANTICORPS,
1-125
MatriceD-9H5
(+/-)
D-13C3
(+/-)
G-3D2
(+/-)
G-1F7
(+/-)
H-12D8
(+/-)
A-10F12 7'978/30 8,975/35 8,995/3g 6,000/35 7,825/40
B-7B5 9,850/60 M, 400/65 17,080/55 10,600/50 12,4-75/53
D-9H5 6,550/44 9'500/40 10,720/35 9,985/35
G-1C9 7,300/30 9,915/33•
13,600/26 7,600/40 10,120/33
H-12D8 7,125/35 10,300/30 ll,560/2g 8,752/30 9,800/3S
H-7H12 7,255/37 7,464/40 9,880/41 8,975/35 9,565/35
66
TABLEAU XI :
DETECTION DE HBs As PURIFIE (ad)
CONCENTRATION(NG/ML)
PROCEDURE A (CPM/NCX)
PROCEDURE B(CPM/NCX)
10,0 353,55,0 176,93,75 124,82,50 88,41,88 64,71,25 48,50,94 32,30,63 23,1--- A0,47 16,30,32 ° 10,30,24 9,30,16 7,50,12 5.70,08 4,30,06 3,00,04
CO
r—1
353.6182.4132.4 94,960,6 46,140,724.619.614,48.7
4.23.73.3 3,01.8
A U S R I A II
C H U L
TABLEAU XII:
DETECTION DE MBs Ag PURIFIE (ay)
CONCENTRATION PROCEDURE A PROCEDURE B(NG/ML) (CPM/NCX) (CPM/NCX)
10.0 289,2 374,35.0 125.9 142,73,75 90,4 120,72,50 62,6 77.11,88 47,9 59.11,25 29,6 31,20,94 25,3 29,70,63 14,0 13,80,47 12,0 12,1-——B0,32 7.5 8,20.24 6.0 5.90,16 3,9 4,80,12 3,7 2,90,08 3.1 2,60,06 2.2 2.10,04 1.8 1.9
—— AUSRI A II
68
TABLEAU XII:
DEPISTAGE DE L'HBs Ag SUR 1114 DONNEURS DE SANG,(C.T.S., QUEBEC)
AUS RIA II MONOCLONAL C.H.U.L.
POSITIFS 4 (1 FAUX POSITIF)*
NEGATIFS 1111 1110
* NEUTRALISE PAR DU SERUM DE SOURIS NORMAL
69
TABLEAU XIV:
COMPARAISON DE LA PERFORMANCE DE LA TROUSSE MONOCLONALE
AUX AUTRES TROUSSES COMMERCIALES SUR LE PANEL DyECHANTILLONS
FOURNIS PAR LE " C.A.P. *"
ECHAMTILLON RATIO (P/N) C.H.U.L
MOYENNE DES RATIOS (P/N) ± D.S,(TROUSSES COMMERCIALES)
W-31 573.0 141.62 ± 54.7
W-32 81.0 29,53 ± 11.1
W-34 350.0 77,46 ± 31,2
W-35 80.5 29.86 ± 11.3
W-36 522.9 128,34 ± 48,1
W-37 #5.3 124,97 ± 46.1
W-40 330.6 76,19 ± 31.1
* COLLEGE OF AMERICAN PATHOLOGISTS
70
VI - Essais de stabilité.
L'anticorps marqué (G-3D2) est stable pour
une période maximale d'un mois. Après ce temps, une baisse
des comptes et une augmentation des valeurs négatives sont
enregistrées.
L'anticorps couplé à la matrice (G-1C9) est
stable pour une période supérieure à l'anticorps marqué (non-
déterminée ) .
DISCUSSION
I - Résultats des fusions
Nous avons obtenu un nombre élevé
d'hybridomes sécrétant des anticorps anti-HBsAg, décelables
par RIA en phase liquide (Tableau V). Lors du dépistage,
nous n1 avons retenu que ceux dont le surnageant précipitait
au moins 50% de 1'antigene marqué. Avec un seuil de
positivité plus bas, la fréquence des hybridomes sécréteurs
atteint facilement 60%. Cette haute fréquence de positivité
ne peut être due à la sécrétion des splénocytes non fusionnés
dans le milieu puisque ce dernier a été changé avant le
dépistage. Une telle efficacité a déjà été décrite lors de
11 utilisation de divers autres virus (35).
Les immunisations à long terme sont
souhaitables lorsque l'on désire des anticorps de haute
affinité Les résultats, obtenus avec les fusions G et H
(Tableau VI), montrent qu'un plus grand nombre de clones, à
pouvoir de précipitation élevé, ont été obtenus lors de ces
fusions comparativement à celles utilisant un protocole
d1 immunisation courte. Il ne faut cependant pas rejeter les
immunisations dont le but est d'obtenir des anticorps de type
IgM. D'après les résultats que nous avons obtenus, il peut
être très intéressant d1 obtenir de tels anticorps. Nous
avons ainsi trouvé un clone (B-7B5) sécrétant un anticorps de
très haute affinité. Cependant, le clone n1 était pas stable
et a cessé de sécréter après la décongélation. Pour obtenir
73
d'autres clone du même type, il serait nécessaire
d'effectuer un nombre assez élevé de fusions; le nombre de
clones sécréteurs étant beaucoup plus bas que lors des autres
fusions (Tableau V).
L'utilisation de l'anticorps B-7B5 (IgM) sur
la matrice donne des résultats supérieurs à tous les autres
anticorps et cela, indépendamment de l'anticorps employé pour
révéler (Tableau X). Cependant, la valeur des "négatifs" est
deux fois plus élevée que celle obtenue lors de l'utilisation
sur la matrice des autres anticorps. Le ratio
positif/négatif (P/N) est alors inférieur à celui de la paire
G-1C9/G-3D2. L'intérêt porté au clone B-7B5 est dû au type
d'anticorps sécrétés par ce dernier. En effet, la
configuration multibranchiale de 1'IgM permet, dans certains
cas, de développer une trousse de dépistage où les sérums et
l'anticorps révélateur sont incubés simultanément.
L'utilisation d'anticorps de classes différentes permet aussi
d'éviter les faux positifs. Une telle trousse, à dépistage
très rapide, est présentement sur le marché (Nuclear Medical
Laboratories, U.S.A.).
II - La trousse.
Notre trousse a une sensibilité de 0.06
ng./ml indépendamment des procédures d'incubation et du sous-
type d'HBsAg (Tableaux XI et XII). Elle est supérieure à la
trousse AUSRIA II ainsi qu'à la trousse monoclonale de la
compagnie Nuclear Medical Laboratories. En effet, cette
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dernière a une sensibilité maximale de 0.08 ng./ml ("ad" et
"ay") qui n1 est atteinte qu1 après une incubation d'une nuit
(dépliant commercial).
Cependant, 11 utilisation double des
anticorps monoclonaux pose un problème. De faux positifs
peuvent être retrouvés lorsque les patients possèdent des
anticorps dirigés contre les immunoglobulines de souris. Il
est donc nécessaire d'inclure, dans 11 anticorps révélateur,
des immunoglobulines de souris à concentration minimale de
1 %.
75
CONCLUSION
Des anticorps monoclonaux, issus d1 hybrides,
ont été obtenus après immunisation de souris BALB/c avec de
l'HBsAg purifié par chromatographie d'affinité. Parmi les
clones obtenus, deux se sont distingués (G-1C9 et G-3D2) par
leur affinité et ont été choisis comme composants de la
trousse de dépistage. Cette dernière a une sensibilité,
indépendamment du sous-type d'HBsAg, de 0.6 ng./ml. Les
essais sur les échantillons du C.A.P. démontrent la
supériorité de cette dernière aux autres trousses utilisées
dans les laboratoires inscrits au programme (C.A.P.). Il est
cependant nécessaire d'ajouter, à l'anticorps révélateur, des
immuglobulines de souris normales (5%) afin d'éviter des faux
positifs dus à la présence d'anticorps anti-immunoglobulines
chez certains patients.
Tous les clones obtenus ont été conservés
comme outil possible pour l'étude de la structure virale.
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