Cours n° 2: Etude de la prolifération/différenciation (2)l2bichat2018-2019.weebly.com/uploads/1/1/2/5/112587633/p2_roné… · des gènes (→TTF1, TTF2, et les séquences de

UE1 Biologie Cellulaire Pr CHOMIENNE Vendredi 16 novembre 2018 de 10h30 à 12h30 Ronéotypeurs : Marie Fontaine / Julien Eliat Ronéoficheurs : Marie Fontaine / Julien Eliat

Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !1 12

Cours n° 2: Etude de la prolifération/différenciation (2)

Le cours n’a pas changé par rapport à l’année dernière. Il prend comme exemple la cellule thyroïdienne pour mettre en pratique les acteurs intervenant dans la différenciation d’une cellule. L’essentiel est de comprendre le raisonnement du cours afin de pouvoir le mettre en pratique sur un autre exemple de cellule le jour du partiel.

Plan du cours :

I. Introduction

II. Étude de l’action de l’acide rétinoïque sur les cellules thyroïdiennes

A. Confirmation de l’action B. Le mode d’action de l’AR C. Fonctionnement de l’effet différenciant de l’AR sur les cellules cancéreuses thyroïdiennes D. Conclusion

III. Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde

A. Intérêt des rétinoïdes dans les Cancers Thyroïdiens Différenciés (CTD) B. Causes du défaut d’expression de RARβ dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR C. Conclusion


I. Introduction

II. Etude de l’action de l’acide rétinoïque sur les cellules thyroïdiennes

Etapes de la synthèse des

hormones thyroïdiennes

❏ La glande thyroïde, et donc les cellules thyroïdiennes, ont pour mission essentielle de fabriquer, synthétiser les hormones thyroïdiennes (T3 et T4), avant de les sécréter dans la circulation sanguine.

❏ Pour pouvoir synthétiser ces hormones, il va y avoir un certain nombre d’acteurs, situés dans le noyau : ce sont des protéines spécifiques de la cellule thyroïdienne (synthétisées grâce à l’expression de différents gènes) → Thyroglobuline, TPO et NIS.

❏ Présence de protéines transcriptionnelles en 5’ (dans la région promotrice), qui vont autoriser la transcription des gènes (→TTF1, TTF2, et les séquences de récepteurs de l’acide rétinoïque).

❏ La cellule thyroïdienne a d’abord besoin d’Iode. Il se trouve dans la circulation sanguine (apport exogène par l’alimentation), est capté par un transporteur, qui fait également passer le sodium = Symporteur NIS (N= Sodium ; I= Iode ; S= Symporteur).

❏ Puis l’iode se fixe sur la thyroglobuline (TG) ❏ Plusieurs étapes dont des oxydations deiodisations ❏ Dernière étape catalysée par la 5’-deiodase ⇒ on arrive à la fabrication des hormones

thyroïdiennes.

⇒

❏ Pour étudier les facteurs de la différenciation, on utilise des cellules cancéreuses (cellules malignes). Elles possèdent des parties altérées mais aussi des parties normales. On remarque notamment un blocage de la différenciation, une augmentation de la prolifération, ainsi que de la survie cellulaire.

❏ L’utilisation d’agents différenciants permet aux cellules malignes de reprendre leur différenciation. ❏ On peut donc en déduire quels sont les acteurs de la différenciation par l’observation de l’arrêt de la

prolifération et de la mort cellulaire.


A. Confirmation de l’action

❏ La plupart des cancers thyroïdiens sont dus à des problèmes de captation d’iode. ⇒ Défaut d’expression des gènes → Blocage de la différenciation. ❏ Cela s’explique par le fait que le transporteur NIS ne soit pas exprimé.

!

❏ On cherche ensuite à mettre en évidence le rôle de l’acide rétinoïque (AR), dérivé de la vitamine A, comme agent différenciant. ❏ Mesure de la différenciation de la cellule par la mesure de l’augmentation de NIS, pour restaurer une des fonctions de la cellule thyroïdienne → capter l’iode. ⇒ Proposition de thérapeutiques en augmentant le NIS chez des patients ne pouvant capter l’iode.

!


❏ Etude par RT-PCR quantitative ou l’on mesure le taux d’expression de l’ARNm du gène NIS. ⇒ Défaut d’expression du gène qui code pour le transporteur d’iode NIS dans les cellules thyroïdiennes tumorales.

❏ On traite des cellules cancéreuses thyroïdiennes avec de l’AR → on observe l’expression des marqueurs de différenciation: les ARNm de la 5’-deiodase et du NIS, ainsi que la sécrétion de la TG par la cellule.

❏ Après observations, on en déduit que l’AR augmente les paramètres d e l a c e l l u l e t h y r o ï d i e n n e différenciée.

B. Le mode d’action de l’AR

❏ Lors d’études chez des patients atteints d’un cancer thyroïdien, on remarque l’absence de RAR β. ❏ On en déduit que les RAR β ont un rôle potentiel dans les cancers : en l’absence d’une quantité suffisante de RAR β, pouvant se fixer sur la région promotrice du NIS ou de la 5’deiodase, ces gènes ne sont pas exprimés.

❏ L’acide rétinoïque (AR) agit par l’intermédiaire de protéines transcriptionnelles: les récepteurs de l’AR (famille des récepteurs nucléaires aux hormones).

❏ Ces récepteurs sont ligands dépendants, c’est-à-dire qu’ils sont spécifiques à une séquence d’ADN située dans la région promotrice des gènes NIS et 5DI : RARE

!❏ Plusieurs types de récepteurs de l’acide rétinoïque: → 3 RXR : α, β, γ → 3 RAR : α, β, γ ⇒ S’assemblent et agissent sous forme d’hétérodimères. ❏ On aboutit à la formation de différentes combinaisons de récepteurs de l’AR → importance dans la différenciation des tissus → spécificité de l’action de l’acide rétinoïque dans les tissus

❏ On se demande alors quels récepteurs sont spécifiques de la cellule thyroïdienne pour contrôler les 2 gènes de la cellule thyroïdienne qui sont le NIS et la 5’DI?

❏ On étudie alors l’expression des différents récepteurs dans la cellule thyroïdienne normale.

!

!


❏ On étudie alors l’expression des 3 gènes RXR α, β, γ et des 3 gènes RAR α, β, γ par quantification de leurs ARNm après traitement des cellules thyroïdiennes par l’AR.

❏ La différenciation induite par l’AR est liée à une augmentation de l’expression de RAR β. ❏ L’expression des gènes RAR est induite par les récepteurs à l’AR eux-mêmes. Ainsi l’ajout d’une quantité forte d’AR n’agit pas seulement sur RAR β mais aussi sur les autres gènes. → On parle d’autorégulation.

C. Fonctionnement de l’effet

différenciant de l’AR sur les

cellules cancéreuses

thyroïdiennes

❏ Marquage des cellules avec un anticorps anti-RAR β. ❏ On confirme l’augmentation de l’expression de l’ARNm de R A R β d a n s l e s c e l l u l e s thyroïdiennes traitées par l’AR mais aussi de protéines RAR β.

D. Conclusion

❏ RAR β est exprimé dans les cellules thyroïdiennes normales. → RAR β contrôle l’expression des gènes de la cellule thyroïdienne (NIS, 5 DI) par l’intermédiaire des séquences RAREs dans la région promotrice. ❏ RAR β n’est pas exprimé dans les cellules de certains cancers de la thyroïde. ❏ L’expression de RAR β est induite par l’acide rétinoïque (AR) (ARNm et protéine). → AR est un agent de différenciation de la cellule thyroïdienne normale et maligne.

�


III. Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde

A. Intérêt des rétinoïdes dans les Cancers Thyroïdiens Différenciés (CTD)

Cancers Thyroïdiens Différenciés

(CTD)

❏ Le cancer de la thyroïde provoque des métastases, notamment des métastases osseuses. ❏ Au lieu de tuer les cellules du cancer de la thyroïde par de la chimiothérapie, de la

radiothérapie, on peut proposer comme alternative thérapeutique la différenciation de la cellule cancéreuse.

❏ Ces cellules métastatiques peuvent capter l’iode, comme les cellules thyroïdiennes normales. On utilise l’Iode radioactif (Iode-131) pour leur visualisation en imagerie nucléaire et pour compléter le traitement.

❏ Un certain nombre de patients ne peuvent pas capter l’iode et donc ne peuvent pas être traités par l’iode radioactif.

❏ Les scientifiques ont trouvé un autre traitement par Acide rétinoïque (AR) pour les CTD, ce qui a permis :

• Expression du gène NIS • Différenciation des cellules tumorales en cellules thyroïdiennes fonctionnelles

captant de nouveau l’iode • Reprise du traitement par l’Iode-131 et sa visualisation en imagerie.

Scintigraphie avant et après le traitement par

Acide rétinoïque

❏ Nous sommes dans le cas d’un modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde : identification du rôle des modifications épigénétiques. Si deux cellules se différencient, c’est qu’elles n’ont pas le même génome. Donc, la différenciation étant automatiquement issu d’un mécanisme transcriptionnel, les modifications épigénétiques y ont un rôle important.

❏ Pour mettre en avant cette résistance, nous allons étudier 2 lignées de carcinomes folliculaires de la thyroïde, isolées à partir d’un même patient :

• FTC133 : issue de la tumeur primitive → lignée sensible • FTC238 : issue de métastases pulmonaires → lignée résistante

� On observe davantage les métastases après traitement. Cependant, ce traitement par AR ne fonctionne que chez 30% des patients.

Question : Quelle est la cause de l’absence de différenciation de la cellule thyroïdienne chez les 70% restants ?

4

ChomienneBiolCell 2017

Confirmation de l’induction de RARE dans les cellules thyroïdiennes traitées par l’acide rétinoïque

Non traitées Traitées par l’AR

Marquage des cellules avecun anti-corps anti-RARE

RXR RAR RARmRNA

Protéine RAR

Conclusion


RARE est exprimé dans les cellules thyroïdiennes RARE contrôle l’expression des gènes de la cellule thyroïdienne(NIS, 5 DI) par l’intermédiaire de RAREs

L’expression de RARE est induite par l’acide rétinoïque (AR)(ARNm et protéine)

AR est un agent de différenciation de la cellule thyroïdienne normale et maligne

RARE n’est pas exprimé dans les cellulesde certains cancers de la thyroïde

Intérêt des rétinoïdes dans les CTD(Cancers Thyroidiens Différenciés)

Différenciation des cellules tumorales en thyrocytes fonctionnels captant de nouveau l’iode o Reprise du traitement par l’iode‐131

CTD métastatiques présentant une fixation de l’iode-131

insuffisante et traités par l’AR 13-cis

Induction de la fixation de l’iode au niveau des

métastases chez 30% des patients

Avant AR Après AR

Folliculaire T3 N2 M1


Rôle des modifications épigénétiques


Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde à l’action différenciatrice de l’AR


Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes

Sensibilité à l’ATRA (=AR)

Expression de RARβ

❏ Les deux lignées ont une expression faible de RARβ par rapport aux autres récepteurs.

❏ Mais en augmentant l’échelle, on remarque que l’expression de RARβ est nettement plus importante dans la lignée FTC133 que dans la lignée FTC238.

❏ La sensibilité de l’ATRA est corrélée à l’expression de RARβ.

!

! ❏ Ce Westernblot montre qu’il n’y a pas d’induction de l’expression

de RARβ en présence ou non d’ATRA dans la lignée FTC238.

5


Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :

FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires

Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M

0

10

20

30

40

50

60

NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8

mR

NA

exp

ress

ion

(fol

d in

crea

se)

FTC133FTC238

Sensibilité différente à l’ATRA

SENSIBLERESISTANTE



RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Rel

ativ

e m

RN

A e

xpre

ssio

n FTC133FTC238

++ +++ ++ + + ‐Tissu sain

Perte d’expression de RARE

Expression relative des RAR et RXR par qPCR



Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA

La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de

l’expression du RARE

mRN

A expressio

n (fo

ld increase)



RARE

Gènes ciblesNIS - 5’DI

RXR RARE

ARCellules normales

Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI

Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI

RARE

ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode

Cellules cancéreuses: pas de RARE

5





0

10

20

30

40

50

60


mR

NA

exp

ress

ion

(fol

d in

crea

se)

FTC133FTC238


SENSIBLERESISTANTE




0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Rel

ativ

e m

RN

A e

xpre

ssio

n FTC133FTC238

++ +++ ++ + + ‐Tissu sain








mRN

A expressio

n (fo

ld increase)



RARE


RXR RARE

ARCellules normales



RARE



❏ Ces 2 lignées ont des sensibilités différentes à l’ATRA.

! Dans les cellules de la lignée FTC133 (lignée de la tumeur primitive), on observe une induction de l’expression des gènes de différenciation thyroïdienne, alors que dans les cellules de la lignée FTC238 (lignée des métastases pulmonaires), il n’y a pas d’induction de ces gènes.

5





0

10

20

30

40

50

60


mR

NA

exp

ress

ion

(fol

d in

crea

se)

FTC133FTC238


SENSIBLERESISTANTE




0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Rel

ativ

e m

RN

A e

xpre

ssio

n FTC133FTC238

++ +++ ++ + + ‐Tissu sain








mRN

A expressio

n (fo

ld increase)



RARE


RXR RARE

ARCellules normales



RARE


Cellules cancéreuses: pas de RARERonéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !8 12

B. Hypothèses des causes du défaut d’expression de RARβ dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR

☞ Rappels

Cellules normales

Cellules cancéreuses

Sensibles à l’AR ❏ Induction de RARβ ❏ Induction de NIS et 5’DI

Résistantes à l’AR ❏ Pas d’induction de RARβ ❏ Pas de NIS et 5’DI

! ❏ Pas d’expression des gènes cibles (NIS, 5’DI) ❏ Pas de captation de l’iode.

5





0

10

20

30

40

50

60


mR

NA

exp

ress

ion

(fol

d in

crea

se)

FTC133FTC238


SENSIBLERESISTANTE




0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Rel

ativ

e m

RN

A e

xpre

ssio

n FTC133FTC238

++ +++ ++ + + ‐Tissu sain








mRN

A expressio

n (fo

ld increase)



RARE


RXR RARE

ARCellules normales



RARE


Cellules cancéreuses: pas de RARE�

❏ Expression des gènes de la différenciation thyroïdienne.

5





0

10

20

30

40

50

60


mR

NA

exp

ress

ion

(fol

d in

crea

se)

FTC133FTC238


SENSIBLERESISTANTE




0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Rel

ativ

e m

RN

A e

xpre

ssio

n FTC133FTC238

++ +++ ++ + + ‐Tissu sain








mRN

A expressio

n (fo

ld increase)



RARE


RXR RARE

ARCellules normales



RARE



① Anomalies des protéines

transcriptionnelles RAR ou RXR endogènes ?

Etude de la voie de transactivation de l’AR dans les

cellules résistantes FTC238

Conclusion❏ Le complexe transcriptionnel (RXR-RAR) est fonctionnel dans

les cellules FTC238. ❏ Pas d’anomalie de RAR ou RXR endogène.

!

6


Causes du défaut d’expression de RARE�dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR

RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR

Anomalies des protéines transcriptionnellesRAR ou RXR endogènes?

Anomalies épigénétiques:Anomalies du promoteur de RARE?

Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"

RARE


Etude de la voie de transactivation de l’ARdans les cellules résistantes FTC238

¾ L’AR est capable de transactiver les séquences RARE d’un gène rapporteur

¾ Donc le complexe transcriptionnel (RAR, RXR etc…) est fonctionnel dans

les cellules FTC238

Capacité de transactivation mesurées 16 h après transfection par le

RAREbéta-Luc et traitement par l’AR

Fold induction

0

100

200

300

400

Control ATRA

RXR RAR

RARE luc

Mesure de la luciférase


Transactivation efficace avec un gène rapporteur RARE

RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR

Pas d’ anomalies de RAR ou RXR endogènesAnomalies du promoteur de RARE?Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"

RARE

Méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs

Modification épigénétique

9Modulation de la structure de la chromatine9Méthylation de l’ADN9Déacétylation des histones9 Régulation de la transcription des gènes

DNMTDNMT

MBDMBDMeCPMeCP

HDACHDAC HDACHDAC

FTGFTG HATHAT

HMT

Transcription OFF

Cellules cancéreusesHyperméthylation des ilôts CpG de gènes

spécifiques

Répression transcriptionelle des gènes suppresseurs de tumeurs


❏ On se sert d’un gène rapporteur pour étudier la fonction transcriptionnelle endogène.

❏ Ce gène rapporteur (fabriqué de façon synthétique) code pour une enzyme : la luciférase, qui va émettre de la lumière.

❏ On introduit le gène dans les cellules FTC238 et on la traite avec de l’AR.

! ! ❏ On observe une émission de lumière ainsi que l’expression de la

luciférase. ❏ Les récepteurs se sont fixés sur la séquence RARE et ont induit

l’expression de luciférase.

6



RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR




RARE





les cellules FTC238



Fold induction

0

100

200

300

400

Control ATRA

RXR RAR

RARE luc




RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR


RARE




DNMTDNMT

MBDMBDMeCPMeCP

HDACHDAC HDACHDAC

FTGFTG HATHAT

HMT

Transcription OFF


spécifiques



6



RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR




RARE





les cellules FTC238



Fold induction

0

100

200

300

400

Control ATRA

RXR RAR

RARE luc




RARE

mRNARARE

RXR RAR

AR


RARE




DNMTDNMT

MBDMBDMeCPMeCP

HDACHDAC HDACHDAC

FTGFTG HATHAT

HMT

Transcription OFF


spécifiques




① ③

②

② Anomalies épigénétiques: Anomalies du promoteur de

RARβ ?


Conclusion ❏ La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARβ2.

Rappel des différents types de modifications épigénétiques : • Modulation de la structure de la chromatine • Méthylation de l’ADN • Déacétylation des histones • Régulation de la transcription des gènes

❏ La plupart des cellules cancéreuses sont hyperméthylées au niveau des ilots CpG des gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui induit la répression de leur transcription.

❏ Etudions la méthylation de l’ADN codant pour RARβ grâce à la réaction d’amplification génique (PCR) :

1. Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium → conversion des cytosines non méthylées en uracile

2. PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées et non méthylées

!

!

7

Etude de la méthylation de l'ADN du promoteur RARβ2

Methylation specific PCR

1 ‐Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium o conversion des cytosines non méthylées en

uracile

2 ‐ PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées

et non méthylées

La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une

hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARE2

0

1

2

3

4

ATRA AZA ATRA + AZA

FTC133FTC238

Fold

incr

ease

Effet de la 5‐aza‐deoxycytidine (inhibiteur de DNMT) sur l'expression de RARE2Primers

UnmethylatedPrimers

Methylated


Chromatine Immunoprécipitation assay: permet de déterminer les complexes protéiques (complexes protéiques,

histones, protéines transcriptionnelles) liées sur le promoteur (chromatine)

Blocage des protéinesFixées sur la chromatine (ADN)

Casser (couper) la chromatine

Fixation d’anticorps contrela protéine fixée sur la chromatineImmunoprécipitation, séparationProtéine-ADN, purification ADN

Amplification des séquencesADN sur lesquelles les protéinessont fixées par PCR



Acétylation des histones H3 et H4RAR RXR Désacétylation

AR

RAR RXR

RAREE

REPRESSION ACTIVATION

RAREE

• Etudes des histones acétylés liés au promoteur: •Chromatine Immunoprécipitation: ChIP

Chromatine avec protéines fixéesImmunoprécipitation avec anti-corps antiprotéines (anti-H3 ou H4 acétylés)Puis amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques (RAREE)

Absence d’acétylation des histones

012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

Fold

incr

ease

Time

FTC133FTC238

Taux faibled’ acétylation histonesdans FTC238

Intérêt d’une association ATRA et thérapie épigénétique

DNMTDNMT

RARRARRXRRXR

HDACHDAC HDACHDAC

Transcription OFF

Inhibiteur d’HDACTrichostatine A

RARRARRXRRXR

Transcription ON

ATRA+ iHDCA

ATRATSAATRA + TSA

012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

FTC238

Fold

incr

ease

Time

Effet de la trichostatine A, un inhibiteur des HDAC, sur l’acétylation des histones

Ac Ac Ac


7




uracile


et non méthylées



0

1

2

3

4

ATRA AZA ATRA + AZA

FTC133FTC238

Fold

incr

ease


UnmethylatedPrimers

Methylated











AR

RAR RXR

RAREE


RAREE




012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

Fold

incr

ease

Time

FTC133FTC238



DNMTDNMT

RARRARRXRRXR

HDACHDAC HDACHDAC

Transcription OFF


RARRARRXRRXR

Transcription ON

ATRA+ iHDCA

ATRATSAATRA + TSA

012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

FTC238

Fold

incr

ease

Time


Ac Ac Ac



❏ Dans cette expérience, on observe qu’un inhibiteur de DNMT (AZA) n’induit pas de changement d’expression de RARβ dans les deux lignées.

❏ On peut observer une absence de méthylation des séquences promotrices des gènes codants pour RARβ que ce soit dans les c e l l u l e s F T C 2 3 8 o u FTC133.

③ Anomalies de synthèse ou durée

de vie du messager ou de la protéine RARβ ?

Étude des complexes

protéiques liés sur le promoteur

❏ Etude qui permet de voir si les histones sont sous une forme hypoacétylée.

❏ On ne regarde plus l’ADN mais ses protéines fixées. On va donc effectuer une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour identifier les complexes protéiques liés sur les promoteurs :

! Blocage des protéines fixées sur la chromatine (ADN)

↓ Casser (couper) la chromatine

↓ Fixation d’anticorps contre la protéine fixée sur la chromatine,

immunoprécipitation, séparation protéine-ADN, purification ADN ↓

Amplification des séquences ADN sur lesquelles les protéines sont fixées par PCR

Rappel : L’immunoprécipitation est la technique qui permet la précipitation d’un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement une protéine particulière.

7




uracile


et non méthylées



0

1

2

3

4

ATRA AZA ATRA + AZA

FTC133FTC238

Fold

incr

ease


UnmethylatedPrimers

Methylated











AR

RAR RXR

RAREE


RAREE




012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

Fold

incr

ease

Time

FTC133FTC238



DNMTDNMT

RARRARRXRRXR

HDACHDAC HDACHDAC

Transcription OFF


RARRARRXRRXR

Transcription ON

ATRA+ iHDCA

ATRATSAATRA + TSA

012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

FTC238

Fold

incr

ease

Time


Ac Ac Ac


❏ On observe les protéines histones acétylées dans la région promotrice de RARβ, permettant la transcription du gène.

❏ On utilise des anticorps spécifiques (anti-H3 acétylé ou anti-H4 acétylé) et une amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques.

❏ On observe un taux faible d’acétylation des histones dans les cellules FTC238.

!

7




uracile


et non méthylées



0

1

2

3

4

ATRA AZA ATRA + AZA

FTC133FTC238

Fold

incr

ease


UnmethylatedPrimers

Methylated











AR

RAR RXR

RAREE


RAREE




012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

Fold

incr

ease

Time

FTC133FTC238



DNMTDNMT

RARRARRXRRXR

HDACHDAC HDACHDAC

Transcription OFF


RARRARRXRRXR

Transcription ON

ATRA+ iHDCA

ATRATSAATRA + TSA

012345678

6 h 16 h 6 h 16 h

Ac-H3 Ac-H4

FTC238

Fold

incr

ease

Time


Ac Ac Ac



Dédicace à la team BU P12 : Mailys mais aussi Aude qui nous a malheureusement quitté pour le club des plantes mais qu’on aime quand même. A Clara D, Clara E, Baya, Joséphine, Auréliane et Tom qui égayent au quotidien nos journées BU. A nos D1 adorés : Nico (fantômas dans nos coeurs), Margot et Bibi de la fanf. Et bien sûr Louise, à qui on donne tout le courage et la force pour majorer le concours cette année (t’as pas le choix t’as les meilleurs coaches du monde).

③ Anomalies de synthèse ou durée

de vie du messager ou de la protéine RARβ ?

(suite)

Étude des complexes

protéiques liés sur le promoteur

(suite)

Conclusion❏ L’association de l’ATRA à un inhibiteur d’HDAC permet de

restaurer la sensibilité à l’ATRA et d’induire une différenciation des cellules tumorales.

C. Conclusion

Les cellules de cancer de la thyroïde résistantes à l’AR : ❏ Pas d’expression des gènes cibles de RARb dans la cellule thyroïdienne (NIS, 5 DI, TG) ❏ Pas d’induction du gène RARb par l’AR dans la cellule résistante ❏ Promoteur de RARb non permissif à la transcription (pas de recrutement des histones

acétylées) dans la cellule résistante ❏ Association d’un inhibiteur d’HDAC à l’AR restaure l’expression de RARb et par

conséquent des gènes cibles NIS et 5 DI

❏ Des drogues sont utilisées pour permettre l’acétylation des histones comme la Trichostatine A, qui est un inhibiteur des HDAC.

❏ On observe une augmentation de l’acétylation des histones des cellules résistantes.

! ❏ On induit la transcription du gène RARβ en présence de

Trichostatine A et d’ATRA, dans les cellules de la lignée FTC238.

!

8

Intérêt de l’association de l’ATRA et d’un inhibiteur d’HDAC

0

5

10

15

20

25

2 h 6 h 12 h 24 h

ATRATSAATRA + TSA

Fold increase

0

200

400

600

800

1000

2 h 6 h 12 h 24 h

ATRATSAATRA + TSA

Expression du RARE Expression du NIS

L’association de l’ATRA à un inhibiteur d’HDAC permet de restaurer la sensibilité à l’ATRA et d’induire une différenciation des cellules tumorales

FTC238 FTC238


Conclusion• Les cellules de cancer de la thyroïde résistantes à l’AR- pas d’expression des gènes cibles de RARb dans la cellule

thyroïdienne (NIS, 5 DI, TG)- pas d’induction du gène RARb par l’AR dans la cellule

résistante- Promoteur de RARb non permissif à la transcription (pas

de recrutement des histones acétylés) dans la cellule résistante

- Association d’un inhibiteur d’HDAC à l’AR restaure l’expression de RARb et par conséquent des gènes cibles NIS et 5 DI



Documents

Cours n° 2: Etude de la prolifération/différenciation (2)l2bichat2018-2019.weebly.com/uploads/1/1/2/5/112587633/p2_roné… · des gènes (→TTF1, TTF2, et les séquences de